EPIFLUORESCENCIA

EL EQUIPO

LOS FILTROS

QUE ES?

Las molculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tincin celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepcin de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo. En la imagen se muestra el esquema de funcionamiento de un microscopio de epifluorescencia, en el que la luz incide sobre la preparacin a travs de las lentes del objetivo. Este microscopio, de gran poder de resolucin tiene que tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la luz ultravioleta. En el esquema se sitan los tres elementos caractersticos del microscopio de fluorescencia : primer filtro de corte o filtro de excitacin. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema est seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra. segundo filtro de corte o filtro de emisin. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caos deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. En el esquema los filtros que se han indicado seran los que emplearamos la fluorescencia asociada al isotiocianato de fluorescena, molcula fluorescente ampliamente utilizada en microscopa de fluorescencia acoplada a anticuerpos. Existen un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos .

La fluorescencia es

La fluorescencia es el fenmeno ptico que ocurre cuando la luz es absorbida por una sustancia cuando se encuentra expuesta a radiaciones ultravioletas, rayos catdicos o rayos x-, creando as una excitacin molecular que hace que dicho material re-emita la luz en una longitud de onda mayor a la longitud incidente. As, las molculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada. La tincin molecular se basa en la utilizacin de colorantes fluorescentes, los cuales son detectados gracias al microscopio de fluorescencia. Este tipo de microscopa se fundamenta en el uso de filtros. El primer filtro selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo. El microscopio fluorescente para epifluorescencia. La tcnica de fluorescencia para microscopia con epiiluminadores (iluminador episcpico) est basada en la adaptacin del iluminador vertical. La luz incide sobre la muestra a travs de las lentes del objetivo, que permiten el paso de la luz ultravioleta exentos de tensin molecular.

FILTROS Y TIPOS

Filtros espectros imagen WU Se detecta la emisin de DAPI pero no la de FITC por su baja excitacin. WIBSe detecta la emisin de FITC pero no la de DAPI pues no es excitado. FITC & DAPI El filtro de dos bandas FITC y DAPI permite la correcta excitacin y deteccin simultnea de FITC y DAPI. Coleccin de espectro e imagen

EL MICROSCOPIO PARA EPI

El microscopio para epifluorescencia consta de los siguientes elementos: 1- Una fuente de luz lampara halogena, iluminacion led que debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta, 2- El microscopio 3- Un sistema de filtros. El sistema de filtros y el espejo dicroico son elementos caractersticos del microscopio de fluorescencia: 1. Filtro de excitacin: diseado para dejar pasar slo aquellas longitudes de onda que se excitan con la fluorescencia 2. Espejo dicroico: componente ptico que separa la luz de excitacin de la fluorescencia. Debido a su diseo, tiene la propiedad de reflejar selectivamente la longitud de onda ms corta, excitando la radiacin y trasmitiendo la longitud de onda ms larga, fluorescente. 3. Filtro de barrera: es el ltimo componente de un cubo fluorescente, que transmite la emisin fluorescente de las longitudes de onda a la vez que bloquea las longitudes de onda de excitacin. Estos filtros son vidrios de color o filtros de interferencia que poseen propiedades de transmisin de filtrado. Adems, previenen que la luz de excitacin alcance el ojo del observador. 4. Lmpara de mercurio: consiste de dos electrodos sellados dentro de un bulbo de vidrio en alta presin, el cual contiene mercurio. Cuando la fuente de poder se enciende, un pulso de alto voltaje es enviado hacia los electrodos, ionizando el gas en el bulbo, generando as la ignicin de la lmpara.

