Estado del arte de la Biologa Molecular en Salud.
Las tecnologas valiosas terminan trasladandose de la investigacin al diagnostico.
Struct DNA 1953 Genetic code 1961 Cloning 1972 Southern 1975
Northern 1980 1st Affy Prototype 1989
HGP 2000
Microarray
1st EU Approved Diagnostic Array 2004
PCR
st PCR Discovered 1 1983
Diagnostic Use 1992
PCR Real-time 1998 1st Diagnostic Sequencing Kit HIV Genotyping 2001
Sequencing
Sanger Method1st Automated Sequencer 1977 1986
Immunology
Antibody Structure 1959
1950 1960
RIA & ELISA 1970s
1970
1st Diagnostic ELISA 1982
1980 1990
1st Approved Therapeutic 1997
2000
PCR TIEMPO REAL
INTRODUCCIN AL PCR TIEMPO REAL
PCR
Reaccin en Cadena de la Polimerasa: Kary Mullis (1983) Mtodo enzimtico in vitro para sintetizar DNA La reaccin utiliza dos partidores (oligonucletidos) que hibridizan en hebras opuestas del DNA y abarcan la porcin del gen que se desea amplificar Una serie repetitiva de ciclos (denaturacin, annealing y extensin) dan una acumulacin exponencial de un fragmento especfico de DNA El nmero de molculas de dsDNA aumenta al doble en cada ciclo (20 ciclos 220 106 copias)
ESQUEMA DE LOS CICLOS DE PCR
What is Real-Time PCR ?
1400 real-time PCR 1200 1000 800 600 400 200 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Real Time PCR
Fluorescencia es medida en cada ciclo de amplificacin (seal es proporcional al producto del PCR) La curva aumenta luego de un numero determinado de ciclos que es proporcional a la cantidad de DNA inicial.
Comparacin con una curva de Calibracin cuantificacin
Real-Time PCR is based on Fluorescence
Fluorescence is less sensitive when compared to radioactivity or enzyme-linked reactions
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Monitoring of PCR Reactions
From Block Cyclers to Real-Time PCR
Real-Time-PCR Instruments
SmartCycler LightTyper
Roche Diagnostics Cepheid
SDS7700
Applied Biosystems
Opticon
MJ Research
iCycler
BioRad
SDS7000
Applied Biosystems
LightCycler
Roche Diagnostics
7900HT
Applied Biosystems
RotorGene
Corbett Research
Mx3000/4000
Stratagene
Superconvector
AlphaHelix
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Application Principles
Quantification and qualitative detection
Mutation detection
Product identification
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FORMATOS DE DETECCIN
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Assay Formats
SYBR Green I SimpleProbe Probes HybProbe Probes Hydrolysis Probes and Universal ProbeLibrary Probes
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SYBR Green I Format
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HybProbe Detection Format
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Multiple HybProbe Detection
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Hydrolysis Probe Format
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Single Label Probe Format
SimpleProbe Probes
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Overview Applications and Dyes
Assay Format Detection Channel Reporter Dye Application
SYBR Green l
530
SYBR Green I
Product Characterization Quantification Quantification Mutation Analysis
HybProbe Probes
610 640 670 710
530 560
LightCycler RED 610 LightCycler RED 640 LightCycler RED 670 LightCycler RED 705
FAM VIC, HEX
TaqMan Probes
Quantification Mutation Analysis
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ANLISIS DE LA CURVA DE MELTING
Entrega la confirmacin de la secuencia del producto de PCR amplificado
Diferencia los productos especficos del PCR de los noespecficos (dmeros de primers) Es una poderosa herramienta para GENOTIPIFICAR SNPs y mutaciones
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Punto de Fusin
-d(F)/T
50C
75C
95C
T
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Monitoreo del PCR usando SYBR Green I
Anlisis
Cuantificacin
Melting Curve
Template: human genomic DNA; Target: -Globin; Detection Format: SYBR Green I
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Variacin en Tm del Producto
Tm vara por
Low GC 50 bp 41 C 10 C High GC 10,000 bp
Tm influenciada: concentracin Sales concentracin MgCl2 concentracin SYBR Green I
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OTROS FORMATOS DE DETECCIN
Molecular Beacon
LightUp Probe
Scorpion Primers QuantiProbes QZyme Lux Primers
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DISEO DE PRIMERS Un buen diseo ahorra TIEMPO Y DINERO qPCR buen diseo de primers (pej MULTIPLEX)
Que afecta la interaccin DNA-DNA
temperatura composicin de bases
concentracin de primers
tiempo
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UN BUEN PRIMER DEBERIA TENER... 18-24 pb 40-60% GC Distribucin balanceada de dominios ricos en G/C y A/T Tm que permita Tann de 55-65 C Sin estructura secundaria interna (Hairpins) UN BUEN PAR DE PRIMERS DEBERIA TENER Tm similares
No auto complementariedad (>3 pb) (especialmente en su extremo 3)
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PROBLEMA DE LOS DMEROS DE PRIMERS Primers unidos tb son amplificados en el PCR Esta reaccin compite con el PCR correcto y podra afectar a la eficiencia de la reaccin
SOLUCIN: Reducir autocomplementariedad Buen diseo
Reducir el tiempo de annealing
HotStart Touch Down
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Reducir la fluorescencia de los DPs
Usar sondas especficas
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DISEO COMPUTARIZADO Softwares gratis en Internet Primer3 FastPCR NetPrimer mFold Softwares comerciales
