ADENOVIRUS
Brian Villamizar Prez
Generalidades
dsDNA(13%), icosaedrico, desnudo 60-90nm de dimetro
Cpside constituida por 252 capsmeros, 87% del peso. 240 son hexonas (lados de superficie icosaedrica) 12 son pentonas. (vrtices) Fibra: glicoproteina que protruye desde el centro de cada penton Protenas del ncleo:
Tomado de: [Link]
Protena terminal (TP): al final del genoma y sirve como cebador para la replicacin. Protenas bsicas V, VII: similares a las histonas, estabilizan el ADN. Protena Mu: protena pequea transactivadora.
Taxonoma
Adenoviridae
Atadenovirus
Rumiantes, aves
Aviadeovirus
Aves
Mastadenovirus
Mamiferos: Simios, Humanos, Ratones, Caballos Cerdos.
Siadenovirus
Reptiles, Aves
Tomado de: [Link]
En los seres humanos, hay 52 especies patogenas aceptados de adenovirus humanos (HAdV-1 a 52) en seis grupos (adenovirus humano de la A la F):
Los diferentes tipos/serotipos se asocian con diferentes condiciones: Enfermedades respiratorias (principalmente HAdV-B y C)
Conjuntivitis y Cistitis (HAdV-B, D, E) Gastroenteritis (HAdV-F tipos 40, 41, HAdV-G Tipo 52, HAdV-E)
Genoma
El ncleo del virin esta formado por un dsADN lineal 30 38kpb con capacidad para codificar entre 30-40 genes. Protena terminal: acta como primer iniciando replicacin. Infectante! Replicacin y ensamblaje exclusivamente nuclear
Tomado de : Principles of Molecular Virology, 4~ ed., Alan J. Cann, Elsevier Academic Press, ELSEVIER INC 200 Wheeler Road, 6 th floor,Burlington, MA 01803, USA
Organizacin genoma Adenovirus
Transcripcin del Genoma de Adenovirus
Protenas Mayores
E1A protena necesaria para activar la transcripcin de los dems genes virales y es oncoproteina.
E1B inhibe la apoptosis mediada por p53 promoviendo su degradacin.
La flechas indican la posicin de los exones en el genoma virico, que se unen por cortes y empalmes (<<Splicing)(ligasaDNA)
E2 codifica protenas necesarias para la replicacin viral: ADN polimerasa, protena terminal, etc. E3 codifica protenas que ayudan a escapar al sistema inmune, inhiben la presentacin de fragmentos antignicos de CMH II. Limita rta TNF E4 codifica diversas protenas que silencian genes endgenos, regulando el transporte de ARN mensajeros fuera del ncleo
Ciclo Viral
Adhesin Receptor CAR(coxsackievirusadenovirus receptor) solo en clulas epiteliales.
Interaccin pentona con integrinas celulares(V3, V5)
ENDOCITOSIS
ESCAPE Y DESNUDAMIENTO
pH causa desnudamiento Pentonas act. toxicas rompen endosoma
Eventos Iniciales
Todo lo que sucede antes del inicio de la replicacin del DNA viral
Trascripcin de protenas E
Inducir fase S celular Evitar muerte prematura de la clula
Inactiva protenas supresoras de Cto. P53
Generar sus propias polimerasasADN
REPLICACIN
Helicasa
Pol DNA
ENSAMBLAJE
El ensamblaje de las partculas de adenovirus tiene lugar en el ncleo.
