Enter o Bacterias
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melissaavellanedaortizENTEROBACTERIAS
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
ENTEROBACTERIAS
Familia Enterobacteriaceae
Bacilos
Gram-negativos
Aerobias y anaerobios facultativos
No esporulados
Móviles o inmóviles
Flagelos perítricos: “toda la superficie celular”
Fermentan glucosa
Catalasa positivos
Reducen nitratos a nitritos
Citocromo oxidasa negativos
Crecen en medios que contienen Sales biliares
ENTEROBACTERIAS
LACTOSA POSITIVAS
Escherichia
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
Serratia
ENTEROBACTERIAS
LACTOSA NEGATIVAS
Salmonella
Shigella
Proteus
Yersinia
Erwinia
ENTEROBACTERIAS
¡¡¡Durante muchos años se utilizaron
como indicadores de contaminación
fecal!!!-----actualmente NOOOOOO!!!!
En vez de coliformes totales
Actualmente se sabe que: Origen:
Fecal
No fecal
ENTEROBACTERIAS
Durante muchos años se utilizaron como indicadores de
contaminación fecal
¿y si predominan las LACTOSA -? (Salmonella)
RESISTENCIA: ENTEROBACTERIAS >COLIFORMES
Salmonella: resistente: influencias desfavorables
brote de gastroenteritis producido hace años por
queso blando madurado francés, contaminado por la
cepa enteropatógena de E. coli tipo O124:FERMENTA
LACTOSA LÉNTAMENTE. Y se observaron:
RECUENTOS COLIFORMES: 103 /g--- APTO
RECUENTOS ENTEROBACTERIAS: 107 /g-- NO APTO
ENTEROBACTERIAS
NIVELES ALTOS INDICAN:
CONDICIONES HIGIÉNICAS DEFICIENTES:
Manipulación deficiente (poca higiene)
Elaboración deficiente (poca higiene)
ENTEROBACTERIAS
¿QUÉ INDICAN NIVELES ALTOS EN?
ALIMENTOS FRESCOS
ALIMENTOS PROCESADOS
ENTEROBACTERIAS
ALIMENTOS FRESCOS:
Manipulación no higiénica
Almacenamiento inadecuado
ENTEROBACTERIAS
ALIMENTOS PROCESADOS (que han
recibido tratamiento para garantizar su
sanidad)
Tratamiento inadecuado
Contaminación posterior al alimento
Almacenamiento inadecuado
Multiplicación de microorganismos
patógenos si los había
ENTEROBACTERIAS
MICROORGANISMO INDICADOR de:
MANIPULACIÓN NO HIGIÉNICA
ALMACENAMIENTO INADECUADO
RECUENTO
TOTAL DE ENTEROBACTERIAS
DE ENTOBACTERIAS
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS
RECUENTO EN PLACA
RECUENTO EN MEDIO LÍQUIDO
AUSENCIA/PRESENCIA
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS
RECUENTO EN PLACA (ufc/g o ml
de alimento)
ENTEROBACTERIAS
Pesar asépticamente 10 g de alimento
en una bolsa de Stomacher
ENTEROBACTERIAS
Se diluyen en 90 ml de agua de peptona
ENTEROBACTERIAS
Homogeneizar en Stomacher 1-4 minutos (el
tiempo varía según el alimento)
14.000 rpm durante 60-90 segundos
ENTEROBACTERIAS
Preparar las “diluciones decimales”
Según el número de microorganismos esperados
Usar pipetas o puntas estériles-tomar 1 ml de la
dilución anterior en 9 ml de agua de peptona
Evitar que se forme espuma
ENTEROBACTERIAS
Mezclar mecánicamente cada dilución con el
agitador mecánico tipo vortex
No manualmente agitando el tubo 25 veces en 7
segundos con movimientos ascendentes y
descendentes, formando un ángulo de 60º entre el
brazo y antebrazo
ENTEROBACTERIAS
Depositar 1 ml de cada dilución en placas de
Petri vacías, estériles (DOS PLACAS POR
DILUCIÓN)
ENTEROBACTERIAS
Mantener el VRBG fundido a 47-50ºC
ENTEROBACTERIAS
Añadir a cada placa 15-20 ml de VRBG agar
atemperado a 47-50ºC (no encima del inóculo,
sino a un lado de la placa)
ENTEROBACTERIAS
Homogeneizar el inoculo con el agar con
movimientos circulares y de vaivén
ENTEROBACTERIAS
Esperar a que solidifique el agar y añadir una
segunda capa de 10 ml de agar VRBG
Esperar a que solidifique la segunda capa de
agar
ENTEROBACTERIAS
Invertir las placas de Petri
Incubar en estufa a 37ºC durante 24±2 horas
ENTEROBACTERIAS
Contar las placas que presenten entre 10 y 150
colonias típicas de Enterobacterias en VRBG
Diámetro ≥ 0,5 mm
Color rojo-amoratado (violeta)
Rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas del
mismo color
ENTEROBACTERIAS
Diámetro superior a 0,5 mm
