MYCO BACTE RIU M

TUB ER CU LO SIS
HISTORIA
 El hallazgo de tuberculosis evidente en
los huesos de algunas momias egipcias
indica que es una enfermedad antigua.

 1484-1553 Francostorius llegó a

algunas conclusiones sobre la
naturaleza de la infección y su
mecanismo de transmisión.
HISTORIA
 1865 Willemin es cuando transmitió la
enfermedad del hombre a los conejos.
 1878 Baumgarten vió el bacilo en los
tejidos infectados
 1882 Roberto Koch es quien aisló el
bacilo tuberculoso
HISTORIA
POSTULADO DE KOCH

 Encontró el bacilo asociado constantemente a

la enfermedad
 Aislo en cultivo puro
 Reprodujo la enfemedad en conejos y
cobayos con el cultivo
 Recuperó el bacilo en cultivo puro de los
animales infectados
 La tuberculosis
 Es una enfermedad infecciosa causada por
Mycobacterium tuberculosis y, excepcionalmente,
por M. bovis, que se caracteriza por la formación
de granulomas en los tejidos, Aunque se trata
principalmente de una enfermedad pulmonar,
también puede afectar a los restantes órganos. El
curso de la enfermedad es crónico y puede
conducir a la muerte si el paciente no recibe
tratamiento.
Epidemiología
Existen evidencias paleológicas de tb espinal en restos
neolíticos precolombinos y egipcios. Si embargo, se
convirtió recién en un problema grave en el momento en
que el hacinamiento en los medios urbanos asociado con
la Revolución Industrial generó circunstancias
epidemiológicas que favorecieron su propagación. En los
siglos XVII y XVIII la Tb fue responsable de una cuarta
parte de todas las muertes en adultos que se produjeron
en Europa.
 Epidemiología
la aparición del SIDA ha supuesto un resurgimiento
excepcional de esta enfermedad en todo el mundo.
Se estima que la mitad de la población mundial está
infectada por M. tuberculosis, que hay 30 millones
de enfermos en el mundo y que se producen al
menos 10 millones de nuevos casos al año.
LOCALIZACION
TRANSMISIÓN
 
Las M icob act erias
 Son microorganismos de forma bacilar,
que se caracteriza por la propiedad
ácido alcohol resistente, la lentitud con
que se desarrolla en los medios de
cultivo y la exigencia de que estos
medios sean altamennte nutritivos para
desarrollarse.
 CLAS IFICACI ON D E
MI CO BACT ERI AS
Micobacterias de crecimiento lento M. tuberculosis, M. Bovis ,M africans,
Patógenos estrictos M.leprae.

Micobacterias no tuberculosas  
 
Potencialmente patógenas  
M. kansaii,M marinum, M. simiae, M.
fotocromógenas  
asiaticum

Escotocrógenas M.Escrofulaceum, M.szulgai, M.xenopi.

No fotocromógenas M. avium ,M.intracellulare, M.

malmoense, M. haemophilus, M. ulcerans.
 
 

Micobacterias de crecimiento rápido M. fortuitum, M. Chelonei.

Micobacterias patógenas para animales M. lepraemurium, M. microti, M.

