Juan Caparrós González

Ampliación Química G: A1
Fecha: 20/02/2023

Práctica 2: Determinación del

contenido de una sustancia por
espectrofotometría

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 Índice

1.- Objetivo Pg. 3

2.- Fundamento teórico Pg.3-6

3.- Materiales y Procedimiento experimental Pg.6-7

4.- Datos Experimentales Pg.7-10

5.- Cálculos Pg.10-11

6.- Resultado y discusión Pg.11-12

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1.- Objetivo
● El objetivo de esta práctica es obtener datos de diferentes
sustancias mediante espectrofotometría usando la ley de Lambert
y Beer, para calcular la concentración de dichas sustancias.

2.- Fundamento teórico

● La espectrofotometría es un método instrumental de análisis para
medir la absorción de radiación ultravioleta y visible que interactúa
con la materia permitiendo medir la concentración de las
sustancias químicas. Es una técnica basada en la medición de la
longitud de onda e intensidad de esta.

● La estructura de la materia explica los enlaces entre los átomos

que forman partículas. Dichas partículas interactúan con la
radiación electromagnética y mostrando así sus características
ondulatorias. En condiciones normales una molécula se encuentra
en su forma estable con un determinado nivel energético, si se
excita la molécula con un fotón de radiación con la energía
necesaria la molécula incrementa su contenido energético
denominándose molécula excitada.

● Esta molécula excitada en conciones normales tiende a recuperar

su forma, de manera que emite el fotón con la misma energía que
logró excitarla (misma longitud de onda).

● Cada elemento solo absorbe la energía que es capaz mantener.

Coincidiendo las bandas del espectro en las que emite radiación
con los huecos del espectro de absorción de la radiación, como si
un espectro fuera el negativo del otro.

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 ● Bouger, Lambert y Beer, a través de sus observaciones
establecieron relaciones de la variación de la intensidad de luz
transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la
concentración de la sustancia, para materiales translúcidos.
Dichas relaciones permiten determinar las concentraciones de las
especies químicas.

● La intensidad de radiación incidente es la suma de las

intensidades de los haces reflejados, absorbidos y transmitidos:
I0=Ia+Ir+I

I0 es la intensidad de la radiación monocromática incidente;

Ia es la intensidad de la luz absorbida por la sustancia atravesada;
I es la intensidad de la radiación emergente;
Ir es la intensidad de la luz reflejada.

● La relación entre las intensidades de radiación transmitida e

incidente fue estudiada por Lambert para medios transparentes
(disolventes puros) y extendida por Beer para disoluciones,
cuando se emplea una radiación monocromática.
− 𝑑𝐼 = 𝑎' × 𝐼 × 𝑐 × 𝑑𝑥

Siendo la integral (entre x=0 y x=b):

𝐼
𝐿𝑛( 𝐼𝑜 ) =− 𝑎' × 𝑏 × 𝑐
a= absortividad

● Para expresar la ley de Beer de manera más útil; es conveniente

definir dos nuevas magnitudes, la transmitancia (T) (o transmisión)
y la absorbancia (A) (densidad óptica o extinción).
𝐼
T= 𝐼𝑜 → A= − 𝑙𝑜𝑔(𝑇) → A=abc
b= Espesor c= Concentración

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● Esta ley es una ley experimental que se ha tratado aquí de
establecer teóricamente, suponiendo que se cumplen varios
supuestos o condicionantes, los cuales son:
1. La radiación es monocromática (mismo color, que significa que
está constituida por fotones de una sola clase; es decir de la
misma energía E y de la misma frecuencia).
2. Las especies disueltas actúan independientemente unas de
otras en el proceso de absorción.
3. La absorción tiene lugar en un volumen de sección recta y
uniforme.
4. La degradación de la energía absorbida es rápida en forma de
calor y no radiacional (es decir, los posibles fotoefectos son
despreciables).
5. El índice de refracción, n, de las disoluciones a medir es
independiente de la concentración de las especies absorbentes.