Se pueden desarrollar colonias de Pseudomonas
Colonias más pequeñas porque no están a su temperatura
óptima (diámetro< 0,5 mm)
EXCEPCIÓN: cuando en un placa hay > 300
colonias, las Enterobacterias tienen un diámetro<
0,5mm
No tienen espacio para ser más grandes
ENTEROBACTERIAS
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS:
ENTEROBACTERIAS
Diámetro ≥0,5 mm
Se pueden desarrollar colonias de Pseudomonas
Colonias más pequeñas porque no están a su temperatura
óptima (diámetro< 0,5 mm)
EXCEPCIÓN: cuando en un placa hay > 300
colonias, las Enterobacterias tienen un
diámetro<0,5mm
No tienen espacio para ser más grandes
ENTEROBACTERIAS
Color rojo-amoratado
Fermentan glucosa, con producción de ácido
Al descender el pH el indicador (ROJO NEUTRO) vira
a rojo amoratado
HALO
Precipitación de las sales biliares del medio
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
ENSAYO DE LA OXIDASA (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Se hace con un nº representativo de colonias:
el 10% o de cada placa contable se toman
con el asa 5 colonias representativas de las
colonias que hemos elegido para contar---- y se
siembran en agar nutritivo
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Enzima oxido-reductasa
Dímero: se extiende desde la matriz al espacio
intermenbrana o citosol (atravesando la membrana)
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Enzima oxido-reductasa
Cataliza una reacción oxido-reducción, empleando el
oxígeno molecular (O2) como aceptor de electrones: el
oxígeno se reduce a agua o peróxido de hidrógeno
el último paso de la cadena transportadora de
electrones
Las enterobacterias no producen citocromo oxidasa
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Enzima oxido-reductasa
Organismos aerobios, algunos anaerobios
facultativos, excepcionalmente algún microaerófilo
(vibrio fetus)
No en anaerobios estrictos
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
ENTEROBACTERIAS: OXIDASA -
PSEUDOMONAS: OXIDASA +
NEISSERIA: OXIDASA +
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Prueba de la Citocromo-Oxidasa:
Se impregna un papel de filtro con el siguiente reactivo
-Clorhidrato de tetrametil-para-fenilen-diamina.....1g
-Äcido ascórbico..............................................0,1g
-Agua destilada.............................................100 mL
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Los discos contienen oxalato de dimetil-para-
fenilendiamina, el cual es el sustrato de la enzima
oxidasa.
Los microorganismos que producen la enzima oxidasa se
evidencian porque en presencia de oxígeno atmosférico y
citocromo c, se oxida el sustrato presente en los
discos a un compuesto de color rojo-fucsia.
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Inmediatamente con una aguja de siembra se toma una
colonia del agar VRBG y se extiende sobre el papel de filtro.
Si aparece rápidamente una coloración violeta la prueba es positiva
Si no aparece rápidamente una coloración violeta la prueba es negativa
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Generalmente dentro del minuto, y a temperatura
ambiente se detectan los resultados positivos.
Una reacción lenta, pasado los 2 minutos, debe
considerarse negativa.
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Control +: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Control - : Escherichia coli ATCC 25922
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
La prueba debe realizarse utilizando cultivos frescos
(18-24 horas), y que no provengan de medios con
azúcares con pH ácido.
- No usar asas de cromo (sólo si son nuevas) por riesgos
de obtener resultados falsos positivos provenientes del
metal reducido.
ENTEROBACTERIAS
CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS
OXIDASA NEGATIVAS (PRUEBA CITOCOMO OXIDASA)
Positivo: observación de color rojo-fucsia en el disco y/o
solución.
Negativo: el disco permanece sin cambio de color.
