CARACTERIZACIÓN GENÓMICA DE AISLADOS CLÍNICOS DE

Staphylococcus aureus RESISTENTE A LA METICILINA EN

LATINOAMÉRICA, 2000 - 2024

GENOMIC CHARACTERIZATION OF CLINICAL ISOLATES OF

METHICILLIN-RESISTANT Staphylococcus aureus IN LATIN AMERICA, 2000 -

2024

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN

TECNOLOGÍA MÉDICA, ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLÍNICO Y

ANATOMÍA PATOLÓGICA

AUTORES

TAHNEE ELAINE GUANILO CASTRO

LESLY ALELY SALDAÑA VALENTÍN

ASESOR

DIEGO BERNHARD CUICAPUZA ARTEAGA

LIMA - PERÚ

2024
ASESORES DEL TRABAJO DE TESIS

ASESOR

Mg. Diego Bernhard Cuicapuza Arteaga

Escuela Profesional de Tecnología Médica

ORCID: 0000-0002-5735-4614
 DECLARACIÓN DEL AUTOR

Como autoras, declaramos no tener ningún conflicto de interés

 TABLA DE CONTENIDOS

Pág.

I. INTRODUCCIÓN
II. OBJETIVO E HIPÓTESIS
A. Objetivo general
B. Objetivos secundarios
III. MATERIAL Y MÉTODOS
A. Diseño
B. Población y lugar de estudio
C. Tamaño de muestra
D. Variables
E. Procedimientos
a. Búsqueda y selección de artículos científicos
b. Búsqueda de secuencias genómicas en bases de datos
c. Descarga de reads y secuencias de genomas publicadas
d. Ensamblaje de Reads de Artículos científicos
e. Eliminación de posibles secuencias duplicadas
f. Análisis bioinformático
F. Aspectos éticos
G. Plan de análisis
IV. RESULTADOS
V. DISCUSIÓN
VI. LIMITACIONES
VII. CONCLUSIÓN
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
IX.. ANEXOS
 RESUMEN

Antecedentes: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) contiene el gen

mecA en el elemento genético móvil SCCmec, que le confiere resistencia a

antibióticos β-lactámicos. En Latinoamérica, el clon USA300 (CC8-SCCmecIVa-

t008) está siendo reemplazado por el clon Río de Janeiro “Rdj” (CC5-ST105-IIa-

t002), lo que representa una amenaza debido a la versatilidad de sus factores de

virulencia. Este fenómeno requiere un análisis detallado para comprender su impacto

y evolución en la región. Objetivo: Caracterizar genomicamente las secuencias

públicas de MRSA en Latinoamérica en el periodo del 2000-2024. Material y

métodos: Se realizó un estudio observacional transversal utilizando 994 secuencias

MRSA de 13 países latinoamericanos, obtenidas de la base de datos del NCBI. Los

genomas en formato FASTA fueron sometidos a un análisis bioinformático que

incluyó de un control de calidad, identificación SCCmec, secuenciotipo(STs),

factores de virulencia, genes y mutaciones asociadas a resistencia. Además, se realizó

un análisis filogenético para determinar la agrupación de filogrupos. Resultados: El

genotipo CC5-SCCmecIIa-ST105-t002-lukD/E-PV+ predominó en un 18% en países

como Brasil y Chile,seguido de CC30-SCCmec-IVc-t019-lukF/S-PV+ con 8.6% en

Argentina. El 75% de los genomas presentaron el elemento genético COMER y más

del 90% contenían genes codificadores de la toxina PVL. Conclusiones: Nuestro

estudio reveló el predominio del clon CC5-ST105-IIa-t002 (Rdj) en países de

Latinoamérica, con un 21.3%.

Palabras clave: Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA),

epidemiología molecular, secuenciación del genoma completo, cassette.

 ABSTRACT

Background: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) possesses the

mecA gene in the SCCmec mobile genetic element, which confers resistance to

various β-lactam antibiotics. In Latin America, the USA300 clone (CC8-

SCCmecIVa-t008) is being replaced by the Rio de Janeiro “Rdj” clone (CC5-ST105-

IIa-t002), which represents a threat due to the versatility of its virulence factors.

However, this phenomenon requires a rigorous and detailed analysis to better

understand its impact and evolution in the region Objectives: To genomically

characterize the public MRSA sequences in Latin America in the period 2000-2024

Methods: A cross-sectional observational study was carried out. 994 MRSA

sequences from 13 Latin American countries were selected from the NCBI public

database. The genomes in FASTA format were subjected to quality control,

bioinformatic analysis to identify SCCmec, sequence type (STs), virulence factors,

genes and mutations associated with resistance. Additionally, a phylogenetic analysis

was performed to determine the grouping of phylogroups. Results: The CC5-

SCCmecIIa-ST105-t002-lukD/E-PV+ genotype predominated by 18% in countries

such as Brazil and Chile, followed by CC30-SCCmec-IVc-t019-lukF/S-PV+ with

8.6% in Argentina. It was found that 75% of the genomes presented the genetic

element EAT. Conclusions: Our study revealed the predominance of the CC5-

ST105-IIa-t002 clone in Latin American countries to date. Keywords: Methicillin-

resistant Staphylococcus aureus (MRSA), molecular epidemiology, whole genome

sequencing, cassett
 I. INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno comensal que normalmente

coloniza la piel en un 20% de las personas y el tracto respiratorio superior un 30%

(1). No obstante, cuando rompe las barreras protectoras de la piel y mucosas, puede

invadir tejidos profundos y causar infecciones en tejido blando en el 75% de los

casos, así como bacteriemias asociadas a catéter en un 24% (2-4). De acuerdo con la

Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2021, las infecciones intrahospitalarias

causadas por este patógeno han aumentado considerablemente en los últimos años en

un 12,11%. Además, se reportan incidencias de bacteriemias que oscila entre 20 a 50

casos por cada 100.000 habitantes al año, con una tasa de mortalidad de 10% al 30%

(5,6).