● Propiedades de la ley de Lambert - Beer:

-La ley rige el proceso de absorción en cualquier región del
espectro electromagnético, ya sea absorción de radiación
visible-ultravioleta, absorción de rayos X, absorción de rayos , etc.
-La absorbancia es una propiedad extensiva y aditiva, es
decir, en disoluciones que contengan más de una especie
absorbente la absorbancia total es la suma de las absorbancias
individuales de cada especie absorbente (suponiendo que no haya
interacción entre las distintas especies).

● Desviaciones de la ley de Lambert – Beer

-Para un paso óptico (b) constante se suelen encontrar
desviaciones a la proporcionalidad directa entre la A medida y la c
de la especie absorbente. Estas desviaciones pueden representar
limitaciones reales de la ley de Beer.
-La ley de Beer suele describir bien el proceso de absorción
en disoluciones diluidas de la especie absorbente (concentración
<10-2 M). A concentraciones elevadas, la ley de Beer presenta
desviaciones fundamentalmente porque aumenta el grado de
interacción mutua entre las especies absorbentes, alterando su
capacidad de absorción a una longitud de onda determinada.

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 -La técnica espectrofotométrica resulta útil para la valoración
de sustancias que en disolución poseen capacidad para absorber
radiación UV y/o visible.

3.- Materiales y Procedimiento

experimental
Materiales:
1. Gradilla con tubos de ensayo numerados del 1-9
2. Pipeta graduada de 10ml (2)
3. Aspirapipetas
4. Vaso de precipitado de 100ml (2)
5. Espectrofotómetro
6. Cubetas de 1cm de espesor

*Elementos del espectrofotómetro*

-Fuente de luz: Lámpara de wolframio
-Monocromador: Selecciona la longitud de onda
-Célula: Recipiente de material transparente a las radiaciones
-Detector: Fototubo por el cual la energía luminosa se transforma en
energía eléctrica.

Para utilizar el espectrofotómetro deberemos realizar los siguientes

pasos:
1.-Enchufarlo a la corriente (tarda en calentarse).
2.-Seleccionar la longitud de onda
3.-Colocar en el receptáculo una cubeta con disolvente (agua) y
pulsar zero para mantener la absorbancia (repetir al tomar cada
medida sí cambiamos la longitud de onda).
4.-Colocar en el receptáculo la cubeta con la muestra y anotar el
valor de la absorbancia.

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Reactivos:
1. Disolución acuosa de vitamina B2 de 0,03 g·L-1 (Mmol vitamina B2
= 376,4 g/mol)
2. Agua destilada
3. Disolución problema de vitamina B2 (concentración desconocida)

Procedimiento experimental:
*La práctica de divide en tres apartados*
a)Determinación de la longitud de onda más adecuada para la medición
-Se mide la absorbancia de una disolución de concentración conocida
(0,03 g·L-1 ) desde 400 nm a 500 nm (de 5 en 5 nm). (Nos repartimos
este trabajo entre los diferentes puestos del laboratorio)
-Realizar una gráfica con los datos obtenidos (eje de abscisas: longitud
de onda; eje de ordenadas: absorbancia).
-En la gráfica realizada, el máximo relativo será la longitud de onda
adecuada para medir la absorbancia.

b)Determinación de la recta de calibrado absorbancia-concentración

-Preparar 9 tubos de ensayo en los cuales se añadirá 1ml de vitamina
B2 en el primer tubo, 2ml en el segundo… hasta llegar a 9ml en el último
tubo. Seguidamente,en cada tubo añadiremos agua destilada hasta
llegar a 10ml de disolución. Ejemplo: Tubo 1: 1ml de Vitamina B2 y 9ml
de agua destilada.
-Medir la absorbancia en el espectrofotómetro con la longitud de onda
obtenida en el primer apartado.
-Representación de una recta de calibrado de la absorbancia obtenida
(ordenadas) y la concentración de vitamina (abscisas).
-Determinar si la relación es lineal y hasta qué concentraciones.
-Ecuación de la recta

c)Determine la concentración de la muestra de vitamina B2 de

concentración desconocida.
-Medir la concentración de la muestra problema con la longitud de onda
correcta. Realizar una gráfica estimada.
-Aplicar la ecuación obtenida para calcular la concentración.

