CURVA DE CALIBRACIÓN DE
POLIFENOLES TOTALES
CURVA DE ÁCIDO GÁLICO
I. Preparación de solución de ácido gálico
Preparar la solución usando 0.1 g de ácido gálico aforado en 100 mL de
solvente usado en la extracción de polifenoles de la muestra (para cada
solvente se debe hacer una curva de calibración), esto es una
concentración 1000 μg de ácido gálico/mL. A esta solución se le debe diluir
1/10 con más solvente, para obtener el patrón 100 μg de ácido gálico/mL.
Hacer las diluciones necesarias como mínimo 5, por ejemplo, pueden
hacer 7 diluciones: 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 μg de ácido gálico/mL.
II. Procedimiento de análisis
1. El método que se utilizó fue Folin – Ciocalteau, que por ser un método
colorimétrico debe tenerse cuidado de diluir correctamente la muestra,
para que la lectura de absorbancia sea óptima.
2. El reactivo Folin lo venden puro, así que debe diluirse 1/10, para ser
usado, y guardarlo en un recipiente forrado con papel alumnio y
refrigerado.
3. El carbonato de sodio al 7.5% P/V (7.5 g de carbonato de sodio aforado
a 100 mL) este reactivo debe guardarse igual que el reactivo Folin,
cuando es preparado.
4. Debe tener prendido el bañomaría a 45 °C.
5. Como se puede ver, son dos reactivos los que participan en esta
determinación: reactivo Folin 1/10 y Carbonato de sodio al 7.5%. La
mezcla se hace de la siguiente forma:
a. 0.5 mL de patrón se mezcla con 2.5 mL de reactivo de Folin
1/10. Dejar reposar 5 min.
b. Al cabo de 5 min, se adiciona a la mezcla anterior 2 mL de
solución de Carbonato de sodio 7.5%.
c. Para el blanco de muestra, se debe hacer lo mismo, pero con 0.5
mL de solvente puro (si se usan 2 solventes, deben hacerse 2
blancos).
d. Se recomienda hacer las muestras por duplicado.
e. Inmediatamente después calentar los tubos a 45 °C por 15 min
(cronometrados) incluido el tubo de blanco. La mezcla antes de
entrar a calentamiento tendrá un color verde claro, y al final de
la incubación será celeste.
6. Al cabo del calentamiento de los tubos, se debe medir la absorbancia a
765 nm.
7. Repetir la misma operación para las demás diluciones, en este caso 8
con lo que se obtendrán 8 lecturas de absorbancia. Los datos se
presentan a continuación, usando solvente etanol : agua destilada
50/50, acidificada al 0.01% de HCl al 37% de pureza. Se obvió la
concentración 100.
M. Sc. Roberto Chuquilín Universidad Nacional de Huancavelica
Perú
C
N° (ug/mL) Abs
1 90 1.048
2 80 0.897
3 70 0.83
4 60 0.758
5 50 0.637
6 40 0.506
7 30 0.386
8. Graficar los datos concentración versus absorbancia y observar el valor
de la pendiente (m) y el coeficiente de determinación (R 2). Si el
coeficiente de determinación es cercano a 1.0 o al 100%, la pendiente
puede ser usada para ser reemplazada en la ecuación que determina la
cantidad de polifenoles totales equivalente en μg de ácido gálico/g.
Una observación, seguro se preguntarán qué pasó con la intersección
del eje “Y”, por qué se ha obviado. La respuesta es que su valor es tan
bajo que, se asume pasa por el origen de las coordenadas, y así
debería de ser, pues una condición de la Ley de Lambert – Beer. A
continuación, se presenta la gráfica.
Curva de calibración con etanol
50/50 - HCl 0.01%
1.2
1
f(x) = 0.010575 x + 0.0886428571428573
Absorbancia
0.8 R² = 0.988936235394121
0.6
0.4
0.2
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Ácido gálico (µg/mL)
9. Se puede observar que, la pendiente es 0.0106 mL/μg. Para la
determinación de polifenoles totales debe usarse en la ecuación
siguiente:
( )
μg ácido gálico A . D2
Polifenoles totales =
g de muestra m. D1
Dónde:
A = absorbancia promedio (mínimo de dos réplicas).
D2 = segunda dilución de muestra (100 para la primera extracción).
m = pendiente de la curva de calibración (mL/µg) diseñada con el
solvente usado.
D1 = primera dilución de la harina de pulpa de ayrampo (0.05 g/mL en
P/V).
2
[Link] el caso de solvente agua destilada la pendiente es 0.012 mL/µg y
para el solvente metanol : agua destilada 50/50, acidificado con 0.01%
de HCl al 37% de pureza la pendiente es 0.016 mL/µg.
[Link] diluciones pueden hacerse en 10 mL de la siguiente manera:
Concentrac
ión 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
(µg/mL)
Patrón (mL) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Solvente
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
(mL)