EL MICROSCOPIO PARA EPI

Los filtros Existen un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos. Para una adecuada observacin del fenmeno, es de gran importancia seleccionar el conjunto de filtros apropiado para la observacin. Es posible distinguir entre tres grandes tipos de filtros, los longpass, los bandpass, y los shortpass. Los filtros longpass slo permiten el paso de longitudes de onda que estn por encima de un determinado valor, evitando, pues, que la luz de longitudes de onda menor pase. Estos filtros se deben utilizar cuando la tcnica requiera una emisin mxima, y no sea necesaria la diferenciacin espectral. Por otra parte, los filtros bandpass slo permiten el paso de la luz de un rango determinado de longitud de onda. Estos filtros son tiles para observar un determinado tinte en un espcimen de mltiples tintes. Por ltimo, los filtros shortpass se definen por su capacidad de transmitir una banda espectral estrecha de longitud de onda corta, bloqueando las ondas de radiacin largas; es decir que dejan pasar el espectro por debajo de un valor determinado bloqueando al espectro sobre dicho valor. Caractersticas tcnicas: Este equipo posee un sistema excepcional que mejora los anlisis con tcnicas de fluorescencia, permitiendo observar imgenes con extraordinaria claridad y gran contraste. Combinando la ptica del microscopio con un nico diseo para epifluorescencia, se obtiene un brillo y una definicin ptima en un amplio campo visual.

El microscopio
As, el microscopio para epifluorescencia c se convierte en una invaluable herramienta de investigacin, debido a las ventajas que presenta que no se encuentran en otro microscopio ptico. Este equipo cumple normas ce, iso9001 e iso14001. Su sistema de epifluorescencia es intercalable entre estativo y cabeza, y est compuesto por un alojamiento para 3 filtros interferenciales (dos opcionales) y un paso de luz libre, deslizable con anclaje en la posicin seleccionada; can y caja de lmpara donde se halla el diafragma de campo centrable. Posee un portafiltros deslizable para alojamiento de filtros accesorios. Adems, la caja de la lmpara posee una lente condensadora de difusin, y el alojamiento de la lmpara hbo 100 (alta presin de hg) tiene incorporado los correspondientes comandos para su centrado y ajuste. Posee un filtro de barrera, objetivo con luz para centrar el sistema, y filtro interferencial de excitacin para fitc. Tiene un sistema de alimentacin con switch, un pulsador de ignicin y un cuenta horas digital seteable. Adems, cuenta con un equipo para epifluorescencia invertido (ae 30), el cual combina las ventajas del sistema de epifluorescencia con las de un microscopio invertido. Preparado de inmunofluorescencia: tcnica para campilobacterosis genital El trmino conjugado, de uso corriente en los laboratorios, se refiere, en este caso, a la fraccin gamaglobulina de un suero hiperinmune anti campylobater fetus venerealis, marcada con un colorante fluorescente: isotiocianato de fluorescena. Acondicionamiento y uso del conjugado: El conjugado se encuentra en estado puro y liofilizado desde su elaboracin. Por lo tanto lo primero que tiene que hacer es reconstituirlo con 1 ml de agua destilada estril (provista en el kit) y fraccionarlo colocando 100 L en cada vial provisto. Luego debe colocar todos los viales menos uno en el freezer. Con los 100 L que ha dejado sin congelar, debe hacer la titulacin correspondiente para el microscopio en uso. Una vez titulado lleve el conjugado a la dilucin de trabajo y conserve durante su uso entre 4 a 8 C. Cuando necesite descongelar otro vial, conteniendo 100 L del conjugado puro, llvelo directamente a la dilucin de trabajo obtenida y selo sin volver a congelar.

DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO

EL EQUIPO LED EPI

MONTAJE DE LA LAMPARA

Fluorocromos

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotn de una longitud de onda determinada cuando captan (son excitados) por un fotn incidente de una longitud de onda caracterstica. Por ejemplo, el isotiocianato de fluorescena tiene un mximo de absorcin a 490 nm y un mximo de emisin a 520 nm. Uno de los problemas de la utilizacin de fluorocromos en microscopa de fluorescencia es la prdida de sta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta tcnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Una muestra que ha perdido parte de la fluorescencia presenta regiones 'oscuras' (como en el ejemplo). Se han desarrollado mtodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan : el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents') el uso de fluorocromos con poco 'fading' el empleo de luz de excitacin de menor intensidad la reduccin de la concentracin de oxgeno en el espcimen el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cmara, pelcula,...) para reducir al mximo el tiempo de exposicin. el empleo de mecanismos de medicin de la exposicin ptima (automtica) para reducir la iluminacin al mximo..