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4.- Datos experimentales

a)Tabla de datos; *En esta tabla anotamos la absorbancia obtenida

dependiendo de la longitud de onda usada al medir la vitamina*

Long. onda (nm) Absorbancia

400 0,405
405 0,414
410 0,446
415 0,485
420 0,531
425 0,573
430 0,611
435 0,631
440 0,659
445 0,673
450 0,668
455 0,644
460 0,616
465 0,576
470 0,549
475 0,492
480 0,414
485 0,325
490 0,227
495 0,149
500 0,087

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-Gráfica realizada a partir de los datos de la tabla.

-Se puede observar que hay un máximo relativo en la longitud de onda

equivalente a 445nm, y por ello, esta será la longitud de onda usada
para el resto de medidas obtenidas.

b)Volumen de los diferentes tubos, así como sus concentraciones

(mol/L) y absorbancia (abs).

V(ml)-B2 V(ml)-agua V(ml) total C(mol/L) Abs (445nm)

0 10 10 0 0
1 9 10 7, 97 × 10
−7 0,068
2 8 10 1, 59 × 10
−6 0,138
3 7 10 2, 39 × 10
−6 0,214
4 6 10 3, 19 × 10
−6 0,264
5 5 10 3, 99 × 10
−6 0,336
6 4 10 4, 78 × 10
−6 0,419
7 3 10 5, 58 × 10
−6 0,467
8 2 10 6, 38 × 10
−6 0,536
9 1 10 7, 17 × 10
−6 0,614

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-Recta de calibrado con la absorbancia y concentración de la tabla
anterior.

-La correlación es lineal hasta el momento en el que la absorbancia se

mantenga constante, es decir, cuando la vitamina no esté diluida en
agua y sea el 100% de la muestra medida en el espectrofotómetro.
−8 −5
-La ecuación de esta recta es 𝑦 =− 1, 93 × 10 𝑥 + 1, 18 × 10
Coeficiente de correlación lineal: r=0,9994

c)Absorbancia de la muestra problema: 0,217

−5
Concentración de la muestra problema: 1, 1 × 10 mol/L

5.- Cálculos

-Para realizar los cálculos para formar la recta de regresión, se utiliza la

tabla de valores de los tubos de ensayo con distintas concentraciones,
obteniendo así, una ecuación de dicha recta de la forma y=ax+b y
poseyendo un coeficiente de correlación lineal (r) con valor de 0,9994.

-Por último, con la medida de la absorbancia de la muestra problema, se

sustituye el valor obtenido en la ecuación de la recta obtenida

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anteriormente, dando como resultado el valor de la concentración de la
muestra problema.

-Además existen dos tipos de radiaciones, la radiación monocromática

es aquella que emite una onda que corresponde únicamente a un color
en específico; y la radiación policromática, como su nombre indica, se
trata de la presencia de varias ondas monocromáticas.

-El espectro de emisión se trata de las bandas producidas por la

radiación emitidas por las moléculas, mientras que el espectro de
absorción muestra el incidente de radiación que absorbe una molécula
dentro de un rango de frecuencias.

-Otro aspecto a tener en cuenta, es el hecho de tomar medidas de

absorción a diferentes longitudes de onda, buscando la idónea para
medir la absorbancia de la vitamina correctamente, encontrándose esta
diluida.

6.- Resultado y Discusión

-Durante la realización de la práctica, hemos seguido los pasos al pie de
la letra, obteniendo así unos resultados que no son muy dispares a la
hora de realizar las gráficas. De aquí, que el coeficiente de correlación
lineal sea tan cercano a 1 (los valores obtenidos no se alejan de la recta
de calibrado).

-Muy importante realizar el calibrado del espectrofotómetro pulsando

cero con el agua dentro, puesto que así obtendremos la absorbancia de
la disolución de vitamina correctamente sin tener en cuenta la del agua.
Otro hecho muy parecido a este ocurre a la hora de utilizar una báscula
y pulsar el botón de tara, obviando el peso que ya se encuentra sobre
esta.

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-Como se comenta en el fundamento un átomo puede absorber las
mismas radiaciones que puede emitir, por ello se forman diferentes
espectros de emisión, los cuales se tratan de un cambio en la materia
excitada tratando de volver a su forma estable expulsando energía
térmica, eléctrica, nuclear…

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