TINCIONES
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melissaavellanedaortizTINCIONES
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melissaavellanedaortizTÉCNICAS MICROSCÓPICAS
Observación al microscopio
Limpiar las lentes de los objetivos con:
– 2-propanol (mejor)
– Etanol absoluto
Cuando??
– Antes de empezar la práctica
– Después de observar con el objetivo de
inmersión
– antes de guardar el microscopio
Observación al microscopio
1º) FROTIS:
– Cultivo medio líquido:
1º) coger con el asa de siembra
2º) extender
– Cultivo medio sólido:
1º) gota de agua
2º) tomar una pequeña parte de la colonia
3º) extender
Observación al microscopio
2º) FIJACIÓN
–al calor
•Modifica la composición química
(coagula las proteínas)
•Mantiene la misma forma que in vivo
Observación al microscopio
3º) TINCIÓN
–SIMPLE
–GRAM,….
Observación al microscopio
• Preparación húmeda:
– Una gota de suspensión de microorganismo entre el porta y
cubreobjetos.
– Observar directamente.
• Preparación fijada:
– Suspensión de microorganismos en una gota de agua
– Fijada mediante calor o agentes químicos
– Objetivo de inmersión
Visualización “in vivo”
• Ventajas:
– Morfología de las bacterias es más fiel a la realidad
– Se puede apreciar la motilidad de los
microorganismos
• Inconvenientes:
– Dificultad de visualización, por poco contraste
– Posibilidad de contaminación
– No se pueden almacenar muestras
Lo ideal es observar las bacterias sobre fondo oscuro
Visualización “in vivo”
• 1º) Limpiar y desengrasar el portaobjetos y
cubreobjetos
• 2º) Colocar una gota de agua en el portaobjetos
• 3º) Hacer una suspensión (sin hacer una
extensión)
• 4º) Colocar el cubreobjetos sobre la muestra
Examen directo al microscópico
Tinciones
-Permiten observar los microorganismos en
función de la capacidad para fijar o retener
determinadas sustancias colorantes.
-Observación de microorganismos muertos
-Permite observar estructuras
– -corpúsculos metacromáticos (gránulos de reserva de
fosfato)-Lactobacillus
Tinciones
1º) Frotis y Extensión
2º) Secado: temperatura ambiente, estufa, calor mediante
pasadas rápidas
3º) Fijación:
-Transformación físico-química del microorganismo
-p.e. coagula las proteínas: evitando que se alteren en las
distintas fases (lavados)
-Calor
-Alcohol metílico (2-3 minutos)-escurrir y secar a temperatura
ambiente
4º) Tinción
Levaduras
Las levaduras son seres vivos, unicelulares que se
reproducen asexualmente mediante un proceso conocido
como gemación que consiste en la formación de brotes o
yemas que luego se desprenden de la célula original para
formar un nuevo organismo independiente.
LEVADURAS EN DIVISIÓN:
penicilium
MOHOS
MOHOS
MOHOS
MOHOS
MOHOS
MOHOS
MOHOS
Tinción de levaduras
– Se reproducen asexualmente por gemación o
por fisión binaria
1º) 1 gota de agua sobre el porta
2º) tomar una pequeña parte de la colonia con
el asa de siembra
3º) extender o remover la suspensión de forma
homogénea
4º) cubreobjetos
5º) Observar con el objetivo x10
Tinción de mohos
– Se reproducen asexualmente por gemación o
por fisión binaria
1º) 1 gota de agua sobre el porta
2º) tomar una pequeña parte de la colonia con
el asa de siembra
3º) extender o remover la suspensión de forma
homogénea
4º) cubreobjetos
5º) Observar con el objetivo x10
Tipos de tinciones
• Simples:
– Utilizan un solo colorante: azul de metileno, cristal violeta, fucsina
– Basada en la diferencia tinción: célula-entorno
– Permiten observar la morfología y la agrupación de las bacterias
• Dobles, compuestas o Diferenciales
– Tinción Gram: clasificar microorganismos
– Diferencian microorganismos por su afinidad con los colorantes
• Selectivas o estructurales
– Debido a su diferente composición química
– Destacan alguna estructura específica de las bacterias
– Tinción de esporas, cápsulas, flajelos, corpúsculos metacromáticos, …
• Tinciones especiales
– Tinción negativa
– Tinciones fluorescentes
Tipos de colorantes
• Catiónicos
– Sustancias con carga +
– Penetran en el interior de las células y las tiñen
– Azul de metileno, cristal violeta, safranina
• Aniónicos
– Sustancias con carga –
– No penetran en el interior de la célula
– No tiñen las células, tiñen su entorno
– Eosina, nigrosina
• Liposolubles
– Se mezclan con los lípidos y los tiñen
