Tesis de Grado I
Estudio de la produccin de azucares fermentables a partir de la celulosa contenida en desechos agrcolas o industriales, a partir de una hidrlisis enzimtica.
Tutor Acadmico: Prof Rafael Martn Belmonte
Elaborado por: Daniela Narciso
Tesis de Grado I
Planteamiento del Problema
Introduccin
Tesis de Grado I
Antecedentes
Antecedentes
Charles Wilke y Gautam Mitra (1974), patentaron el
proceso para la conversin de materiales celulsicos por medio de una degradacin enzimtica. Folke Tjerneld e Ingrid Persson (2004), estudiaron las particiones de la Trichoderma reesei con el objeto de disear un sistema de fases. Okazaki y Moon-Young (2005) desarrollaron un modelo matemtico de la cintica de la reaccin enzimtica,
basndose en el modelo de Michaelis-Menten.
Tesis de Grado I
Objetivos
Objetivo General
Estudiar
el
proceso
de
hidrlisis
enzimtica
residuos
del
bagazo
de
de
caa
agrcolas
composicin
similar para la produccin de azcares fermentables.
Objetivos Especficos
Determinar las ventajas de la realizacin de un
pretratamiento del sustrato antes de la realizacin del proceso de hidrlisis.
Comparar el comportamiento de los diferentes sustratos en la produccin de los azcares
fermentables.
Objetivos Especficos
Determinar las condiciones de operacin ptimas para
cada uno de los sustratos en lo que se refiere a la
concentracin de enzimas, concentracin de sustrato y tamao de partcula de sustrato. Determinar las caractersticas principales del reactor que llevar a cabo dicho proceso a escala industrial. Establecer las diferencias bsicas entre la hidrlisis cida y la hidrlisis enzimtica.
Tesis de Grado I
Marco Terico
Biomasa
Se denomina biomasa al grupo de productos energticos y materias primas de tipo renovable que se originan a partir de la materia orgnica formada por va biolgica.
Fuentes de Biomasa
Valor Energtico de la Biomasa
Caractersticas de la Biomasa
Amigable con el medio ambiente ya que su balance de emisiones de CO2 es cero. Es una fuente de energa renovable.
Permite reactivar la economa de zonas rurales y de pases
sin hidrocarburos. Generacin de gran cantidad de empleos. Aprovechamiento de recursos que antes eran en su mayora desechados. Est conformada por Lignina, Hemicelulosa y Celulosa.
Lignina
Es un polmero tridimensional que se forma a partir de las unidades fenilpropnicas que se han desarrollado, de manera aleatoria, formando una molcula grande y compleja con muchas clases diferentes de ligamentos entre los bloques estructurales. Por ser un compuesto de difcil degradacin, representa
el principal obstculo del proceso de hidrlisis.
Lignina
Hemicelulosa
La hemicelulosa es un polmero de cadena ms corta y
ramificada cuyos monmeros pueden ser de cinco
tomos de carbono, o de seis tomos de carbono. Son de naturaleza amorfa y sirven, con la lignina, para formar
la matriz en la cual se incrustan las fibrillas de celulosa.
Celulosa
La celulosa es un polisacrido lineal formado por
residuos de glucosa unidos por enlaces b 1-4.
stas cadenas lineales de celulosa interaccionan entre si
por medio de enlaces de puentes de hidrgeno dando
lugar a la formacin de microfibrillas.
Bagazo de Caa
El bagazo es el residuo del tallo o cuerpo de la caa de azcar que queda despus de que se le ha extrado el jugo, ya sea en el ingenio o en el trapiche. Entre los usos del bagazo tenemos: Produccin de biocombustibles. Abono.
Combustible en el ingenio.
Otros.
Composicin del Bagazo de Caa
Componentes
Humedad
Fibra
(%)
50
46
Brix
Impurezas Minerales
2
2
Componentes
Celulosa
(%)
50
Hemicelulosa
Lignina
25
25
Ventajas del Uso del Bagazo de Caa
Elevada
eficiencia
fotosinttica,
es
decir,
puede
sintetizar carbohidratos solubles a una tasa superior al de otros cultivos comerciales. Es un cultivo permanente.
La duracin de la cepa es de 5 cosechas.
La energa
invertida en la produccin de caa
representa, a lo sumo, el 5% de su potencial.