En 1959, se introdujo la meticilina como tratamiento contra S. aureus resistente a la

penicilina, ya que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana al actuar sobre las

Proteínas Fijadoras de Penicilina (PBPs) que participan en la formación de la pared

bacteriana y la fijación de los antibióticos a ella (7,8). Sin embargo, en 1961, se

identificaron en el Reino Unido los primeros aislamientos de S. aureus resistentes a

meticilina (MRSA), mediada por el gen mecA, que codifica la proteína PBP2a. Esta

proteína permite que el microorganismo continúe la producción de peptidoglicano en

la pared celular, logrando reducir su susceptibilidad a β-lactámicos: penicilinas,

cefalosporinas (a excepción de ceftobiprole y ceftarolina), monobactam y

carbapenemes (9).

1
El Grupo de Trabajo Internacional sobre la Clasificación de elementos mec del

cromosoma en cassette estafilocócico (IWG-SCC) caracteriza el SCCmec basándose

en cuatro factores: (I) la presencia del gen mecA en el complejo regulador (mecR1 y

mecl), (II) la contribución de los genes de recombinasa (ccrA y ccrB), (III) la

integración de estos genes en un sitio específico del cassette cromosómico para la

recombinación, y (IV) la presencia de secuencias de repetición directas en los sitios

de integración (ISS) (11). La combinación de estos elementos define el tipo de

SCCmec. Hasta la fecha, el IWG-SCC ha identificado oficialmente 14 tipos de

SCCmec (I al XIV) (10,12). Los subtipos de SCCmec se determinan por las regiones

J, que también son responsables de la resistencia a lincosamidas, aminoglucósidos y

macrólidos (14). Estas regiones pueden incorporar otros determinantes de resistencia,

lo que genera variaciones dentro del complejo mec-ccr (11). Aunque el mecanismo

exacto de transferencia del SCCmec sigue siendo incierto, la principal evidencia

sugiere que su movilidad se basa en un modelo de inserción mediado por enzimas

recombinantes (13).

Se ha identificado que MRSA es una de las causas más comunes de infecciones

asociadas a la comunidad (CA-MRSA) y a la atención médica (HA-MRSA). Las

cepas de CA-MRSA en comparación de HA-MRSA, presentan mayor replicación y

alta capacidad de diseminación(14). En América del Norte, la cepa predominante de

CA-MRSA es USA300-NA, mientras que en América del Sur es USA300-LV, ambas

asociadas a infecciones en piel y tejido blando (15,16). Existen cepas CA-MRSA que

presentan factores de virulencia como el Panton-Valentine Leucocidina (PVL)

codificado por genes lukS-PV y lukF-PV (lukS/F-PV), responsables de la destrucción

2
de leucocitos, necrosis tisular e inflamación (17). Según estudios previos, relacionan

la presencia de PVL con un mal pronóstico de la infección, presentando una tasa de

mortalidad del 75% (13).

Se ha informado que los clones USA300 pueden presentar elementos móviles

catabólicos de arginina (ACME) y elementos de resistencia al cobre y mercurio

(COMER). El ACME es una isla genómica compuesta por 33 genes y operones (arc y

opp-3), que permiten a la bacteria sobrevivir en el ambiente ácido de la piel y

adaptarse a membranas mucosas. Este elemento está asociado a epidemias causadas

por USA300-NAE en EE.UU desde 1990 (18,19). Por su parte, el COMER,

vinculado al clon USA300-LV, contiene operones (mer y cop) que permiten la

regulación de cobre para evitar el estrés oxidativo y la muerte bacteriana (20).

La tipificación de secuencias multilocus (MLST) de Staphylococcus aureus, se basa

en el análisis de siete secuencias de genes housekeeping (arcC, aroE, glpF, gmk, pta,

tpi e yqiL), es crucial para la identificación de secuenciotipos (ST). El número

correspondiente del ST se otorga según la similitud de la secuencias de los genes, que

al relacionarse se agrupan en un complejo clonal (CC) único (21). Un estudio

realizado en Latinoamérica durante 2019, reportaron que el 87% de las muestras de

MRSA pertenecían a tres complejos clonales principales: CC30 (37.4%), CC5

(30.3%) y CC8 (22.4%), todos asociados a infecciones humanas (11). En el caso del

CC5, un estudio multicéntrico de 2018 informó que el clado CC5-I, que incluye al

clon chileno/cordobés ST5-I y ST228-I, ha experimentado una expansión

significativamente en América del Sur. En contraste, el clado CC5-II, que incluye al

clon ST5-II USA100, predomina en América del Norte y Central (22).