Fluorocromos

Los reactivos 'antifading' son molculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisin fluorescente. Se trata de molculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las molculas de fluorocromo. Adems son especficas de fluorocromo pues los electrones que pueden donar slo sern donables si se encuentran en niveles de energa ligeramente superiores a los propios del fluorocromo en reposo. A continuacin se muestran dos esquemas en los que se aprecia el efecto protector de dos 'antifading' sobre dos fluorocromos. Estabilidad de la fluorescencia de la fluorescena (FITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado citokeratinas con FITC con y sin P- fenilenediamina. Estabilidad de la fluorescencia de la rodamina (TRITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado microfilamentos con faloidina-TRITC con y sin n- propil galeato. Los reactivos antifading ms empleados son los siguientes : p- fenilenediamina. Es el reactivo ms efectivo para la conservacin de la fluorescencia de la fluorescena (FITC). Tambin efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tie de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso. DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octano). Muy efectivo para la fluorescena, aunque menor que la p- fenilenediamina. Es menos sensible a la luz y es mucho menos txico. n- propil galeato. Es el agente ms efectivo para la rodamina, aunque tambin es efectivo para la fluorescena. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. 2- mercaptoetilamina. Se emplea para la observacin de cromosomas y muestras de DNA teidas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA

El microscopio Primo Star iLED ya est disponible con tres accesorios de fluorescencia adicionales que permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y Rhodamine/Cy 3. De este modo puede emplearse un microscopio de LED para aplicaciones de fluorescencia simple en la formacin, en procedimientos habituales y en investigacin bsica. Este dispositivo es especialmente robusto y fcil de usar, y ofrece una sobresaliente relacin precio/rendimiento, gracias en gran medida a la fuente lumnica econmica, duradera y de gran ahorro energtico que ofrecen los El microscopio LED. Especialmente en el caso de la formacin, la excitacin de fluorescencia mediante la iluminacin ya est por LED resulta muy til al no ser necesario contar con perodos de calentamiento o refrigeracin, a diferencia de lo que ocurre con la excitacin producida mediante lmparas de vapor de disponible con mercurio. Adems, ya no es necesario reajustar las lmparas de excitacin, por lo que el usuario tres accesorios puede comenzar a trabajar en el mismo momento en que se enciende la fuente de iluminacin. El accesorio de fluorescencia del iLED cuenta de unos prcticos adaptadores oculares que con fluorescencia permiten efectuar labores de microscopia de fluorescencia aunque no se est en un cuarto oscuro (por ejemplo, en un auditorio). El microscopioque adicionales dispone de una palanca que permite pasar de un uso de campo claro a uno de fluorescencia.

Primo Star iLED

permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y

CONTRASTE DE FASE + EPI

Tcnica estructura de los grupos pticos imagen Contraste de fases + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la de contraste de fases y la tercera a la combinada.

Tcnicas de anlisis

En la tcnica de epifluorescencia se tom un volumen entre 4 y 5 mL de cada muestra durante cada medicin, se pas por un filtro de 0,45 mm para separar las partculas ms grandes, y se procedi a fijar con formol al 40% hasta obtener un volumen final del 2% de formol. Luego se tieron las clulas con 4 a 5 gotas de DAPI (4,6diamino-2-fenilindol) durante 10 min, se filtr la muestra al vaco en filtros de policarbonato negro de 0,22 mm y posteriormente se realizaron los contajes bacterianos directamente al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se observaron de color blanco sobre un fondo negro, ya que el DAPI se incorpora al material gentico de la clula, emitiendo fluorescencia al excitarse en presencia de luz ultravioleta (365 nm) (Porter y Freig 1980).

Tincin de epifluorescencia

Tincin de epifluorescencia. Se trata de una tcnica de tincin empleada para el recuento de microorganismos y para estimar su tipo de metabolismo. Cuando las clulas se encuentran en fase exponencial de crecimiento, se tien de color naranja, al alcanzar la fase estacionaria, algunas comienzan a aparecer de color verde, indicativo de una parada en la sntesis de protenas. Preparacin de la muestra Se toma una muestra de 2ml de un cultivo y se aade formalina al 40% para obtener una disolucin final de formalina al 2%. A continuacin se agita durante 2 min. para evitar la agregacin celular. Ejemplo: suponiendo una muestra de 3 ml, para conseguir la disolucin final al 2% se opera de la siguiente manera: 3 ml 2% = x ml 40%,

siendo x el volumen de formalina al 40% que hay que aadir a los 3 ml de muestra.