Capsomeros de autoensamblan y forman cpsides vacas Se generan ms protenas estructurales de las necesarias y el exceso se acumula en el ncleo formando cuerpos de inclusin
80% DE CAPSOMEROS Y 90% DNA VIRAL NO SE USAN
SALIDA DE LA CELULA
Prot E3: se acumula durante infeccin, induce lisis en fase tarda por: Activacin de mecanismos de autofagia (lisosomas digieren orgnulos) Activacin de caspasas (inducen apoptosis)
Tomado de: Crystal Structure of Human Adenovirus at 3.5 Resolution. (2010) Science 329(5995): 107 -1075 doi: 10.1126/science.1187292
Epidemiologia
Prevalentes en la poblacin peditrica: 10% de las infecciones del tracto respiratorio 5-20% de casos de gastroenteritis aguda
= Brasil Frecuencia, severidad Los tipos virales, ms peligrosos son : el 4, 7 y 13, infecciones ms severas asociadas a casos fatales. Inmunocomprometidos Ancianos Militares
Clulas Blanco
Poseen receptor que permite el ingreso de adenovirus CAR((coxsackievirus-adenovirus receptor) Codificado en gen CXADR, Cromosoma 21, Smbolos: CXADR; CAR; CAR4/6; HCAR
Funciona como molcula de adhesin celular a glicoprotenas como: Fibronectina, agrina, laminina 1-y tenascina-R Persistente en tejido linfoide
Efectos Citopaticos
Infeccin ltica
Se da el ciclo replicativo completo. Se producen entre 10,000 y 1'000,000 vp/clula 1-5% son infecciosos Infeccin crnica y se da en clulas linfoides. Dicha infeccin puede reactivarse en pacientes inmunocomprometidos. Favorece la produccin de citoquinas inflamatorias (IL 8, , FNT alfa), amplificacin del proceso inflamatorio
Infeccin latente
Transformacin oncognica
Se dan slo los pasos iniciales de la replicacin viral. Algunos Productos de los genes tempranos virales inhiben a los antioncogenes Demostrado solo en animales
PATOGENIA
Limitada en G. regionales
Tejido linfoide y adenoide Placas de peyer
Inmunocompromiso
Espectro clnico infecciones por ADENOVIRUS
Asintomticos
Tomado de: Fisiopatologa de las Infecciones por Adenovirus GUILLERMO BERNAOLA*, WALTER LUQUE*Paediatrica Asociacin de Mdicos Residentes del Instituto de Salud del Nio Volumen 4, N 2 Oct. 2001 - Mar. 2002 Pgs. 41 - 47
Modo de trasmisin
Horizontal: Area, fomites Oral: Oro-fecal(meses), agua no potable(piscinas) No hay reservorio animal
Hospederos susceptibles
Infantil 6meses Ancianos Inmunocomprometidos Personal Hospitalario Hacinamiento: Militares, etc
Incubacin 4-14 das
Sntomas 5-12 das
Sndrome respiratorio
Faringitis febril aguda
Otras como: resfriado, laringitis, laringo traqueitis, bronquiololtis
Sndrome de Coqueluchoide
Enfermedad similar a tos ferina Rinorrea, estornudos, lagrimeo Tos fuerte paroxistica repetitiva, emetica, cianosante
Progreso a neumona
GASTROENTERITIS
5-20% de GE en nios, 2 puesto luego de rotavirus.
Diarrea es acuosa y mayor volumen que en otras infecciones gastrointestinales
Adenovirus entricos : no producen nasofaringitis o queratoconjuntivitis como sntoma primario a diferencia de los otros adenovirus que producen nuseas, vmito, diarrea, dolor abdominal y fiebre.
COJUNTIVITIS
Sntomas: Ardiente Sensacin de cuerpo extrao Eritema conjuntival
Acompaada de: Fiebre, faringitis, otitis, diarrea, vmitos
Autolimitada: Resolucin 10 das
Diagnostico
Estrictamente clnico para decisiones de aislamiento
Gold Estndar. Cultivo celular, 2 -20 das IFI, ELISA: sensibilidad, 60% de positivos PCR: mas sensible, laboriosa, costosa Serologa(aglutinacin, fijacin del complemento): ausencia de antgeno comn, solo para confirmar serotipo de aislamientos Inmunocromatografia: 15minutos, 70%sensibilidad 95 %especificidad. (pevencion de infecciones intrahospitalarias)
Inmunidad
Resistencia: por Ig circulante Ig maternos protegen hasta 6 meses La infeccin provoca inmunidad protectora y prolongada No hay proteccin cruzada
A 4-5 aos el 50% de los nios han adquirido anticuerpos propios contra adenovirus entricos
TRATAMIENTO, PREVENCIN Y CONTROL
No hay tratamiento antiviral efectivo
Tratamiento sintomtico
Aislamiento para evitar infeccin nosocomial
Lavado de manos Consumir agua potable
Vacuna
En investigacin. Vacuna oral: virus vivo atenuado (excrecin hasta 28 das) Personal militar de 17 50aos Serotipos 4 y 7
GENERACIN DE UN NUEVO ADENOVIRUS DE REPLICACIN CONDICIONADA (CRAd) DIRIGIDO POR CICLOOXIGENASA-2 Y EXPRESANDO INTERFERN PARA LA TERAPIA DEL CNCER DE PNCREAS Descifrado por: Brian Villamizar P.