3
En Colombia, según informes de 2012, el CC8, que incluye al SCCmec tipo IVc, es

predominante con un 60.8%, desplazando al CC5 que cuenta con un 34.1% (23). En

Colombia (79%) y Ecuador (72%), el clon predominante es el USA300, asociado al

SCCmec IV. En contraste, en México (82%), Brasil (89%) y Guatemala (95%),

predomina el clon USA100, asociado al SCCmec II. En Chile y Perú, el clon

predominante es el Chileno/Cordobés (ChC), asociado a SCCmec I y II, con una

prevalencia del 90% (24-26). Adicionalmente, en un estudio chileno publicado en

2023, se reporta un clon emergente de MRSA ST105 perteneciente al CC5 que porta

el SCCmec II, cuya frecuencia ha ido en aumento de 0 a 23.4% desde el 2000 al 2016

(27).

Respecto al CC30, en un estudio argentino de 2021 evidenció que el CC30 se divide

en cuatro clados principales, cada uno con distintas distribuciones de genes de

resistencia y virulencia antimicrobiana: ARG-1 (CC30-IVc- spa t012), ARG-2(ST30-

IVc spa t021), ARG-3 (ST30 -IVh/j- spa t021) y ARG-4 (CC30-IVc- spa t019) (28).

Este último clado es el más prevalente y geográficamente diseminado, debido a sus

mutaciones cromosómicas. Se ha encontrado que contiene un plásmido con replicón

rep15, asociado a genes de transferencia de conjugación de plásmido (tra), lo que

permite a las cepas portar un plásmido conjugativo que confiere resistencia

antimicrobiana múltiple (29).

En los últimos años, el desarrollo de nuevas tecnologías moleculares como el

secuenciamiento del genoma completo (WSG), ha permitido la identificación de

genes de resistencia y virulencia de los microorganismos, así como la identificación

de secuenciotipos distribuidos ampliamente. Además, esta herramienta permite la

4
detección de brotes intrahospitalarios y en la comunidad, mejorando así el control y la

vigilancia entre países a nivel mundial haciendo posible la ejecución de estudios

epidemiológicos. Pese a su notable importancia, existen pocos estudios realizados que

utilizan la genómica para la identificación de los componentes del SCCmec y la

evaluación de la epidemiología molecular de S. aureus en Latinoamérica, estas

limitaciones se deben a la necesidad de habilidades para el manejo de herramientas

bioinformáticas y los altos costos de secuenciamiento. Este estudio tuvo como

objetivo analizar cuáles son los cassettes cromosómicos de Staphylococcus aureus

resistente a la meticilina de mayor frecuencia en Latinoamérica, para ello se realizó

un análisis bioinformático de genomas de S. aureus meticilino resistentes disponibles

en NCBI en el periodo de 2000-2024.

II. OBJETIVO E HIPÓTESIS

A. Objetivo general
Caracterizar genómicamente las secuencias públicas de Staphylococcus

aureus resistente a la meticilina en Latinoamérica en el periodo del 2000-

2024.

5
B. Objetivos secundarios

● Determinar los complejos clonales (CC) relacionados a los

Secuenciotipos (ST) Staphylococcus aureus resistente a la meticilina

en Latinoamérica en el periodo del 2000-2024.

● Determinar los genes de resistencia , genes de mutación y factores de

virulencia presentes en los genomas de Staphylococcus aureus

resistente a la meticilina en Latinoamérica en el periodo del 2000-2024

● Determinar la frecuencia de los CC y SCCmec según al año y país de

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en Latinoamérica en

el periodo del 2000-2024

● Determinar la relación filogenética Staphylococcus aureus resistente a

la meticilina en Latinoamérica en el periodo del 2000-2024.

6
III. MATERIAL Y MÉTODOS

A. Diseño

El estudio realizado fue observacional de tipo transversal.

B. Población y lugar de estudio

Se utilizaron todas las secuencias públicas del genoma completo de MRSA,

descargadas de la base de datos “Sequence reads archive (SRA)” y “Genome

Browsers” del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Estas

secuencias provienen de varios países latinoamericanos, incluyendo

Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Ecuador, Uruguay, Paraguay, Perú,

Venezuela y México. Los códigos de acceso de SRA se obtuvieron a partir de

una revisión de artículos realizada con el sistema PRISMA (30), que abarcó

publicaciones entre el 2000 hasta 2024. La metadata de las secuencias

públicas se obtuvo en un archivo con formato csv descargado de “Isolates

Browser”, mientras que aquellas provenientes de artículos se obtuvieron

mediante tablas y materiales suplementarios de las publicaciones.

C. Tamaño de muestra

Para este estudio, se trabajó con el total de la población disponible de

secuencias públicas del genoma completo de MRSA. Inicialmente, se

consideraron un total de 4,168 genomas, de los cuales se excluyeron aquellas

que estaban duplicadas, así como los que no presentaban el gen mecA o que

no cumplían con una cobertura >90% para la tipificación de cassettes

7
 cromosómicos. Finalmente, se retuvieron 994 secuencias, cuya información

detallada se describe en el diagrama de STROBE (Figura 1).

