CITOGENETICA MOLECULAR

Blgo. Lus Carlos Lizrraga Vargas

Limitaciones de la Citogentica Convencional : Requiere metafases No siempre la calidad de las metafases es optima

Resolucin limitada (en el mejor de los casos 2-5 Mb )

Alternativa : Citogentica Molecular 1. FISH (Hibridacin in situ con fluorescencia) Requiere saber lo que se busca Tener la sonda adecuada Otras tcnicas: Requieren equipos muy sofisticados y apoyo informtico SKY (Cariotipo espectral multicolor, multifish) CGH (Hibridacin Genmica Comparada)

2.

Estrategias

Estas estrategias diagnsticas pueden ser resumidas en:

A. Hibridacin ( Southern blots,, hibridacin in situ,etc.). B. Amplificacin de material gentico del organismo patgeno (PCR, LCR, etc.)

Ensayos de Hibridacin
De cidos Nucleicos.
Southern blot. Hibridacin in situ (FISH) Microarray

Hibridacin de cidos nucleicos

Hibridacin molecular: Desnaturalizacin y Renaturalizacin.

Desnaturalizacin: la doble hlice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH 13)

Renaturalizacin o hibridacin molecular: reconstitucin de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrgeno interacciones dbiles: las afecta el pH, T, concentracin salina.

 Dos caractersticas importantes de estas

tcnicas :
Especificidad de la reaccin complementariedad de la sonda. dada por la

La sonda puede encontrar la secuencia complementaria en una mezcla de millones de molculas relacionadas pero no complementarias

TCNICA CITOGENETICA MOLECULARES FISH

Hibridacin in situ con fluorescencia (FISH)

La tcnica de hibridacin in situ est basada en la capacidad que poseen los cidos nucledos para hibridizarse entre s.
La tcnica de FISH permite la deteccin y localizacin de secuencias especficas de ADN sobre cromosomas, clulas o tejidos

FISH de metafase
La FISH se usa sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones especficas ms all de la capacidad de resolucin de la citogentica de rutina.
Sndromes de microdelecin actualmente diagnosticables mediante FISH Sndrome del maullido (cri-du-chat) Sndrome de Kallman Sndrome de Miller-Dieker Sndrome de Williams

Se ha hibridado con una sonda "de pintado" para el cromosoma 4. Uno de los cromosomas 4 de este paciente era anormal, pero era difcil determinar con la citogentica de rutina si tena una pequea delecin terminal en 4q o si era el resultado de una reordenacin ms compleja. Puesto que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su longitud y no hay material fluorescente en ningn otro cromosoma, esto sugiere que la anomala es una delecin terminal pequea. La metafase siguiente es del mismo paciente y confirma este diagnstico.

Esta metafase se ha hibridado con una sonda

diseada para la parte terminal del cromosoma 4q. Puesto que slo hay una seal verde, se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo q. Este caso es un buen ejemplo de cmo la citogentica de rutina y la FISH pueden usarse conjuntamente para diagnosticar con exactitud anomalas cromosmicas sutiles

FISH de interfase La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas.
La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las clulas.

PRUEBA DE ANEUPLOIDA
- Ncleos en interfase procedentes de clulas de fluido amnitico -Sondas de DNA diseadas para los cromosomas 13, 21 El ncleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo).

El ncleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y (rojo).

RESULTADO ?

MUESTRA A UTILIZAR
Muestras de citogentica: ncleos desnudos Improntas Tejido parafinado Tejido fresco

1- Sondas de cidos Nucleicos.

Sondas de AN: son fragmentos de ADNsc puros y
homogneos que permiten detectar una determinada secuencia blanco en una muestra, mediante su complementariedad de bases.

Marcadas radioctivamente Marcadas no radioctivamente ( Digoxigenina)

MARCAJE Y DETECCIN

Preparacin de la sonda. Una sonda es un segmento

de ADN marcado con biotina o fluorescena , que es complementario a la secuencia de ADN

La FISH utiliza tres tipos de sonda:

Sondas especficas de un locus:
sondas de fusin sondas split para la deteccin de translocaciones, deleciones o amplificaciones

Sondas alfoides o centromricas:

para la deteccin de alteraciones numricas con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra

Sondas para cromosomas completos:

son colecciones de sondas de un tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma.