INTRODUCCIN
El adenocarcinoma ductal pancretico es una enfermedad altamente letal, con un estimado de 43.140 nuevos casos y casi con 37.000 muertes en 2010. (85% de mortalidad). La gravedad se debe a la ubicacin profunda retroperitoneal del pncreas y porque la enfermedad en estadio temprano no tiene sntomas especficos, lo que hace poco comn para este cncer que diagnosticarlo en una etapa quirrgicamente resecable (extirpable).
El Adenovirus oncoltico es un vector ampliamente estudiado en terapia contra el cncer. En particular, los adenovirus de replicacin condicionada (Crads), a partir de los cuales se han desarrollado adenovirus oncolticos diseados especficamente para replicacin restringida en las clulas cancerosas.
Sin embargo, los ensayos clnicos realizados tambin han puesto de manifiesto varias desventajas significativas de la terapia con CRAds, como sigue: Infeccin limitada en clulas con cncer Distribucin intratumoral limitada Especificidad limitada para clulas de cncer con efectos fuera de objetivo, incluida la hepatotoxicidad y immunogenicidad Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de desarrollar vectores para la terapia del cncer con mayor eficacia y la virulencia dirigida hacia el cncer de pncreas, y que al mismo tiempo posea una alta selectividad para las clulas cancerosas con la intencin de evitar el hgado y la toxicidad sistmica.
OBJETIVOS
Describir el diseo un vector viral que infecte selectivamente las clulas con cncer de pncreas, que se replique dentro de ellas, y libere cantidades teraputicas de IFN localmente para evitar efectos sistmicos
Evaluar:
Infectividad celular Lisis selectiva de clulas cancerosas Produccin y administracin local de IFN
MATERIALES Y METODOS
Lneas celulares
Lneas celulares de adenocarcinoma ductal de pncreas humano: AsPS1 S2VP10 S2013 MiaPaCa2 Panc1 HS766T
Clulas humanas de adenocarcinoma no microcitico de pulmn: lnea celular A549 Cox2 positivo Clulas humanas de cncer de mama lnea BT474 Cox2negativo Clulas de carcinoma epidermoides lnea A431 Cox2neg
Obtenidas a partir de la American Type Culture Collection (Manassas,VA).
Clulas BT474 en el medio Instituto memorial Roswell Park suplementado con FBS al 15% e insulina bovina (Life Tech, Rockville,MD) Clulas 911 (una especie de regalo del doctor Van Der Eb, Leiden University, Netherlands) se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 5% Clulas Endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron a partir de ATCC y cultivadas en medio EGM-2 (Cambrex Biosciences, Walkersville, MD).
Se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) Suplementado con suero bovino al 5%
Todos los medios se suplementaron con penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100G / ml).
Animales
Ratones hembra atmicos desnudos de 6 a 8 semanas de edad. (Nacional del Cncer Instituto de Frederick, Frederick, MD)
Todos los animales recibieron atencin humana con base en los lineamientos establecidos por la Asociacin Veterinaria Americana. Todos los protocolos experimentales con animales vivos fueron aprobados por la comisin institucional de Empleo y Cuidado de Animales y de la Universidad de Minnesota.
Vectores Adenovirales
Recombinacin homologa:
Delecin E1 Modificacin Fibra: Integrinas (arginina-glicina-asprtico [RGD] fibra) Ad3 receptor (5/3 de la fibra) RGD (RGDCMV-Luc), fibra Ad5/Ad3-chimeric (5/3CMV-Luc), fibra nativaAd5 (Ad5CMV-Luc). Luciferasa se utilizara para analizar mejora de infectividad Expresin de IFN: plsmido fue proporcionado amablemente por Dr. Aoki (Divisin de
Gentica, Centro Nacional del Cncer de Investigacin Institute, Tokio, Japn) Promotor temprano (CMV)
La infectividad mejorada con COX2 controlada por promotor CRAds se gener utilizando recombinacin homloga en E. coli
La sobrexpresin de ADP oncolticos, luciferasa ter y cassete de expresin de IFN se construyeron utilizando pShuttle E3ADPKanF2 cloning.