D. Variables

Variable Definición conceptual Definición Indicador Tipo y escala de

operacional medición
Cassettes Es un elemento genètico Resultados I al XIV Cualitativa
cromosòmicos mòvil que contiene encontrados del Categórica
genes de resistencia secuenciamiento de Nominal
como el mecA S.aureus mediante
SCCmec Finder 1.2
Genes de Genes que participan en Resultado de genes mecA Cualitativa
resistencia los mecanismos de resistencia a tet(38) Categórica
resistencia meticilina blaZ Nominal
encontrados en el blaI
secuenciamiento blaR1
mediante AMR fosB
FinderPlus junto al erm
programa BLAST mecl

Factores de Habilidades adquiridas Resultado de lukE Cualitativa

virulencia por el microorganismo factores de lukD Categórica
para la ovación de la virulencia lukF-PV Nominal
respuesta inmune encontrados en el lukS-PV
secuenciamiento ACME
mediante AMR Proteína A
Finderplus junto al Estafilocócica
programa BLAST (spa)

Secuenciotipo Definidos por Selas determina ST105 Cualitativa

s secuencias internas de
mediante ST8 Categórica
siete genes
Multilocus ST5 Nominal
housekeeping: arcC,
Sequence Typing ST30
aroE, glpF, gmk, pta, tpi
(MLST) de siete
e yqiL. genes
Complejos Grupos de
Resultado del CC5 Cualitativa
clonales secuenciotipos agrupamiento de CC30 Categórica
relacionados entre sílos secuenciotipos CC8 Nominal
encontrados
Sitio de Lugar de origen de la Dato del área Infección Cualitativa
infección infección causada por el corporal donde se cutánea Categórica

8
 agente patógeno. reporta la infección /sanguínea/otro Nominal
publicado en los
metadatos de los
genomas.
Año Periodo comprendido en Dato del año en el 2000 al 2024 Cuantitativa de
12 en meses que se publicaron intervalo
los metadatos de
los genomas.
País Espacio territorial Dato del país Perú, Cualitativa
geográfico que posee Latinoamericano Argentina, Categórica
características culturales donde se Brasil, Chile, Nominal
propias. publicaron las Colombia,
secuencias Uruguay,
genómicas. Paraguay,
Ecuador,
Venezuela,
Haití, México

E. Procedimientos
a. Búsqueda y selección de artículos científicos

Para la búsqueda sistematizada de artículos con secuencias publicadas

de MRSA en países latinoamericanos se siguieron los pasos

propuestos por Arksey, O’Malley y Levac et al y los 27 ítems

establecidos por la guía para publicación de Revisiones Sistemáticas:

Declaración PRISMA-P 2022 (30, 31)

1. Primera fase: Se definió la pregunta de investigación y se

estableció los criterios de inclusión/ exclusión en función de

los objetivos planteado

2. Segunda fase: Se desarrollaron términos clave estructurados

para la búsqueda sistemática en bases de datos como PubMed,

LILACS y Scielo. En PubMed se emplearon términos MeSH:

9
 (((Staphylococcus aureus) AND ((MRSA) OR (SCCmec))

AND ((genome) OR (sequencing) OR (WGS))). Se aplicaron

filtros para seleccionar únicamente artículos clásicos, artículos

breves, estudios clínicos, limitados al periodo 2000-2024. Para

la búsqueda en Scielo y LILACs se emplearon los términos “S.

aureus, MRSA, SCCmec”.

3. Tercera fase: Se identificó el título, resúmenes y metodología

de los estudios, seleccionando aquellos que cumplieron con los

criterios de inclusión.

4. Cuarta fase: Se extrajeron los datos más relevantes de los

estudios seleccionados.

5. Quinta fase: Se analizaron y sintetizó los hallazgos.

Criterios de inclusión

- Artículos como parte de su metodología emplearon el

secuenciamiento del genoma completo de S.aureus.

- Los genomas publicados deben originarse exclusivamente de

estudios realizados en seres humanos

- Los genomas de S.aureus publicados en los artículos deben

provenir de países Latinoamericanos (Perú, Argentina, Brasil,

Chile, Colombia, Uruguay, Paraguay, Ecuador, Venezuela,

Bolivia, Guatemala, Nicaragua, Panamá,El Salvador, Haití,

Costa Rica, México, República Dominicana, Honduras y Cuba)

Criterios de exclusión

10
 - Artículos de revisión y cartas al autor

- Artículos que no estén dentro del periodo del 2000-2024.

b. Búsqueda de secuencias genómicas en bases de datos

Se obtuvo las secuencias genómicas completas de todas las

publicaciones encontradas en el sistema de detección de patógenos

“Isolates Browser” del National Center for Biotechnology Information

(NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/isolates/) mediante

un filtro de búsqueda: ("Staphylococcus aureus") AND epi_type:

("clinical") AND host:("Homo sapiens") AND geo_loc_name:

("PARAGUAY" "ARGENTINA" "COLOMBIA" "BRAZIL"

"CHILE" "PERU" "MEXICO" "ECUADOR" "VENEZUELA"

"COSTA RICA" "URUGUAY" "CUBA" "HONDURAS"

"PANAMÁ" "REPÚBLICA DOMINICANA" "BOLIVIA"

"GUATEMALA" "NICARAGUA" "EL SALVADOR" "HAITÍ"), de

los cuales encontramos secuencias públicas únicamente de 11 países:

Argentina, Brasil, Chile, Colombia Ecuador, Haití, México, Paraguay,

Perú, Uruguay y Venezuela.

c. Descarga de reads y secuencias de genomas publicadas

Las secuencias genómicas disponibles en Isolates Browser se

descargaron directamente en formato FASTA, junto con la metadata

en formato “csv”, que incluye información relevante para el estudio

como el país, hospedero, fuente y fecha de aislamiento. Para la

11
 descarga de los reads, se realizó la búsqueda de los BioProject

reportados en los artículos seleccionados, permitiendo obtener las

secuencias reportadas en las bases de datos del NCBI y European

Nucleotide Archive (ENA). Posteriormente, se descargaron en formato

FASTQ con la herramienta “SRA-tolkin”