Preparacin del naranja de acridina

Preparacin del naranja de acridina Naranja de acridina, 0.025g. Agua ultra pura 1000ml , formaldehdo 60ml Se coloca un disco de celulosa sobre el filtro de vidrio de un kitasatos, con cuidado de que quede bien centrado, y se humedece con una o dos gotas de agua destilada. Hacer vaco durante 1 2 segundos para que el disco quede bien adherido al filtro de vidrio. Sobre el filtro de celulosa se coloca el filtro teido con Negro Irgalam (Millipore) teniendo cuidado de dejar la cara ms brillante hacia arriba. A continuacin se coloca el embudo metlico de la unidad de filtracin y se asegura con una pinza. Se aade el Naranja de acridina (2ml) teniendo cuidado de que no se filtra por s solo, lo que indicara que el embudo y la pinza no estn bien colocadas. A continuacin se aade una alcuota de 200 l de la muestra fijada con formalina al 2%, repartindose bien la muestra por todo el colorante, retomando varias veces con la misma punta de manera que no quede muestra en la misma. Esperar 2 minutos y filtrar a presin moderada; si el filtrado es demasiado lento es de suponer que el nmero de clulas ser superior a las 20-40 que se deben ver al microscopio en un campo. Cargar una jeringa con agua destilada y colocar un filtro Millipore 0,22m; este agua se utiliza para realizar tanto los lavados de la muestra como posibles diluciones. Se realizan tres lavados con agua destilada filtrada por filtros millipore 0,22m (5 ml por lavado). Entre lavado y lavado es necesario desconectar la bomba de vaci. Sobre un portaobjetos se coloca una gota de aceite de inmersin Nikon de baja fluorescencia y se extiende con un cubre que slo se utilizar con tal fin. Sobre el aceite se coloca cuidadosamente el filtro de Negro irgalam asegurndose de que el filtro de celulosa queda sobre el de vidrio, ya que ste es reutilizable. A su vez se aade otra gota de aceite sobre el filtro de Negro irgalam y encima se coloca un cubre apretando con suavidad para que el aceite se distribuya homogneamente. Adems se aade otra gota de aceite sobre el cubre. La muestra est lista para ser observada por el microscopio. Se utiliza para ello un objetivo de inmersin 100 X. Si se observan pocas bacterias en un primer recuento, se puede primero filtrar la muestra, y luego aadir 1ml de naranja de acridina. Se espera 2 minutos y posteriormente se realizan tres lavados con 1ml de agua destilada filtrada. Tras el conteo del nmero de clulas observadas en 20 campos de visin se realiza la siguiente operacin: clulas/ml = (X F D)/V Donde: X: nmero medio de clulas por campo; F: factor de correccin del microscopio (n de campos por filtro); D: dilucin de la muestra, y, V: volumen de la muestra.

Mtodo para vinos con naranja de acridina

Preparacin del reactivo: Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en ebullicin 10 minutos, y se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estril. Tcnica: Tomar 40 ml de vino si es de lnea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo de la jeringa un portafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de poliamida, filtra la muestra Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm con una membrana de 0,22 micrones de poro estril. En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presin en la jeringa para que pase el colorante a travs de los dos filtros con sumo cuidado. Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante. Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rpido y una vez ocurrido esto colocar sobre un portaobjetos. Agregar sobre la membrana aceite de inmersin de alta calidad, veremos que la membrana se transparenta, colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra gota de aceite de inmersin. Asegurar una correcta inmersin de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la lectura de 10 campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro. Resultados: En vasija < 400 levaduras y < 600 bacterias por litros y en botella es de < 100 levaduras y < 200 bacterias Las levaduras y bacterias se tien de color anaranjado brillante sobre un fondo negro, verde claro o amarillo

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION

ALEJANDRO CANGI AGOSTO 2010 MAG SRL