Herramienta Biologia molecular para diseo y construiccin de adenovirus recombinantes.
Control del vector
Evidencia de replicacin no selectiva: Adenovirus Silvestre 5
Propagacin viral
Todos los virus se propagaron en la lnea celular 911
Se purificaron por doble ultracentrifugacin en gradiente de densidad de CsCl, seguido por dilisis frente a tampn fosfato salino (PBS) con 10% de glicerol. Los vectores se titularon en placa , y el numero de partculas virales (vp) se midi espectrofotomtricamente en absorbancia a 260 nm.
Almacenamiento
T - 80 C hasta que est listo para su uso. Estructura viral se confirma por PCR para genes que codifican Cox2 y genes de fibra modificada.
Anlisis in vitro de la infectividad por expresin de luciferasa
Las clulas (5*104 clulas / pocillo) cultivadas en placas de 24 pocillos fueron infectadas con 100 partculas virales (VP) por clula durante 48 horas.
Lisis con 100L de buffer de lisis (Promega, Madison, WI)
Se determin la actividad de Luc con el sistema de ensayo de luciferasa (Promega).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Deteccin de replicacin Cox2 promotor dependiente CRAds
Las clulas se cultivaron (5*104 clulas/pocillo) se infectaron con 0.1 vp /clula en 100L DMEM. El medio de infeccin fue remplazado con 1 ml de medio 2 horas ms tarde y las clulas se incubaron durante 2 das. Luego, las clulas se lisaron con cultivo buffer de lisis (Promega)
Se determino la actividad de luciferasa con el Luciferase Assay System (Promega).
Los experimentos se realizaron por triplicado y se estandarizaron las concentraciones de protena cuantificada por ensayo de protenas (Bio-Rad, Hercules, CA).
Anlisis cuantitativo capacidad de lisis de clulas cancerosas. in vitro
Las clulas se sembraron en placas de 96 pocillos a 3.000 clulas/pozo, entonces se infectaron con vectores en diferentes diluciones /100 L de medio apropiado. Las clulas se incubaron bajo condiciones estndar. El nmero de clulas vivas se midi colorimtricamente en tiempos seriados segn Ensayo de proliferacin en solucion acuosa(Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Muestras de tejidos humanos
Aprobacin por la Comit de tica institucional de la Universidad de Minnesota
Reseccin por biopsia frescas de: Adenocarcinoma ductal pancretico Pncreas normal adyacente Hgado normal
Cortes de 200 m de espesor (Krumdieck Tissue Slicer; Alabama Specialty Products, Inc, Munford, AL).
Infeccin viral de cortes de tejido humano
Los tejidos (200 m de espesor) se sembraron en placas de 12 pocillos que contienen: 1 ml/pocillo de medio, as: FBS al 50% F12 de Ham (Mediatech) FBS al 50% DMEM con 1% penicilina/estreptomicina y 1% de anfotericina B FBS al 15% con 10g/ml de dexametasona (glucocorticoide AIES)
A los 4 das el ADN viral se extrajo de las rebanadas utilizando un QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD). Numero de copias Virales se cuantific mediante SYBR Green rt-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) La infeccin se realiz a una razn de infeccin de 100 vp/clula. # de clulas se estima relacionando el peso medio celular y el peso total del corte.
Los medios de infeccin fueron remplazados a las 3 horas con medios apropiados 50% en cultivo de FBS.
Todos los experimentos fueron realizaron por triplicado.