TIPOS DE SONDAS
SONDAS CENTROMRICAS (CEP)

SONDAS DE LOCUS ESPECFICO (LSI)

SONDAS PAINTING (WCP)

SONDA TELOMRICA (TEL)

Centromrico

Locus especfico

Pintado cromosmico

Sondas Dual-fusion Patrn normal

Cromosomas en metafase Ncleo en interfase

Sondas Dual-fusion Translocacin recproca

Cromosomas en metafase Ncleo en interfase

Sondas Break-appart Patrn normal

Cromosomas en metafase Ncleo en interfase

Sondas Break-appart Translocacin recproca

Cromosomas en metafase Ncleo en interfase

APLICACIONES
Deteccin de Trisoma y Determinacin del sexo

Sondas para cromosomas 13,18,21,X,Y.

APLICACIONES X- e Y-sondas centromricas

Verde = X
Rojo = Y

Determinacin de probable cariotipo.

46,XY

Oncologa

APLICACIONES

Sondas de locus nicos( delecin o amplificacin)

P58 CLK-1 Locus (1p36). D7S486 (7q31). Retinoblastoma (13q14). P53 (17p13.1). Her-2/ neu (17q11.2-q12).

FISH / HER 2

Amplificado

No Amplificado

APLICACIONES

Oncologa
bcr/abl translocacin t(9;22)(q34;q11.2). IGH/CCND1 translocacin t(11;14)(q13;q32). PML/RARA translocacin t(15;17)(q22;q21.1). TEL/AML1 translocacin t(12;21)(p13;q22).

LMC SONDA DE FUSIN t9;22(q34;q11)

ABL 9q34

Fusin ABL/BCR

BCR 22q11

FISH normal

FISH ABL/BCR

Break appart - Translocaciones

Translocacin en Bcl2

Bcl 2 Normal

Split

Translocacin en Bcl2

protooncogn Bcl-2 (B-cell lymphoma 2),

FISH
Ventajas:

Puede ser aplicada a clulas en clulas en divisin como en no divisin. La tcnica es confiable. (sensibilidad y especificidad )

Desventajas:

No puede detectar pequeas mutaciones. Omite Inversiones. Sondas no estn comercialmente disponibles para todos las regiones cromosmicas.

Cariotipacin espectral ( SKY)

SKY
Ventajas: Mapeo de puntos de quiebre cromosmicos. Deteccin de translocaciones sutiles. Caracterizacin de rearreglos complejos. Desventajas: Equipos muy costosos. La tcnica es laboriosa. Especfico, pero no como mtodo de screening.

Hibridacin Genmica comparativa ( CGH)

CGH
Ventajas: Requiere slo DNA genmico tumoral. Puede ser aplicado a tejidos frescos o

Desventajas:

congelados, Deteccin de prdidas y ganancias genmicas por hibridacin competitiva de ADN tumoral y normal de referencia

no detecta inversiones

CITOGENTICA CONVENCIONAL vs FISH

CITOGENTICA Requiere clulas en divisin Requiere tejido fresco Permite detectar alteraciones de todo el genoma Bajo coste econmico

FISH No requiere clulas en divisin Permite estudiar material parafinado Solo aporta informacin de la sonda que se utiliza Moderado coste econmico

16 de Febrero de 2001 Celera Genomics

Proyecto genoma humano

La secuencia del genoma es un atajo valioso: ayuda a los cientficos a encontrar los genes ms fcil y rpidamente y sienta las bases para averiguar la funcin de los genes identificados Beneficios mdicos tras el conocimiento de la estructura de cada gen humano 1. Diagnstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad Marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, adems de nuevas estrategias para la terapia gnica

2.

15 de Febrero de 2001 Consorcio pblico internacional

Gracias por atencin

su

1 Fase DESNATURALIZACION DEL DNA CROMOSOMICO

Se deshidrata los portaobjetos sumergindolos en una serie de soluciones con etanol 70% 80% y 95% durante 2 min T ambiente

El DNA cromosmico se desnaturaliza sumergiendo las laminas en solucin formamida al 70% en2 SSC (citrato de sodio salino como amortiguacin) a 72C durante 2 minutos
Para parar la reaccin se sumerge las laminas en una serie de soluciones con etanol 70% 80% y 95% durante 2 min T -20C

2 Fase HIBRIDACION
LA sonda debe de estar incubada por 2 horas y desnaturalizada trascurrido ese tiempo se coloca la sonda sobre la superficie del portaobjeto. Se coloca un cubreobjeto de vidrio y se sella. La hibridacin se realiza en una cmara hmeda introducida en una estufa a 37 C en oscuridad durante 72 horas.