– Negro sudán
TINCIÓN SIMPLE
1º) EXTENSIÓN
• Depositar una gota de agua sobre el porta y realizar la suspensión
• Extender la muestra en el porta
2º) SECADO
• Secar a temperatura ambiente, estufa o calor de la llama (pasadas rápidas)
3º) FIJACIÓN
• Transformación físico-química del microorganismo, LO MÁS PARECIDO “ IN
VIVO”
• p.e: coagula las proteínas (evitando que se alteren en la tinción)
4º) TINCIÓN
• Añadir el colorante, que cubra toda la muestra
5º) LAVADO
• Lavar con agua-arrastrar el exceso de colorante (hasta que no salga teñida
el agua)-observar al microscopio
TINCIÓN SIMPLE
• E. coli
TINCIÓN gram
• Tinción diferencial (utiliza más de un colorante)
• Ideada, en 1883, por el bacteriólogo Danés:
• Christian Gram
• Permite clasificar microorganismos:
– Gram +
– Gram -
Tinción Gram
1º) Cristal Violeta (1º colorante)
2º) Lugol (mordiente: favorece la fijación del
color)
3º) Decolorante: alcohol-acetona
– Disolvente orgánico
4º) Fuscina o safranina (2º colorante)
TINCIÓN GRAM
• Gram + violetas
• Gram - rojas
Gram +
• Gruesa capa de peptidoglicano (20-30 nm) en su capa
más externa:
– N-acetil glucosamina
– Ác. N-acetil murámico
• Unidas por puentes formados por aminoácidos
Gram -
• Delgada capa de
peptidoglicano (3-
5nm) rodeada de :
– membrana externa
• Fosfolípidos
• Proteínas
• lipopolisacáridos
Etapa: Decoloración
• Agregados entre el colorante y mordiente
• Gram +: capa gruesa de péptidoglicano
• Gram -:
– Decolorante atraviesa:
• Capa lipídica de la membrana externa
• Delgada capa de peptidoglicano
– Extracción de los agregados
– Extracción del color violeta
– Toman el color del contracolorante (fuscina o
safranina)
Tinción gram
• Paso crítico: Decoloración
• Si se prolonga: decoloración Gram +
• Cultivos jóvenes:
– Integridad de las envolturas celulares
• La clasificación Gram +,- no puede aplicarse a
todas las bacterias
Procedimiento-Tinción Gram
1º) Extender, secar y fijar a la llama la muestra
2º) Cubrir con cristal violeta (1 minuto)
3º) Lavar con agua
4º) Escurrir y cubrir con Lugol (1 minuto)
5º) Retirar el exceso de Lugol-Lavar con agua
6º) Decolorar con alcohol-acetona
7º) Lavar con abundante agua
8º) Añadir Safranina, esperar 1 minuto
9º) Lavar con agua
10º) Secar
11º) Observar con objetivo de inmersión
TINCIÓN GRAM
Staphylococcus spp.
(S. aureus)
Staphylococcus spp.
(S. aureus)
Staphylococcus spp.
(S. aureus)
Streptococcus spp.
(S. pneumoniae)
Streptococcus spp.
(S. pneumoniae)
Micrococcus
TINCIÓN DE ESPORAS
• Importancia taxonómica:Clostridium, Bacillus
– Endosporas-color verde
– Resto de las cálulas-color rojo claro
• Localización de las esporas en la célula
• Colorantes muy concentrados
• Tinción forzada por calentamiento hasta emisión de vapores
• VERDE MALAQUITA: se utiliza en caliente
• FUSCINA DILUIDA: contracolorante
• ESPORAS: VERDE
• FONDO: ROJO
TINCIÓN DE ESPORAS
• Extender, secar y fijar por calor
• Verde de Malaquita-calentar hasta la emisión de vapores
(evitar que hierva)-3-5 minutos
– Hacer una torunda con un asa de siembra y algodón, apoyar el
porta sobre la bandeja de tinción y hacer pasar la torunda de
algodón empapada en alcohol y llama , varias veces para
emisión de vapores.
• Enfriar a temperatura ambiente
• Lavar con abundante agua
• Safranina-30 segundos-1 minuto
• Lavar con agua y Secar
• Observar al microscopio
[Link]
ras&view=detail&mid=AECFD9725BC5D68B27A2AECFD9725BC5D68B27A2&&FORM=VRDGAR
TINCIÓN DE ESPORAS
[Link]
deo+youtube+tincion+de+esporas&qpvt=
video+youtube+tincion+de+esporas&view
=detail&mid=AECFD9725BC5D68B27A2AE
CFD9725BC5D68B27A2&&FORM=VRDGAR
TINCIÓN DE ESPORAS
Bacillus antracis con esporas
Bacillus antracis
Bacillus cereus
TINCIÓN DE CÁPSULAS
• Tinta china
HONGOS
• MOHOS: Penicillium, Aspergillus,
Fusarium, Alternaria, Cladosporium,
Acremonium, Verticillium, Botrytis, Mucor,
Rhizopus, Trichothecium,
• LEVADURAS
PENICILIUM
• Descubierto en 1929 por Alexander Fleming cuando
accidentalmente un cultivo de Staphylococcus
aureus fue contaminado por este hongo, dejó un
halo transparente alrededor de las colonias de bacterias,
obteniéndose con este hallazgo, el primer antibiótico: la
penicilina.
Sólo una especie es patógena: Penicillium marnefeii.
PENICILIUM
ASPERGILLUS
FUSARIUM
Rhizopus
MUCOR
