Calorimetria Diferencial de Barrido
Esta tcnica permite la caracterizacin termodinmica de los
cambios conformacionales inducidos por cambios de temperatura en
protenas (Privalov y Khechinashvili, 1974; Privalov y Potekhin 1986),
cidos nucleicos (Privalov y Filimonov, 1978) y biomembranas o
membranas artificiales (Mabrey y Sturtevant, 1978; Bach y Chapman,
1980).
La calorimetra diferencial de barrido se usa para obtener los
parmetros termodinmicos asociados a las transiciones de
macromolculas inducidas por calor.
En un experimento de calorimetra diferencial de barrido se registra
de forma continua la capacidad calorfica aparente de una disolucin
de protena o de cualquier macromolcula en funcin de la
temperatura, obtenindose lo que comnmente se denomina
termograma.
La informacin fundamental que proporciona la DSC es la capacidad
calorfica relativa de un sistema en funcin de la temperatura.
En general, hay tres tipos de informacin que se pueden obtener a
partir de la DSC:
1. La capacidad calorfica parcial absoluta del compuesto de
inters.
2. Los parmetros termodinmicos globales (los cambios de entalpa
[AH], de entropa [AS], de energa de Gibbs [AG] y de la
capacidad calorfica [ACp]) asociados a la transicin inducida por
temperatura.
3. La funcin de la particin y concomitantemente la poblacin de
los estados relevantes del sistema y sus parmetros
termodinmicos.
DATOS QUE SE PUEDEN OBTENER A PARTIR DE
TERMOGRAMAS DE DSC
Tm: temperatura media del cambio de fase: corresponde a la temperatura en
la que se alcanza el valor mximo de Cp (cantidad de calor (por gr o por mol)
requerido para elevar la T de la muestra 1C )
AH: entalpa de transicin: es la cantidad de energa absorbida para que
tenga lugar el cambio de fase. El valor de la entalpa calorimtrica para la
transicin de fase se determina integrando el rea bajo el pico de la
transicin.
-AHcal = CpdT
AS: a partir de la entalpa y la Tm se obtiene el valor de entropa.
AS =AHcal /Tm
|
.
|
\
|
=
A
A
Lipid
Ligand
Na
H
H
1
0
0
AH
VH
(entalpia de Vant Hoff), es igual a la cantidad de calor necesario para que
cada unidad cooperativa lleve a cabo la transicin de fases. Da una idea del
grado de cooperatividad de la transicin de fases.
AH
VH
= 4RT
m
2
.
Si AHcal = AH
VH
es una transicin de primer orden entre dos estados (inicial y
final).
Si AHcal > AH
VH
es una transicin que implica ms de dos estados
PWMH (pick wide at the middle height), la anchura del pico a mitad de altura
nos da idea del grado de cooperatividad de la transicin de fase.
Unidad cooperativa: C.U. =AH
VH
/AH
cal
Cuanto mayor es el valor de CU mas cooperativa es la transicin de fases.
Na (numero de molculas de lpido cuyo cambio de fase es perturbado por el
ligando. El valor de Na se calcula a partir de :
cal
H
Cp
A
max
VP-DSC (Valery Plotnikov Differential Scanning Calorimeter).
En la calorimetra de barrido diferencial la muestra y la referencia se someten a
una temperatura que aumenta en forma continua. Se agrega calor sobre la muestra o
la referencia, a modo de mantenerlas a una temperatura idntica. El calor agregado
que se registra, compensa el que se pierde o se gana como consecuencia de
reacciones endotrmicas o exotrmicas que tienen lugar en la muestra.
Bloque calorimtrico del VP. (1) Tubos capilares para
llenar las clulas, (2) Termolmina o resistencia elctrica
laminar para calentar la clula capilar, (3) coraza interna,
(4) termopila y (5)coraza externa.
Sistema de llenado de las
celdas del VP-DSC.
Algunas caractersticas comunes que presentan los microcalormetros
diferenciales de barrido utilizados actualmente son:
1) No poseen agitacin mecnica para evitar aportar cantidades de calor
por efecto Joule que podran ser mayores, incluso, que el efecto
calorfico medido si el lquido tiene una elevada viscosidad.
2) Funcionan de modo adiabtico
3) El conjunto de clulas es fijo (no desmontable), lo que permite una
mayor reproducibilidad en los datos.
4) Poseen sistema de presurizacin para evitar formacin de burbujas.