3 Fase DETECCCION DE LA SEAL DE HIBRIDACION

Tras la hibridacin, se examina el portaobjetos al microscopio con luz fluorescente. Las seales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosmico complementario, la ausencia de tales seales implica que no hay ADN cromosmico complementario.

Normal

Deletado

22q11.2 TUPLE 1 Orange 22q13 ARSA Green

Sndrome Di George/VCF

Normal

Deletado

Sndrome Prader Willi/ Angelman

15p11.2 Green 15q11-q13 Orange 15q22 Orange

Sndrome Miller-Dieker
17p13.3 Orange

17q21.1 Green

TCNICAS: CG, SB, PCR vs FISH

COMPARATIVA: Citogenetica vs FISH

CITOGENTICA
Requiere clulas en divisin Requiere tejido fresco Permite detectar alteraciones de todo el genoma Bajo coste econmico

FISH
No requiere clulas en
divisin Permite estudiar material parafinado o congelado Solo aporta informacin de la sonda que se utiliza Moderado coste econmico

COMPARATIVA: FISH vs PCR

FISH
Mayor especificidad: menos falsos negativos y menos falsos positivos Requiere un nmero mnimo de clulas Requiere un microscopio de fluorescencia

PCR
Elevada incidencia de falsos negativos: puntos de rotura variables Elevada sensibilidad: falsos positivos

COMPARATIVA: CISH vs FISH

CISH
No requiere microscopio de fluorescencia Mayor estabilidad de la sonda El patlogo est ms habituado Mayor tiempo de procesado Visualiza 1-2 colores

FISH
Requiere microscopio de fluorescencia Hasta el momento, poca experiencia del patlogo Permite trabajar con 2-4 sondas de distinto color Menor tiempo de procesado Mayor sensibilidad

CRITERIOS DE VALORACIN
Valorar la FISH en la zona tumoral

Analizar 500 ncleos para sondas centromricas y 200 ncleos para sondas especficas de locus Nunca valorar clulas solapadas
Establecer en una primera etapa los niveles de corte de cada sonda a partir de muestras control

Cariotipo Espectral Multicolor (SKY)

Hibridacin in situ con sondas especficas de cada cromosoma (El aparato es capaz de diferenciar 24 colores).
Identificacin unvoca del material cromosmico reordenado en translocaciones y marcadores complejos

Caso 3226 Bandeo GTG Cariotipo 47,XX,+mar Multiple FISH Cariotipo 47,XX,+der(22q)

Caso 7947 (Hospital Clnico Universidad de Chile) Cariotipo parcial con multiple BAND cromosoma 2 : del(2)(q31q33),r(2)(q31q33),cromosoma 2 normal e ideograma del cromosoma 2.

SKY o M-FISH

(cariotipo espectral o multicolor FISH)

CROSS SPECIES COLOR BANDING: RxFISH

Hibridacin Genmica Comparada (CGH)

Deteccin de prdidas y ganancias genmicas por hibridacin competitiva de ADN tumoral y normal de referencia

MULTICOLOR BANDING FISH

Secuenciacin de ADN

Secuenciacin automtica

Secuenciacin de genomas

ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC AGTGACTTTGTCCAAC GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCC AGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT

ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIN DEL CROMOSOMA

Deteccin de mutaciones

Mtodo de diagnstico rutinario (relacin entre enfermedad y mutacin puntual)

Secuenciacin de ADNs fsiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayora estn daadas o degradadas)

Diagnstico de enfermedades genticas

Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro

Identificacin de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciacin de genomas

Conocimiento bsico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

UTILIDAD
Esta tcnica es especialmente til para mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas Es muy importante destacar que no es una tcnica de bsqueda de nuevas alteraciones cromosmicas, sino que detecta nicamente aquello que buscamos. El resto del genoma permanece oculto. Esta tcnica complementa perfectamente a la citogentica convencional en todas aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo. Al disponer de metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos en los que las alteraciones cromosmicas asociadas a un diagnstico son crpticas no visibles a la resolucin del microscopio ptico