Enzimas
Las enzimas, tambin conocidas como biocatalizadores,
son aquellos compuestos protenicos que actan como catalizadores de numerosas reacciones biolgicas. Estas no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aumentan la velocidad de la
reaccin.
Caractersticas de las Enzimas
Son efectivas en pequeas cantidades.
No
sufren
modificaciones
qumicas
irreversibles
durante la catlisis. Pueden catalizar procesos a bajas temperaturas No afectan la condicin de equilibrio de la reaccin que catalizan.
Clasificacin de las Enzimas
Grupo
Transferasas Hidrolasas
Accin
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas molculas) a otras sustancias receptoras. Actan en reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de monmeros a partir de polmeros. Actan sobre determinadas molculas obteniendo de ellas sus ismeros de funcin o de posicin. Realizan la degradacin o sntesis de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energtico. Realizan la degradacin o sntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energa como los nucleosidos del ATP.
Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreduccin.
Isomerasas Liasas
Ligasas
Cintica Enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la
enzima.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron
la teora de la cintica enzimtica y propusieron una
ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de las enzimas.
Ecuacin de Michaelis-Menten
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones
catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas.
Celulasa
Son biocatalizadores de naturaleza proteica, que
participan en el rompimiento de los enlaces glicosdicos
b-1,4 presentes en los polisacridos celulosa, liberando al medio glucosa y otros monosacridos.
endo-b-glucanasas
exo-b-glucanasas
b-glucosidasa
Mecanismo de Accin de la Celulasa
Microorganismos Productores de Celulasa
Microorganismo Tipo de Respiracin Bacterias
Cellulomonas Aerbico
Pseudomonas Fluorescens
Clostridium Thermocellulaseum
Aerbico
Anaerbico
Hongos
Aspergillus Nger Fusarium Solani Trichoderma Reesei Trichoderma Viride Aerbico Aerbico Aerbico Aerbico
Aspergillus Niger
Pretratamientos
Los pretratamientos son requeridos para alterar la estructura de la biomasa para hacerla mas accesible a las enzimas que convertirn a las cadenas polimricas en azcares fermentables. La meta es romper el sello que forma la lignina y la hemicelulosa e irrumpir en la estructura cristalina de la celulosa.
Pretratamientos
Lignina Celulosa
Pretratamiento
Hemicelulosa
Objetivos de los Pretratamientos
Reducir la cristalinidad de la celulosa.
Disociar el complejo lignina-celulosa. Aumentar el rea superficial de la fibra de celulosa.
Disminuir la presencia de aquellas sustancias que
dificulten el proceso de hidrlisis.
Caractersticas de los Pretratamientos
Deben ser muy eficaces. Bajos costos de inversin y mantenimiento. Bajo consumo energtico.
Utilizacin de reactivos econmicos.
Posible aplicacin a diversos sustratos.
Tipos de Pretratamientos
Pretratamiento Qumico
Ozonlisis Hidrlisis con cido Diluido Hidrlisis con cido Concentrado Hidrlisis Alcalina Deslignificacin Oxidativa Organosolventes
Tipos de Pretratamientos
Pretratamiento Fsico Pulverizado Mecnico Pirlisis
Pretratamiento Fsico-Qumico
Explosin con Vapor
Agua Lquida Caliente (LHWP)
Explosin de fibra con Amonaco Pretratamiento Biolgico Pretratamiento con Hongos
Hidrlisis
La hidrlisis de residuos lignocelulsicos tienen como
finalidad la transformacin de los polisacridos que estos contienen en azcares sencillos, fermentables a su vez a
distintos productos de inters industrial.
La hidrlisis se puede llevar a cabo tanto por va qumica como por va biolgica.
Hidrlisis Qumica
Este proceso utiliza cidos como H2SO4, HCL y HF a
diferentes concentraciones, altas temperaturas y en
diversos procesos operativos.
Hidrlisis Enzimtica
La hidrlisis enzimtica de la celulosa consiste en la
utilizacin de enzimas celulolticas, producidas por
algunos hongos y bacterias, para obtener una solucin de glucosa a partir de dicho sustrato que es
originalmente insoluble.
Ventajas y Desventajas de la Hidrlisis Enzimtica
Ventajas
temperatura (30 50 C) La no utilizacin de agentes
qumicos, ya que as se evita la corrosin de los equipos y la degradacin producidos. Alta especificidad. de los azcares
Desventajas
la propia estructura de los
Opera a condiciones suaves de La lentitud del proceso debido a
sustratos celulsicos nativos.