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra).

d. Ensamblaje de Reads de Artículos científicos

Divididos los reads descargados en formato FASTQ en R1 (forward) y

R2 (reverse) con la herramienta “Fasterq-dump” del paquete “SRA-

tolkin” . Las lecturas crudas pasaron por un control de calidad con

FastQC v0.12.1 (https://github.com/s-andrews/FastQC). Se eliminaron

las lecturas con valores de calidad inferiores a Q>30 (1 error por cada

1.000pb) y se recortaron los adaptadores de las secuencias finales para

obtener archivos FASTQ R1 y R2 pareadas con la herramienta Fastp

0.23.4 (32). Posteriormente los genomas se ensamblaron de novo con

SPAdes 3.15.2 (33), con los parámetros por defecto, obteniendo

genomas en formato FASTA.

e. Eliminación de posibles secuencias duplicadas

Las secuencias de Isolates Browser y los reads obtenidos de SRA-

tolkin se juntaron en una base de datos, posteriormente se hizo la

verificación de BioSamples para buscar posibles duplicados y ser

12
 eliminados mediante el programa R Studio 4.4, finalmente

quedándonos con secuencias únicas.

f. Análisis bioinformático

Para la identificación del gen mecA y la tipificación de cassettes

cromosómicos en genomas ensamblados en archivos FASTA por

SPAdes y las secuencias obtenidas en el NCBI se empleó las

herramientas Staphopia-sccmec 1.0.0

(https://github.com/staphopia/staphopia-sccmec) y SCCmecFinder

v.1.2 (https://github.com/cdnstp/SCCmec_CLA). Los factores de

virulencia fueron identificados con el programa VirulenceFinder v2.0

(https://cge.food.dtu.dk/services/VirulenceFinder/), con una >99% de

identidad. Para la identificación de los secuenciotipos y complejos

clonales se empleó la herramienta MLST v2.23.0

(https://github.com/topics/mlst), el cual suptipico las secuencias según

fragmentos de 450pb de siete genes constitutivos (arcC, aroE, glpF,

gmk, pta, tpi e yqiL). Los genes de resistencia y mutaciones puntuales

se identificaron con la herramienta AMRFinder v3.12.8

(https://github.com/ncbi/amr), considerando solo secuencias que

poseían un porcentaje >= 90% de cobertura e identidad. La

tipificación de las proteínas spa se realizó mediante spaTyper-0.3.3

(https://github.com/HCGB-IGTP/spaTyper).

13
 Para la onstrucción del arbol filogenético, se empleó la herramienta

Parsnps 2.0, basado en diferencia de snps, utilizando el genoma de

referencia ASM1342v1 (CP000253.1,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000253.1/). Posteriormente,

los core-genomas alineados que se obtuvieron en archivo NWK.

Finalmente, la filogenia fue visualizada y anotada con iTOL

(https://itol.embl.de/).

F. Aspectos éticos

No se empleó información de pacientes ya que solo accedimos a las

secuencias de genomas completos en las bases de datos públicas. Durante la

implementación del estudio se respetaron los principios éticos delineados en

la Declaración de Helsinki, y se siguieron estrictamente las recomendaciones

realizadas por el CIE-UPCH.

G. Plan de análisis

Las variables categóricas se resumieron como frecuencias y proporciones. La

diversidad clonal se determinó mediante el índice de Simpson con paquete

Vegan 2.6 y las tablas de se realizaron con el programa R Studio 4.4.

14
IV. RESULTADOS

Se identificaron un total de 129,791 secuencias de genomas completos de S. aureus

en NCBI, de las cuales solo 784 cumplieron con los criterios de inclusión. A través de

la búsqueda en PubMed (n=240), SciELO (n= 29) y LILACS (n= 65), se recopilaron

334 artículos, de los cuales 18 fueron incluidos según los criterios Prisma. De estos

artículos, se obtuvieron 451 archivos fastq de la la base de datos SRA, tras en

ensamblaje, se incluyeron 210 secuencias (figura 1).

El análisis final incluyó 994 secuencias provenientes de 13 países latinoamericanos:

Brasil (324; 32.6%), Chile (172; 17.3%), Argentina (138; 13.9%), Paraguay (77;

7.7%), Colombia (73; 7.3%), Guatemala (51; 5.1%), México (43; 4.3%), Venezuela

(37; 3.7%), Ecuador (29; 2.9%), Bolivia (25; 2.5%), Perú (11; 1,1%), Uruguay (10;

1.0%) y Cuba (4; 0.4%).

Más del 80% de los aislados pertenecieron a tres secuenciotipos principales: ST5

(28.3%) distribuido en Brasil, México y Guatemala; ST105 (22.2%), predominante

en Brasil y Chile; y ST8 (15.9%), frecuente en Colombia y Ecuador. Los SCCmec

más comunes fueron IIa (36.8%) y IVc (29.9%), y con mayor presencia en Brasil

(55.5%) y Argentina (23.2%), respectivamente (Tabla 1).