paratuberculosis, M. farcinogenes, M.
Ca rac terís tic as de la
micob ac terias s apróf ita s
 Han sido identificadas más de 50
especies, algunas potencialmente
patógenas para el hombre.
 Interfieren con la interpretación en la rx
de tuberculina, ya que en las regiones
tropicales o subtropicales donde son
prevalentes pueden dar resultados
falsamente positivos.
Ca rac terís tic as de la
micob ac terias s apróf ita s
 Interfieren con la evaluación de la
eficacia de los programas de
vacunación BCG, ya que confiere cierto
grado de protección frente a la
tuberculosis, lo que dificulta la medición
de los reales efectos beneficiosos de la
vacuna en las regiones donde son
especialmente prevalentes.
Ca rac terís tic as de la
micob ac terias s apróf ita s
 Pueden aparecer ocacionalmente en la
expectoración, en orina o en otras
muestras orgánicas, determinando
baciloscopía “falsamente positivas” que
pueden inducir erroneamente al
diagnóstico de tuberculosis.
Pr opi eda des Biológi ca s de
Myco ba cter iu m tu berc ulo sis
 Es un parásito estricto, por o cual su
transmisión generalmente es directa, de
persona a persona.
 No tiene tóxinas conocidas, ---capacidad de
bacteriostasis por largos periódos en el
interior de las células.
 Es aerobio, lo que determina que tenga una
capacidad de metabolización y de crecimiento
muy diferentes según la tención parcial del
oxigeno del órgano o lesión en que anida.
Pr op ied ades B iológic as de
M. t ubercu los is
 Es de multiplicación lenta, factor que
condiciona su tendencia a la cronicidad.
 Tiene una virulencia variable, que podría
explicar algunas de sus características
epidemiológicas.
 Tiene numerosos antígenos, capaces de
despertar una gran variedad de respuestas
inmunológicas en el huésped, algunas de las
cuales determina el característico daño tisular
que es capaz de producir.
 Mor folog ia
 Forma bacilar
 Longitud de 2-4 micras y diametro 0.2-0.5 m
 Pared celular-lípidos (>60%) glicolípidos y
proteínas
 Presencia de ac. Micólicos típicos
 No esporulados , no móviles
 Aerobios
 Replicación por división binaria cada 18 a 20
horas.
Colora ción Zieh l N eels en
 Las pared celular micobacteriana, tienen un
alto contenido lipídico, la cual tienen la
capacidad de combinarse con el colorante
carbolfuscina resistiendo la decolorción con
alcohol ácido.
Reactivos:
 Fucsina fenicada (CARBOLFUCSINA)
 Acohol ácido (HCL + ETANOL)
 Azul de metileno
Colora ción Zieh l N eels en
Procedimiento:
 Cubrir el frotis con fucsina ácida y calentar la
lámina hasta obs desprendimiento de vapores
por tres veces.(tiempo min 5 minutos)
 Lavar con agua corriente
 Decolorar con alcohol ácido x 2 min.
 Cubrir con azul de metileno durante 1 min.
 Lavar con agua y dejar secar al aire
 Observar la microscopío 100x
Colora ción Zieh l N eels en
 Sensibilidad 50 a 80 %
 Es necesario 5000 a10000 bacilos / ml de
esputo
 Necesita de personal entrenado
 Control de calidad: suspenciones 1 ml de
SSF con una turidez de No1 Mac Farland de
Nocardia asteroides (C-) y M. Tuberculosis
H37Ra ATCC25177 (C+)
 Puede utilizarse E. Coli y ; M. Kansasi
 BACI LO SCO PIA- I nfor me
de re sulta dos
Se recomienda la sgte escala semicuantitativa:

NEGATIVA No se observan BAAR en

100campos
POSITIVO 1+ Menos de 1 BAAR / campo
en 100 campos observados.
POSITIVO 2+ De 1 a 10 BAAR / campo en
50 campos observados.
POSITIVO 3+ Más de 10 BAAR / campoEN
20 campos observados.
TI NCI ON D E KI NY OUN
 No utiliza el calor para favorecer la
captación de la fucsina fenicada.
 Tinción fria, técnica igual que ZN
TI NCI ON CO N
FLU OROCR OMOS
 Se basa en el mismo principio de
coloración de ZN, se observa
fluorescencia amarilla naranja cuando
se observa en campo oscuro
 Es una técnica rápida,recomendable para
laboratorios que tienen grandes cantidades
de muestras
 El los casos en que la morfología de los
bacilos encontrados por es esta tecnica es
cuestionable se debe repetir con ZN para
disminuir falsos positivos.
CU LTIVO DE
MYCO BCTER IU M.
TUB ER CU LOSI S
IMPO RTANC IA D EL
CU LTIVO
 La importancia radica en aislar a M.
Tuberculosis a partir de muestras
paucibacilares o de escasa cantidad de
bacilos en pcte con sospecha de
tuberculosis y radiografía anormal. a fin
de identificar la cepa y realizar las
pruebas de sensibilidad a los
medicamentos antituberculosos.
As pect os g en er ales e
in dica cion es d el cu lt iv o
 En el dx diferencial de tubeculosis
pulmonar de sintomáticos respitorios
con dos baciloscopías negativas y
cuadro clínico –radiológico sospechoso.
 Dx de TBC infantil baciloscopías
negativa
 DX de tuberculosis extrapulmonar.
 Para estudios de sensibilidad
 En pacientes HIV positivas/SIDA
As pect os g en er ales e
in dica cion es d el cu lt iv o
 Pacientes multitratados con persistencia
de baciloscopía positiva.
 En muentras paucibacilares de BK (1-9
BAAR en más de 100 campos
observados)
 Para estudios epidemiológicos de
resistencia primaria y secundaria a M.
tuberculosis
Recole cció n d e m uestra
 Expectoración (esputo) : proveniente del
arbol bronquial, recogida después de un
esfuerzo de tos.Se solicitan tres muestras
debido a que la elimación del bacilo es
variable.
 Orina: Se solicita la totalidad de la primera
micción de la mañana. Se sugiere cultivar por
lo menos tres muestras seriadas.
Rec ole cción d e muestra
 Secreciones: Las muestras se extraen con
hisopos estériles, enviandose dentro de un
tubo estéril y con el otro se realiza un frotis
para coloración ZN
 Biopsias:La obtención lo realiza el médico.Se
extrae fragmentos de tejido a estudiar se
deposita en un vial estéril sin conservadores.
Conservar en refrigeración.
 Pr oces amien to de la
mu es tra
Las muestras obtenidas asépticamente, puede
cultivarse presindiendo de la descontaminación:
-Muestras obtenidas por punción: LCR, pleural,
peritoneal, articular. Se centrifuga y se siembra el
sedimento.
- Materiales de biopsia pleural, hepátiva y
ganglionar: se fraccionará con instrumento
quirurgico esteril en una mortero de porcelana
estéril se agrega una suspención de agua estéril y
se siembra en el medio de cultivo.
Pr oces amie nto de la
mu es tra
 Las muestras contaminadas:
esputo,orina, contenido gástrico, entre
otras, deben ser descontaminadas
antes del cultivo.
 Se deberán centrifugar al volumen total
a 3000 ó 3500 RPM durante 20 a 30
min.
 Eliminar el sobrenadante,
descontaminar y sembrar.
Pr oces amien to de la
mu es tra
 La descontaminación se realiza con hidróxido
de sodio (NaOH) al 4%, soluc acuosa estéril.