La necesidad de recuperacin de las enzimas del medio de
reaccin.
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Metodologa
Laboratorio
Materiales
Complejo Enzimtico (Celulasa)
Bagazo de Caa
Reactivos
Solucin Amortiguadora Acetato
cido Dinitrosaliclico
Solucin de Glucosa de 40 mMol
Equipos
Bao Termostatizado
Equipos
Molino con tamiz incorporado
pH metro
Equipos
Plancha de Calentamiento y Agitacin Magntica
Espectrofotmetro
Equipos
Balanza Analtica
Balanza Galnica
Mtodo DNS
El seguimiento de la hidrlisis se realizar por medio de la determinacin del contenido de azucares fermentables
solubles por medio del mtodo del cido dinitrosaliclico.
El acido dinitrosaliclico se reduce formando el acido
3-amino-5-nitrosaliclico, mientras que el grupo aldehdo
reductor se oxida para formar un grupo carboxlico, lo cual causa diferencias de coloracin que pueden
determinarse por espectrofotometra, a una longitud de
onda de 570 nm.
Mtodo DNS
Se toma 0.4 ml de la solucin azucarada y se coloca en un tubo de ensayo. Aadir 4 ml de la solucin de DNS agitando para homogenizar. Calentar la muestra en un bao de agua a ebullicin durante 10 minutos. Enfriar la solucin a la temperatura ambiente en un bao de agua fra. Medir la absorbancia en un espectrofotmetro a 570 nm.
Mtodo DNS
Curva de Calibracin de Glucosa
Preparar soluciones con concentraciones conocidas de
glucosa. Aplicar el mtodo del DNS. Enfriar las muestras a la temperatura ambiente.
Calibrar el espectrofotmetro a cero con el blanco.
Determinar la absorbancia a 570 nm. Construir la curva de calibracin de glucosa graficando a la
absorbancia obtenida en funcin de la concentracin de
glucosa.
Acondicionamiento de la Materia Prima
Colocar al bagazo de caa en una estufa a 76 C durante 24 h. Moler el bagazo de Caa. Pasar el bagazo molido a travs de tamices.
Clasificar el bagazo segn su tamao de partcula.
Almacenar el bagazo en frascos de vidrio dentro de bolsas de plstico hermticas a temperatura
ambiente.
Pretratamiento LHWP
La porcin de bagazo de caa a ser pretratado se
coloca en una olla de presin con 2 litros de agua por 1 hora a 2 atm de presin.
Hidrlisis Enzimtica
Valores ptimos de las Variables de Operacin
Temperatura (C)
pH
37
5,0
Hidrlisis Enzimtica
Preparar soluciones de celulasa en buffer acetato a
pH = 5 y a las diferentes concentraciones de estudio. Pesar la masa de sustrato y sumergirlo en la solucin
de celulasa en buffer. La proporcin depender de la
relacin lquido slido que se pretende estudiar. Incubar la solucin en un bao termostatizado a 37 C
con agitacin suave.
Aplicar el mtodo del DNS a la solucin en ciertos intervalos de tiempo.
Estrategia de Anlisis
Concentracin Masa de Sustrato
de enzima
1,5 g/l
3 g/l
6 g/l
0,25 g 0,5 g
2g
Estrategia de Anlisis
Adicionalmente, se realizara pruebas para:
Diferentes tamaos de partcula. Bagazo sin pretratamiento. Otros sustratos.
Hidrlisis Qumica
En un erlenmeyer colocar la muestra de bagazo de caa en contacto con una solucin de H2SO4 al 4% y
a una relacin liquido/slido de 30/1. Colocar el recipiente en un bao termostatizado y
fijar la temperatura de reaccin en 100 C.
Agitar la mezcla de reaccin con un agitador
magntico.
Hidrlisis Qumica
Cada cierto tiempo se toman muestras de la solucin y se le aplica un enfriamiento brusco y se filtra a
travs de papel de filtro whatman No 1 para detener
la hidrlisis. Aadir a la solucin NaOH 2 M hasta lograr un pH de 4,5. Aplicar el mtodo del DNS.
Resumen de la Metodologa
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PREGUNTAS
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