Observamos la distribución de los SCCmec y STs según países latinoamericanos. En

Brasil y Chile hubo mayor proporción de SCCmec-IIa junto al ST105. En Argentina

y Paraguay se evidenció mayor frecuencia de SCCmec-IVc con el ST30, mientras que

Ecuador, Colombia y Cuba presentaron el genotipo ST8-SCCmec-IVc. Además el

llamado clon Chileno/Cordobés (ST5-SCCmec-Ib) se presentó en Perú y Venezuela

(Fig. 2).

15
El SCCmec-IIa se distribuye principalmente en los ST5 y ST105, predominante en

países como Brasil (55.5%) y Chile (21.6%). Su mayor frecuencia se observó en

2020, alcanzando el 31.4%, y presentó una mayor diversidad entre todos los

SCCmec, según el índice de simpson (0.95). Por su parte, el SCCmec-IVc, viaja con

los ST30 y ST8, fue más frecuente en 2019 (29.6%) en países como Argentina

(23.2%), Paraguay (22.9%) y Colombia (18.5%) (Tabla 1).

Respecto a los factores de virulencia, más del 90% de los genomas presentaron genes

codificadores de PVL (leucocidina de Panton-Valentine), los más frecuentes fueron

LukD/E-PV (57.2%), LukD/E/F/S-PV+ (18.3%) y LukF/S-PV+ (11.9%) (Tabla 2). Se

evidenció que durante el 2021 la mayoría de LukD/E-PV se encontraban en ST105

(40%) y ST5 (34%), principalmente en Brasil y Chile en un 51.1% y 23.1%

respectivamente. Además los LukF/S-PV+, que solo se evidenciaron el ST30,

presentaron una frecuencia de 40% durante el 2019 y esta fue disminuyendo a 13%

hasta el 2023 (Tabla 2).

Se evidenció que en su mayoría de las secuencias fueron tipificadas como spa-t002

(32%), predominante en los ST5 (60%) y ST5 (29%) con mayor frecuencia en Brasil

(60.8%) y Chile (21.6%). Los spa-t019 (10.7%) pertenecían exclusivamente al ST30,

siendo más común en el 2019 en países como Argentina y Paraguay. Por su parte, los

spa-t008 (10%) fueron más frecuentes en 2020, mostrando una menor diversidad

según el índice de Simpson (0,62) a comparación de los spa-t002 y spa-t019, que

exhibieron índices de diversidad más alto (0.96 y 0.99 respectivamente) (Tabla 3).

Mediante la agrupación de genotipos como los CC, SCCmec, tipo de proteína spa y

presencia de PVL, se evidenció una mayor frecuencia de CC5-MRSA-IIa-t002-

16
lukD/E-PV+ (n=183/18.4%), de los cuales 101 genomas que albergaban mutaciones

sinónimas en los genes gyrA(E88K;S84L) y parC(E846; S80Y) en secuencias

obtenidas del 2015 al 2023 principalmente en Brasil (n=100), asimismo 72 genomas

con dicho genotipo tenían mutaciones gyrA(S84L) parC(E846; S80Y), estas se

obtuvieron desde 2017 al 2024 con mayor frecuencia en Chile (n=50) seguido de

Brasil (n=19) (Tabla 4).

En análisis filogenético, las secuencias se agruparon en 2 clados principales. El

primero incluyó al ST30, relacionado al SCCmec-IVc, y todas las secuencias

contenían los genes lukF/S. El segundo clado se dividió en 2 subclados, de los cuales

el segundo, más representativo, se subdividió en 4 ramas principales (ST5, ST8,

ST105 y ST239). Observamos que ST8 y ST239 comparten una rama de origen en

común, ST8 contiene en su mayoría al SCCmec-IVc y genes lukD/E, lukF/S y el

ST239 contiene SCCmec-IIIa y genes lukD/E. En relación a los clados ST5 y ST105

se observa que forman parte de una misma rama presentando características similares,

además se evidenció que todas las cepas ST105 siguieron el patrón SCCmec-IIa-

lukD/E-PV+ y en su mayoría tenían genes COMER. El clado ST5 fue el

predominante y aquel con mayor diversidad de SCCmec, la mayoría de secuencias

siguieron el patrón de ST5-SCCmec-IIa-lukD/E-PV+, además se evidenció la

presencia del SCCmec-Ib con ausencia de genes COMER. Se encontraron los genes

mer y cop, que codifican elementos genéticos COMER en el 75% de los genomas.

Sin embargo, no se evidenció la presencia de genes codificadores de ACME en

ninguna de las secuencias.

17
Los genes de resistencia a tetraciclinas tet(38) estuvieron presentes en el 98% de las

secuencias, seguido de los genes blal, blaR1, blaZ (89%,74%,66% respectivamente).

Estos genes se caracterizan por conferir resistencia a betalactámicos, reportándose

con mayor frecuencia en Brasil, durante el periodo del 2020 donde se registró un alto

reporte de estos 3 genes (19.6%, 20.2%, 23.4% respectivamente). Además se mostró

al gen erm(A) como mecanismo de resistencia a macrólidos y lincosamidas en un

44% de secuencias. (Tabla5).