Precauciones:
Desgasificar
Atemperar
Historial trmico
Capacidad de la celda ~ 0.5 ml
Celdas fabricadas de Tantalum 61, con gran resistencia qumica.
Rango de temperatura10C a +130C
Mecanismo Peltier interno, no requieren calentamiento o enfriamiento externo
Seleccin de velocidad de calentamiento en el rango de 0C to 90C por hora
alta sensibilidad y reproducibilidad
Posibilidad de seleccionar distintos tiempos de respuesta
Permite el estudio de transiciones rpidas o lentas
Se pueden obtener termogramas adecuados y reproducibles con poca
cantidad de muestra ( a partir de 12.5 microgramos de protena)
Dotado de un sistema de presurizacin interno (0-45 psi).
Efecto del tiempo de respuesta
High FB: Alta sensibilidad
Transicin lipdica:
proceso rpido
Desnaturalizacin
proteica: proceso lento
Aplicaciones de la calorimetra
Estudios de mezcla, separacin de fases y fusin de vesculas lipdicas.
Efecto de distintas sustancias en la transicin lipidica
Estabilidad de compuestos
Plegamiento y desplegamiento trmico de proteinas.
Formacin de distintos agregados lipidicos
monocapa
micela
bicapa
Las mezclas de lpido-agua son polimrficas y forman estructuras organizadas
cuando estos se hidratan con agua. La estructura que predomina en cada caso
depende TEMPERATURA, PRESION, FUERZA IONICA y el PH.
Las fuerzas que estabilizan agregados lipidicos son:
1. F. de Van der Waals dbiles, de corto alcance.
2. Enlaces de hidrgeno entre los cabezas polares,
3.Las fuerzas hidrofobicas Son las que termodinmicamente inducen al
sistema a adoptar una conformacin que minimiza el contacto entre las
porciones apolares de lpidos y el agua.
- es de origen entrpico AG = AH - TAS
La cuantificacin de Las fuerzas hidrfobas (medida de la tendencia
de un material apolar a minimizar su contacto con el agua) se realiza un
equilibrio de distribucin o reparto de un soluto entre una fase hidrfila y
otra hidrfoba.
La hidrofobicidad es a la superficie de contacto entre el agua y el soluto no
polar polar.
mayor n de C en la cadena HC Mayor hidrofobicidad
Las transiciones de fase dependen fundamentalmente de la cadena aclica
apolar debido a la importancia de las fuerzas hidrofbicas y de la regin
polar:
Cadenas largas indican temperaturas de transicin mayores por el
aumento de las fuerzas de interaccin.
Un doble enlace cis tiene mayor efecto que un doble enlace trans y sus
puntos de fusin sern menores aunque tambin dependern de las posicin
del doble enlace. El efecto es mximo cuando estos dobles enlaces estn en
el medio de la cadena.
Los cambios en la cabeza polar afectan a la Tm (cambian la fuerza inica
del medio). Fuerzas inicas elevadas reducen las interacciones repulsivas
electrostticas entre los grupos fosfatos en las bicapas de cidos
fosfatdicos.
Efecto de la cabeza polar
en la transicin de fases
PE
PC
DMPC
DPPC
DSPC
DPPE
DSPE
DMPE
Efecto del colesterol en la transicin de fases
Mezcla ideal de lipidos
Efecto de pptidos en las transiciones de fase de lpidos
A) Interaccin superficial electrosttica: Incremento en H y
Tm.
B) Interaccin superficial electrosttica e insercin parcial en
la membrana : disminucin en H y Tm.
C) Insercin en la membrana: Disminucin lineal en H
dependiente de concentracin de protena, sin cambios en
Tm
Temperature (C)
0 10 20 30 40 50 60
a
b
c
d
A termograma de DMPA
B termograma de DMPA/DMPC
C termograma de DMPA/DMPC + pptido
D termograma de DMPC
Efecto de pptidos
en transicin lipidica
Efecto de la adiccin de GS a
MLVs de DMPC
Efecto de la adiccin de GS a
MLVs de DMPG
Desnaturalizacin trmica de una protena
Procesamiento de datos del DSC con Origin 5 Microcal Inc. DSC
Muestras lipdicas para anlisis calorimtrico:
Muestra Relacin peptido/lipido Tm AH
Dmpa 0
TIT1 0.01
TIT2 0.0125
TIT3 0.0166
TIT4 0.025
TIT5 0.05
TIT6 0.1
TIT7 0.2