Imgenes bioluminiscentes In vivo de la replicacin de CRAds en un modelo de xenoinjerto de ratn
Clulas HS766T y A431 (1 *106) se inyectaron en ambos flancos de ratones desnudos
Cuando los tumores alcanzaron 6 a 10 mm de dimetro, una dosis nica de virus 1010vp/50L de PBS, se inyect por va intratumoral Imgeneologia bioluminiscente se realiz bajo anestesia con isoflurano 2% y previa inyeccin intraperitoneal de 3 mg de D-luciferina (Molecular Imaging Products, Bend, OR, Sistema de imagen in vivo)
Clulas A549 (1* 106) se inyectan. tumores alcanzado 6 a 8 mm de dimetro, Una dosis nica de 1010 vp/50L PBS se inyect sistmicamente a travs de la vena de la cola. Deteccin Bioluminiscente
Mtodos estadsticos
El anlisis estadstico de los efectos virales in vitro e in vivo se realiz con Excel (Microsoft, Redmond, WA). La Prueba t de Student de medias se utiliza con un valor P .05 considerado estadsticamente significativo. Los datos son expresan como media 3 DS.
RESULTADOS
Estructura de los vectores adenovirales
1 y 2 incapaces de replicar por la supresin de la regin viral E1 viral , diseado s para expresar el gen IFN citotoxicidad, bajo control de promotor CMV. Estos virus tienen ya sea el RGD o 5/3 para modificacin de fibra de cpside mayor infectividad hacia las clulas diana (cambio en tropismos CAR ADP3) 3 y 4 son el oncolticos de replicacin competente en los que la actividad celular Cox2 de las clula infectadas se usa para desencadenar la expresin de genes E1 y por lo tanto permitir que el virus replique. 5 y 6 Replicacin no selectiva. remplazo E3, sobrexpresin ADP, IFN y Luc, fibra modif
7 y 8 Expresin de E1 controlada por COX2 (especificidad a Tx tumoral), E3 cambiada por ADP, IFN, fibra modif.
Las modificaciones de fibra RGD y 5/3 significativamente aumentan la infectividad adenoviral en PDAC
RGDCMV
Salvaje
5/3 Ad3 receptor
Los vectores con fibra modificada mostraron mayor infectividad en todas las lneas celulares en comparacion con genotipo salvaje, gen reportero Luc.
El control de la replicacin por promotor Cox2 evita replicacin en poblaciones celulares Cox2nonexpressing
Capacidad de la Cox2 CRADs de replicarse selectivamente en el tejido canceroso.
El constructo viral especfico controlado por el promotor Cox2 muestra selectividad y persistencia en un modelo de xenoinjerto de cncer
CRADs controlado por Cox2 muestra replicacin selectiva especmenes PDAC ex vivo de humanos, y no en los tejidos normales
IFN expresado por CRAds tiene un efecto directo tumoricida independiente de la replicacin viral
Los resultados indican un aumento estadsticamente significativo en la capacidad de destruccin celular con ttulos crecientes de virus y por lo tanto mayores cantidades de IFN viral derivado
Aumento de la eficiencia oncoltica de CRAds, expresando IFNy controlado por Cox2 in vitro
Adenovirus (5/3Cox2CRAdE3ADP-IFN) representa el ms avanzado CRAds, posee accin antitumoral mltiple, efectos integrados mediante la modificacin de fibra, y la sobrexpresin de IFN y ADP
Alcanza la capacidad celular letal equivalente al de su potente contraparte no selectivo, 5/3Wt E3ADP-IFN
DISCUSIN
5/3Cox2CRAdE3ADPIFN
Se presento aqu un CRAD IFN-expresin que ha sido diseado con 3 requisitos fundamentales : Selectividad estricta para el cncer de pncreas y evasin de la replicacin en el hgado. (control COX) Incorporacin de caractersticas avanzadas de diseo para una mayor potencia. (sobrexpresin masiva de ADP e IFN localizada) Modificacin del tropismo viral por alteracin gentica de la cpside. (el 5/3 y RGD para modificar la fibra y superar la deficiencia de CAR en celulas de cncer de pncreas)
Se sigue realizando un trabajo activo para caracterizar accin este virus in vivo en modelos animales inmunocompetente, y en ltima instancia, se espera verlo desplegado para el tratamiento de pacientes humanos. Esta estrategia es una gran promesa para expandir el uso de la quimioterapia con IFN-alfa en esta enfermedad tan fatal.