V. DISCUSIÓN

En Latinoamérica, identificamos al clon CC5-ST105-IIa-t002 como el predominante

con una prevalencia del 18.4% entre 2015-2024. En 1998, el clon hizo su primera

aparición en Suiza y su frecuencia fue de 0 a 32% hasta el año 2004, diferenciándose

del clon NewYork/Japonés (ST5-SCCmecII) por una mutación en una base del alelo

yqiL (34). En Austria se reporta un aumento de 37% desde sus primeros reportes en

2002 hasta el 2012 (35). Estudios realizados en 2009 en Pensilvania, USA, reportaron

al clon CC5-ST105-IIa-t002 como el segundo más frecuente con 22.4% (19),

posteriormente en Nueva York, en el año 2014, se reporta un brote intrahospitalario

de la cepa en neonatos. En Latinoamérica se estima que la expansión del clon inicia el

año 2009 en Brasil, donde recibe el nombre de Río de Janeiro (RdJ), hasta 2017

presentó una frecuencia de 41.9% en muestras sanguíneas (36).

Identificamos que el 21.3% de cepas RdJ provenientes de Brasil y Chile fueron

multidrogoresistentes. Estudios previos realizados New Hampshire, USA reportan

que dicho clon principalmente presentaba genes aadD, ant(9)-Ia y ermA, que otorgan

18
resistencia a kanamicina, aminoglucósidos y eritromicina respectivamente (37). Sin

embargo en nuestros hallazgos se evidencia que las cepas RdJ de Chile no

presentaron genes APH(3′)-III, aac(6´) que confieren resistencia a aminoglucósidos,

por otro lado, si se presentaron en cepas ChC. Esto sugiere que los genomas

provenientes de dicho país podrían presentar mutaciones silenciosas o pérdida de

transposones debido a que dichos genes se encuentran en el transposón y Tn3854.

El clon Chileno/Cordobés (ChC/CC5-SCCmec-I) se presentó en 3.2% de genomas, la

mayoría de cepas provenientes de 2014. Un estudio multicéntrico realizado en EE.UU

estima que dicho clon se originó en la década de 1970 en Chile (38). El clon hace su

primera aparición en Europa a inicios del año 2000 con 63 aislados en un hospital

Alemán, posteriormente disminuye a un 2.3% hasta 2010 (39), adicionalmente en se

Chile reportó que la frecuencia de ChC disminuyó en un 38% según reportes del 2000

al 2016 (27). Posteriormente, en Perú del 2017-2019 se reportó que la frecuencia del

clon fue 70%, sin embargo en dicho estudio se hizo la genotipificación a las cepas

MRSA por PCR (40). La discrepancia entre estos resultados puede deberse a que los

métodos moleculares no son tan específicos como el WGS y en Perú no se han

realizado investigaciones en las que se secuencie el genoma completo de cepas

MRSA para la actualización de la data. Además, el éxito del clon RdJ puede deberse

a que los SCCmec-IIa presentan una mayor diversidad genómica permitiendo su

adaptabilidad y mayor supervivencia, a comparación del SCCmec-Ib que con el paso

del tiempo está siendo desplazado.

Se identificó al clon CC30-SCCmec-IVc, portador del spa t019, como el segundo más

frecuente, con prevalencias del 3,4% en Argentina y del 3,2% en Paraguay. Su

19
primera observación se remonta a finales del siglo XX en inmigrantes de Nueva

Zelanda, sin registros de tasas de mortalidad. Este clon CA-MRSA, conocido

principalmente como el Clon del Pacífico Suroeste o USA1100, ha sido reportado en

Sudamérica, Asia, Europa y EE. UU. (43,44) Desde su primer reporte en

Latinoamérica, en Uruguay a finales de 2001, CC30-SCCmec-IV siendo analizado

por PCR tradicional mostró un incremento en los casos entre 2002 y 2003, siendo

responsable de importantes brotes y vinculado a altas tasas de mortalidad,

especialmente en adultos (>39años) hospitalizados que desarrollaron bacteriemia

representando 6.25%. Aunque originalmente dicho clon fue asociado a infecciones

asociadas a la comunidad, ha logrado establecerse en hospitales, dada su capacidad

de diseminación (45-47). Respectivamente, el genotipo CC30-SCCmec-IVc mediante

PCR-multiplex asociado al spa t019 apareció en Argentina tanto en infecciones por

CA-MRSA y HACO-MRSA, presentándose inicialmente con una baja frecuencia en

el 2004, pero con un aumento gradual durante el periodo 2005-2008 (48).

Posteriormente, entre el 2009-2011 se observó en el mismo país un incremento del

70% en su prevalencia dentro del entorno hospitalario generando una preocupación

para el sistema de salud. (49,50). Por su parte, un estudio en Paraguay mediante PCR

tradicional reportó la presencia del clon CC30-SCCmec-IV, con el tipo de spa t019

como el más frecuente, en cuatro centros médicos de referencia. Entre 2009 y 2010,

estos aislamientos, obtenidos de niños menores de 16 años, mostraron una

prevalencia del 54%, la cual aumentó al 65% entre 2012 y 2013 (51,52).