 Objetivo: eliminar la flora asociada a M. Tuberculosis,

cuyos gérmenes se multiplican más rápido que el
bacilo. También para homgenizar la muestra
especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del
mucus, material celular y tejidos.
Medi os de c ult ivo
 Medios a base de huevos:
Se obtiene medios ricos en lípidos
por la que la micob tiene especial preferencia.
 Están constituidos por:
-soluciones reguladoras a base de fosfatos,
-cationes en
muy bajas concentraciones -una fuente
de carbono (glicerol)
-otra fuente de nitrogeno (asparagina)-
Lowestein Jeinsen
-o una fuente de ambos
elementos (piruvato) medio de Stonebrink
Medi os de c ult ivo
 Medios semisintéticos de aislamiento y
subcultivo
 El medio basal está constituido por elementos
inorgánicos, glicerol o glucosa, aminoácido
(digerido anzimático de caseína) y
asparagina.
 Acidos grasos de cadena larga (ac. Oléico por
ejemplo) Seroalbumina previene que el ac.
Oléico alcance concentraciones tóxicas.
Medi os de c ult ivo
 Medios a base de huevo :
 Lowestein Jensen
 Stonebrink
 Ogawa Kudoh
 Medios semisintéticos:
 7H10
 7H9
 7H11
Low es tein J en sen
 Solución de sales: -
-fosfato monopotásico
-sulfato de magnesio

-citrato de magnesio
-L-
asparagina
-glicerina bidestilada
 Suspensión de huevos enteros
 Solución acuosa de verde de malaquita al 2%
Medi o og awa
 Solución de sales:
-fosfato
monopotásico
-glutamato de
sodio
-glicerol
-
agua destilada
-glicerina bidestilada
 Suspensión de huevos enteros