Primer Select (DNASTAR)
Primer Express (ABI) LC Probe Design (Roche)
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PLAN DE TRABAJO EN EL DISEO DE PRIMERS No
Encontrar Secuencias Diseo Primer Seleccionar Primers
OK
Si
Run PCR y
NCBI o Celera
Tm Tamao ampl Est Secund Especif
Electroforesis
en gel para chequear especificidad
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Dim Prim
DISEO DE SONDAS TaqMan
Tamao del amplicn 70-150 pb
Tm de la sonda 68-70 C
No G en extremo 5 Evitar extructura secundaria Evitar dimerizacin con primers Elegir secuencias con mas Cs que Gs
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EFICIENCIA DEL PCR Y CURVA DE CALIBRACIN
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AJUSTE DE LA LNEA DE BASE
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AJUSTE DE LA LNEA THRESHOLD
Nivel de Fluorescencia donde las muestras puedan ser comparadas
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LAS DIFERENTES FASES
Crec Exponencial
Plateau
Seal > background
MUESTRAS DEBEN SER COMPARADAS EN ESTA FASE
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Ct
Threshold line
Ct: ciclo terico donde las muestras intersectan a la lnea threshold Cp: propio del sistema LightCycler (mximo de la segunda derivada)
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FLUORESCENCIA VS NMERO DE COPIAS
D Threshold line
Muestra A > Muestra B > Muestra C > Muestra D La seal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de DNA (prod PCR) en la muestra La seal de fluorescencia de la muestra A comienza a incrementar antes que la muestra B La muestra A tiene mayor nmero de copias al inicio (NoA > NoB)
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CURVA ESTNDAR Estndars = templados diludos de concentracin conocida Curva estndar = Ct de cada muestra estndar es graficada en funcin de su concentracin conocida
Usada para determinar concentraciones de muestras desconocidas
Pend = entrega la eficiencia del PCR 10-1/pend = 1 + eficiencia Interc = # ciclos para detectar una molcula
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CURVA ESTNDAR FLUJO DE TRABAJO
PCR
Purificacin del Producto
Remover los DPs, fluorforos y
Determinacin de la concentracin Calcular la conc midiendo la A260nm y el largo del amplicn
Diluir y usar
Diluir en un amplio rango
componentes del
buffer
(106-10 copias/uL)
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ECUACIN DE LA AMPLIFICACIN
NCt = No (1+E)Ct
Nct = nmero de molculas luego de Ct ciclos de amplificacin No = nmero inicial de molculas
= eficiencia del PCR
Ct = ciclo threshold
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN UN GEN, DOS MUESTRAS
(NCt)A = NoA2CtA (NCt)B = NoB2CtB
A B
(NCt)A = (NCt)B NoA2CtA = NoB2CtB NoA/NoB = 2DCt
100 % Eficiencia
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN
UN GEN, DOS MUESTRAS EFICIENCIA DEL PCR
NoA / NoB = 2DCt
Eficiencia de PCR 100%
A B
NCt = No (1+E)Ct
NoA / NoB = (1+E)DCt
CMO DETERMINAR LA EFICIENCIA ?
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ESTIMACIN DE LA EFICIENCIA DEL PCR
Series de dilucin
E = 10 -1/pend -1 * 100
Pend ~ 3.3 100% eficiencia
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EFICIENCIA DEL PCR Expresada usualmente en porcentaje Muchos qumicos inhiben al PCR Cada muestra biolgica es nica en su composicin INHIBICIN
AFECTA A LA CUANTIFICACIN
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS
referencia
target
Dos muestras son corridas y dos genes son medidos. Por ejemplo, un gen target y un gen de referencia (housekeeping) o un control endgeno (spike)
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS
referencia
target
(NCt)Atarg = Notarg2CtAtarg (NCt)Aref = Noref2CtAref (NCt)Atarg (NCt)Aref
(NCt)Atarg = k * (NCt)Aref
NoAtarg/NoAref = k * 2DCt muestra A NoBtarg/NoBref = k * 2DCt muestra B
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS
referencia
target
NoAtarg/NoAref = k * 2DCt muestra A NoBtarg/NoBref = k * 2DCt muestra B Eficiencia 100%
(NoA)targ/(NoA)ref = k * (1+Eref)Ctref/(1+Etarg)Cttarg muestra A
(NoB)targ/(NoB)ref = k * (1+Eref)Ctref/(1+Etarg)Cttarg muestra B
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Todo en la vida es Relativo !!!
"When you sit with a nice girl for two hours, it seems like two minutes. When you sit on a hot stove for two minutes, it seems like two hours; that's relativity."
Albert Einstein
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RT-PCR Quantification
Influencing Factors
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Tipos de Cuantificacin
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Tipos de Cuantificacin
Cuantificacin Absoluta
Con estndares externos
Efectos desconocidos de los inhibidores del PCR
Con estndares externos y un control interno
Verificacin de resultados en capilares individuales
No hay una correccin de los factores que influencian un PCR
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Tipos de Cuantificacin
Cuantificacin Relativa
RNA blanco en una muestra RNA referencia en una muestra
Radios son normalizados valores son corregidos para cada muestra
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Principio de la Cuantificacin Relativa
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Cuantificacin Relativa
Efecto de diferencias en la eficiencia del PCR
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DUDAS Y CONSULTAS ?
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