La mayoría de estudios sobre este clon lo identifican como CC30-SCCmec-IV, ya

que utilizan el método tradicional de tipificación de SCCmec mediante PCR. Sin

20
embargo, en 2002 se introdujo un nuevo método de PCR múltiplex, que permite

detectar subtipos de SCCmec y proporciona información más detallada para

comprender mejor la epidemiología de los brotes clonales de CA-MRSA. Gracias a

este avance, el clon comenzó a denominarse CC30-SCCmec-IVc, como se presenta

en este estudio. Aun así, es razonable suponer que se trata de un mismo clon. (53,54)

En Latinoamérica, el clon USA300 (CC8-SCCmecIVa-t008) está siendo desplazado

por el clon Rdj (CC5-ST105-IIa-t002). Según nuestros datos, el USA300 representó

solo el 2.6% de los aislamientos, la mayoría provenientes de Brasil. Este clon,

considerado uno de los CA-MRSA más agresivos debido a la versatilidad de sus

factores de virulencia como los PVL ha sido reportado con frecuencia en los últimos

20 años en países del norte de Sudamérica, así como en Asia, Europa y EE. UU. (55)

Estudios previos realizados en Bélgica, entre 2006 y 2019, informaron que USA300

representó el 12% de cepas comunitarias y el 30% de ellas tenía genes codificadores

de PVL (56). En Japón un estudio del 2018 al 2021 reporta que el 90% de sus

aislados fueron PVL positivos, en su mayoría eran USA300 y cepas con SCCmecV

que en son observados generalmente en entornos comunitarios (57). Asimismo, un

estudio realizado en China (2022) indicó tasas de PVL positivos en cepas CA-MRSA

(53.1%) y HA-MRSA (35.7%), sin embargo no se encontraron diferencias

estadísticamente significativas entre los aislamientos (p=0.142) (58). En nuestro

estudio se evidenció que más del 90% de las secuencias analizadas, entre CA-MRSA

y HA-MRSA fueron PVL positivas, de tal modo evidenciamos que los genes luk

codificadores de la toxina PVL, se han expandido a entornos hospitalarios, hecho que

genera preocupación debido a que la presencia de dicho factor de virulencia se

21
relaciona a un alto riesgo patogénico, además se sugiere que el PVL ya no deben ser

considerado un marcador específico de cepas comunitarias.

Con respecto a la tipificación de la proteína spa, hubo mayor frecuencia de spa-t002

en el CC5: ST105 (60%) y ST5 (29%), resultados similares se encontraron en Japón,

donde la mayoría de cepas CC5 (23/27) poseían el spa-t002 (41). Además, en China

se evidenció que el 28% de cepas CC5 presentaron el genotipo SCCmec-II con spa-

t002 (42). Un estudio multicéntrico en Europa reportan el predominio de spa-t002

(86,9%%) en sus aislados CC5/ST5, sin embargo estos tenían el SCCmec-IVc. Con

ello evidenciamos que las proteínas spa están estrechamente relacionadas a los

Complejos clonales de S. aureus, esto independientemente del espacio geográfico.

Asimismo los SCCmec y las spa no tienen una relación directa aunque ambos pueden

compartir linajes clonales.

La presencia de genes que constituían COMER, considerando un elemento presente

sólo en cepas Latinoamericanas, fue de un 75%, asimismo no reportamos ningún gen

codificador de ACME. Estos hallazgo, coinciden con la investigación de Planeta y

cols (59) donde relaciona los aislados de América del Norte con la adquisición del

elemento móvil catabólico de arginina (ACME) y los aislados de América del Sur con

la adquisición del elemento móvil de resistencia al cobre y al mercurio (COMER), en

su estudio lo más resaltante fue que el 47% de sus aislados contenían los genes de

ACME y pertenecían a países de América del Norte. De tal manera se puede designar

a aquellos elementos como marcadores de cepas Latinoamericanas y

Norteamericanas.

22
VI. LIMITACIONES

- La concentración de secuencias en algunos países podría generar un sesgo en

el análisis. En el estudio Brasil, Chile y Argentina son los países con

secuencias predominantes, esto podría influir en la representación de los

clones dominantes en la región.

- La falta de datos clínicos puede es otra limitación ya que con ellos podríamos

realizar la asociación entre los clones con el foco de infección, sexo y grupo

etario para tener reportes epidemiológicos más completos.

- Durante nuestro análisis, varios estudios de referencia destacaron las

limitaciones de la PCR convencional que emplearon para identificar los tipos

y subtipos de SCCmec. Estas limitaciones pudieron haber comprometido una

visión amplia y precisa del análisis del cassette cromosómico en SARM,

generando así un sesgo en los resultados.

VII. CONCLUSIONES

En conclusión, este estudio pone en evidencia que el genotipo CC5-ST105-

IIa-t002 conocido como “Rdj” sigue circulando con una alta frecuencia en

Latinoamérica hasta mayo del 2024. Asimismo, se observaron diferentes tipos

de SCCmec demostrando la variedad según el ámbito a nivel hospitalario o de

la comunidad.

23
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IX. TABLAS, GRÁFICOS Y FIGURAS

Figura 1: Gráfico de Strobe para búsqueda de artículos originales que reportaron

secuencias de genoma completo de Staphylococcus aureus y búsqueda de secuencias

por NCBI Isolates Browser, SRA.

31
Figura 2: Identificación de SCCmec y ST’s según su distribución en Latinoamérica

32
Figura 3: Filogenia de MRSA en Latinoamérica, según STs, SCCmec, PVL y

COMER

33
Tabla 1: Distribución del marcador molecular SCCmec según el ST en países de

Latinoamérica.

34
Tabla 2: Distribución del marcador molecular PVL según el ST en países de

Latinoamérica.

35
Tabla 3: Distribución del marcador molecular spa según el ST en países de

Latinoamérica.

36
Tabla 4: Distribución de los genotipos más frecuentes según los genes de mutaciones

en países de Latinoamérica y años.

37
Tabla 5: Distribución de los genes de resistencia según los ST en países de

Latinoamérica.

38