CU LTIVO EN M EDI O
OGA WA ACID IF ICA DO
 Colocar en un tubo 1 ml de muestra de
esputo o todo el sedimento obtenido por
centrifugación. Agregar 4 ml de solución
estéril de NaOH al 4%.
 Dejar a 37C x 20 min en estufa o BM
 Neutralizar
 Homogenizar la muestra con un pipeta e
inocular 0.1 ml en 2 tubos de medio de
ogawa, bañando toda la superficie del medio.
CU LTIVO EN M EDI O
OGA WA ACID IF ICA DO
 Colocar los tubos en bandejas de fondo
inclinado e incubar en estufa a 37C
 Después de 48h revisar los tubos y ajustar las
tapas.
 Verificar si algún tubo está contaminado:
 Alcalinizado (color blanco amarillento) o
acidificado(color azul oscuro) por mala
neutralización de la muestra.
 El desarrollo de colonias antes de las 48h es
indicativo de contaminación, aveces el medio
se licua por acción de gérmenes proteolíticos.
LEC TURA E INF ORME
 Las lecturas se realizarán durante la
incubación a los 7, 30 y 60 días
 Las colonias no típicas se hace frotis y
coloración ZN , si es BAAR se envia el
cultivo para su tipicación.
LEC TUR A E INF ORME
 El desarrollo de M.
Tuberculosis
geneneralmente
aparece luego de 2
a 3 semanas. Las
colonias típicas son
de color crema,
secas, rugosas de
aspecto de coliflor y
de borde irregular
 LEC TUR A E INF ORME
- No se observan colonias
No... Número total de colonias si < de 20
+ De 20 a 100 colonias
++ Colonias separadas más de 100
+++ Colonias confluentes (desarrollo en toda
la superficie del medio)
c Cultivo contaminado
TI PIFI CAC IO N DE
MIC OBAC TER IAS
 La preclasificación según Runyon, en la
que se investiga velocidad de desarrollo
y la producción de pigmentos.
 Se completa con las pruebas
bioquímicas.
 Cla si fica ci ón de
mic oba cte rias s egún RUNY ON
 
 
I-Fotocromogenas M. kansassi
  Pigmentan por estímulo M. marinum
  de la luz
CEPAS DE DESARROLLO M. simiae
LENTO
(días o más) II-scotocromogenas M.escrofulaceu
Pigmentan sin necesidad m
del estimulo de la luz
M. gordonae
III No cromógenas M. tuberculosis
No pigmentan  M. bovis
espontáneamente ni por M.avium
estímulo de la luz
M. xenopi
 
 
IV-Crecimiento M.fortuitum
CEPAS DE DESARROLLO rápido M.phlei
Pueden pigmentar o no M. vaccae
RAPIDO
(7 días o menos)
PR UEB AS BI OQUÍMI CAS
 Se fundamenta en la capacidad que
tienen algunas especies de
micobacerias de transformar un
producto en otro diferente mediante la
acción de enzimas.
 Pruebas bioquímicas
Niaci Reducción de  Hidrolisis  Catalasa  TH Crecimiento 
Especie Ureasa
na nitratos Tween 80 68ºC C en PZA
M.
tuberculosi + + +/- - + +/- -
s

M. bovis² - - - - - + +

bovis
+ +/- - - + +
M.
-
BCG²

M.
africanun
- - - - v + -

M.avium
complex¹
- - - + + - +
PR UEB A D E LA NI ACI NA
 Permite identificar a las especies que carecen
de la enzima que transfoma la niacina en
niacina ribonucleótide, acumulandose por
tanto en el medio (positivas). Esta niacina es
un producto metabólico que forman las
bacterias.
 Reactivos . -Bromuro de cianógeno 4-10%
-solución alcohólica de
bencidina o
anilina al 4%
PR UEB A D E LA NI ACI NA
 En un cultivo abundante se agrega 1ml agua
dest ,se deja en reposo minimo 15 min, luego
se extrae el líquido con una pipeta a otro
tubo donde se le agrega 0.5 ml de cada rvo.
 Reacción positiva: aparece de inmediato una
coloración violácea (bencidina) o
amarilla(anilina)
PR UEB A D E NITR ATO
RED UCCI ON
 Permite identificar a especies que
contienen la enzima nitroreductasa.
 Se realiza en cultivos que tengan menos
de 1 mes
 Reactivos:-sol.acuosa 0.01M de nitrato
sodio 0.085%
-reactivo de
Griess
PR UEB A D E NITR ATO
RED UCCI ON
 En un tubo se mezcla 4 gotas de agua
dest con 10 mg de masa bacilar,se
agrega 10 ml de solucion de nitrato de
sodio y se incuba 2 horas a 37C.
Luego se agrega el reactivo de
Gries 0.2 ml de A y B se agitar y leer
inmediatamente.
PR UEB A D E NITR ATO
RED UCCI ON
 Lectura:
 reacción positiva: coloración roja
 Reacción dudosa: coloración rosada
 Reacción negativa: sin coloración o rosa
pálido.

 Realizar dos controles uno en un tubo con el

sustrato solamente (negativo) y otro con
cultivo joven de M. Tuberculosis (positivo)
 PR UEBA DE HI DRÓL IS IS D E
TW EEN 80
 Permite diferenciar a micobacterias que
hidrolizan el Tween80 mediante la enzima
lipasa en ácido oléico y sorbitol polioxietilado
sorbitan.

 Reactivos:tween 80, rojo neutro y solución

reguladora de fosfato Ph 7

 Tween 80, nombre comercial del detergente monoeleato de

polioxietilen sorbitan
PR UEBA D E HI DR ÓL IS IS D E
TW EEN 80
 Se suspende en el sustrato colonias de cultivo
joven en medio sólido. Incubar a 37C, sin
contacto con la luz, no más de 2 semanas.
 Leer a los 5 y alos 10 días
 Es positivo si hay un cambio de color de
ambar a rosa salmón, el color puede
intensificarse a rosado más intenso y hasta
rojo neutro.
 Informar positivo a los 5 días o positivo a los
10 días.
PR UEBA D E L A C ATAL ASA
68C
 La catalasa es una enzima producida en
cantidades variables, descompone el
H2O2 en agua y oxígeno libre.
 La semicuantificación y la suceptibilidad
al calentamiento son útiles para
identificar a las micobacterias.
 PR UEBA D E LA CA TALA SA
68C
 Reactivos:- agua oxigenada 110 vol (H2O2 al
30%)
-Solución reguladora de fosfáto
pH 7 -Tween 80
 Distribuir la sol reguladora 0.5 ml en tubos y
agregar una asadita cargada de colonias
tomadas de un cultivo joven. Colocar el tubo
en baño de agua termoregulado a 68C x 20
min. Agregar al tubo o.5 ml de mezcla de sol.
Tween y agua oxigenada.
PR UEBA D E LA CA TALA SA
68C
 Lectura: observar formación de
burbujas en a superficie. Obs 20 min
antes de informar resultados negativo.
OTRA S TECNI CA S
DIAGNO STI CA S D E
TUB ER CU LOSI S
OTRAS TE CN ICAS
DIAGNO STICAS D E
TUB ERCULO SIS
 Métodos de cultivo radiométrico
(BACTEC)
 Métodos químicos
 Detección de anticuerpos
 Determinación de antígenos bacterianos
 Métodos de recombinación de los ác
nucleicos.
 Técn ica d e cu lt iv o
rad iomét rica ( ba ct ec)
 Tiene alta sensibilidad y especificidad que los
método tradicionales
 Permite el dx de tuberculosis en menos de 1
sem en el 95% de los casos
 también util para realizar sensibilidad de la
cepa y obtener resultados en pocos días
 Ayuda en la diferenciación de otras especies
de micobacterias.
Técn ica d e cu lt iv o
rad iomét rica ( ba ct ec)
 Medio de cultivo Middlebrook enriquecido.
Medio rico en ac. Palmítico con carbono 14
(isótopo radioactivo)
 Las micobacterias vivas metabolizan los ac.
graso con C14,libran el isotopo en forma de
CO2 marcado con C14 al medio ambiente , de
donde es aspirado y llevado a una cámara
ionizante y transformado en una corriente
eléctrica proporcional a la cantidad de bacilos.
Técn ica s Q uímica s
*de ter min ación de co nst it uye nt es
mi cobact eri an os:
 Acidos micólicos en LCR.
 Acido esteárico en secreciones.

Actualmente se utiliza HPLC,la cual detecta

cantidades infimas de sust quimicas, capaz de
aumentar la señal a 1 millon de veces.
medición
. en pocas horas.
Técn ica s Q uímica s
*D et ermi nació n de der iva do s de l
me ta bo lismo de la enf er med ad
tube rculosa :
 Medición de la actividad de la enzima
adenosina deaminasa (ADA)

Enzima proveniente del

metabolimo de las purinas que se encuentra
en exudados proveniente de pleuresia,
pericarditis, peritonitis y meningitis
tuberculosas.
Técn ica s in mu noló gica s
*Métodos s erológi cos

 Identificar Acs dirigidos contra

antígenos específicos de la
micobacterias (ELISA)
 Detección directa de Ags
micobacterianos en suero o secreciones
Técn ica s in mu noló gica s
*Métodos d e rec omb in ación genét ica de
acidos nu cleico s-clona ción- hib ri da ción
 Detección de secuencias especiales de ADN o

ARN micobacteriano en expectoración u otras

muestras orgánicas.

 Se busca nuevos marcadores de la aciv. Tuberculosa.

Es prometedor la medición de interluquina 2 en cual
se encuentra elevado en granulomatosis y otra enf
que activan los linfocitos T