TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Y MOLECULARES EN

MICROBIOLOGÍA
.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Importancia de realizar un diagnóstico La complementariedad existente entre
etiológico en microbiología: epitope y paratope condiciona la relación
específica entre antígeno y anticuerpo.
• Identificar el agente etiológico de una
infección. La especificidad es una característica de un
• Conocer la susceptibilidad a una anticuerpo por el cual reconoce e
infección. interacciona con un solo determinante
• Determinar la sensibilidad del agente antigénico o epitope. Es la capacidad de un
etiológico al tratamiento. anticuerpo de distinguir una estructura
• Modificar la terapia inicial empírica. química en particular (entre millones). Esta
• Establecer medidas de profilaxis especificidad constituye el eje del
adecuadas. funcionamiento del sistema inmune
adaptativo.
PROPIEDADES DE LAS TÉCNICAS
La sensibilidad es la capacidad de una
Una buena prueba diagnóstica debe ofrecer prueba de dar un resultado positivo en
resultados correctos y cumplir con los presencia de una infección.
parámetros de validez y seguridad:
→La especificidad analítica es el grado en
La validez es el grado en que un test mide lo que la prueba distingue entre el Ag o Ac en
que se supone que debe medir. ¿Con que cuestión y otros componentes que pueden
frecuencia el resultado del test es confirmado ser detectados en la prueba. Es la capacidad
por procedimientos diagnósticos más de una técnica de identificar únicamente al
complejos y rigurosos? La especificidad y la Ag o Ac, para el que fue diseñada. En este
sensibilidad de un test son medidas de su caso, una técnica con alta especificidad
validez. detecta solamente un Ag o Ac y no presenta
reacciones cruzadas entre Ag o Ac similares.
La seguridad viene determinada por el valor
predictivo de un resultado positivo o →La sensibilidad analítica es el límite inferior
negativo. ¿Con que seguridad un test de detección de un Ag o Ac en una prueba.
predecirá la presencia o ausencia de Indica la cantidad de Ag o Ac que es capaz
enfermedad? Ante un resultado positivo de de detectar una prueba, por lo tanto, cuanto
un test ¿qué probabilidad existe de que este más sensible es una técnica, menor
resultado indique presencia de la concentración de Ag o Ac puede detectar.
enfermedad? Veremos que esta probabilidad
PROPIEDADES DIAGNÓSTICAS INTRÍNSECAS
está muy influenciada por la prevalencia de
• Especificidad diagnóstica
la enfermedad.
• Sensibilidad diagnostica
PROPIEDADES ANALÍTICAS INTRÍNSECAS
La especificidad diagnóstica se define como
• Especificidad analítica
la probabilidad de clasificar correctamente a
• Sensibilidad analítica
un individuo sano, es decir, la probabilidad de
que para un sujeta sano se obtenga un muestra. En cambio, una técnica de alta
resullado negativo. En otras palabras, se sensibilidad detecta bajas concentraciones
puede definir la especificidad como la de Ag o Ac, descartando los falsos negativos.
capacidad para detectar a los sanos o
PRPIEDADES DIAGNÓSTICAS EXTRÍNSECAS
capacidad de un método de dar resultado
• Valor predictivo positivo
negativo en ausencia de una infección.
• Valor predictivo negativo
La sensibilidad diagnóstica es la
El valor predictivo es la probabilidad de que
probabilidad de clasificar, correctamente a
un individuo con resultado positivo esté
un individuo enfermo, es decir, la
realmente infectado (VPP) o de que un
probabilidad de que para un sujeto enfermo
individuo con resultado negativo esté
se obtenga en la prueba un resultado
realmente no infectado (VPN).
positivo. En resumen, la sensibilidad es la
capacidad del test para detectar la La sensibilidad y la especificidad son
enfermedad. intrínsecas del método, en cambio, el valor
predictivo depende de la prevalencia de la
En ocasiones un anticuerpo es capaz, de
infección.
formar complejos estables con estructuras
químicamente relacionadas, o no, con el El VPP y VPN se encuentran muy influidos por
epitope contra el cual se produjo. Un la prevalencia de la patología que queramos
anticuerpo que pueda reaccionar con estudiar, de tal manera que, en ocasiones,
antígenos de estructura similar al antígeno tendrá un mayor valor predictivo el resultado
original que desencadenó la respuesta negativo que el positivo.
inmune se conoce como reactividad
El resultado de una misma prueba
cruzada.
serológica pueda tener diferente valor
¿Cuál es la importancia de conocer la predictivo → si empleamos una prueba para
sensibilidad y la especificidad de las técnicas detección del virus de la hepatitis B con una
de laboratorio? sensibilidad y especificidad de 99%:

Veamos un ejemplo: a 100 personas se les →En un banco de sangre (la prevalencia en
extrae sangre para realizar el diagnóstico de donantes de sangre es de 0,8%) el VPP será
una enfermedad infecciosa, con una técnica de 47%
que presenta una sensibilidad de 70% y una
→Esa misma prueba empleada en una
especificidad de 95%.
población de pacientes con síntomas
→En el caso de la sensibilidad, esta técnica compatibles de enfermedad (por ejemplo, en
mostrará 30% de falsos negativos, es decir, de un laboratorio de análisis clínicos, donde los
cada 100 personas enfermas, habrá 30 a las pacientes tienen una prevalencia del 10%)
que no se les detectó la enfermedad. presenta un VPP de 91%.

→Por otro lado, una especificidad de 95% Por lo tanto, podemos observar que en una
implica que habrá 5% de falsos positivos, zona de alta endemicidad el VPP de un
indicando que 5 personas de cada 100 resultado positivo es más alto que en una
tendrán un resultado de enfermedad, aunque zona no endémica (por lo tanto, la
no estén enfermos. probabilidad de resultado falso
positivo es menor).
En general, las técnicas muy específicas no
presentan falsos positivos porque identifican
correctamente los Ag o Ac presentes en la
 TÉCNICAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA
Las técnicas que se basan en este tipo de
interacción suelen trabajar con anticuerpos
marcados con compuestos detectables.

• Radioinmunoensayos (RIA)
• Ensayo
inmunoradiometrico (IRMA)
Inmuno
• Ensayo inmunoabsorbente
ensayos
ligado a enzimas (ELISA)
• Inmunofluorescencia (IF)
• Quimioluminiscencia
• Wetern Blot
Inmuno
• Ensayo recombinante de
blots
inmunoblot (RIBA)

Inmunoensayos
Los inmunoensayos requieren instrumental y
TIPOS DE TÉCNICAS
personal entrenado. Son técnicas de elevada
• Técnicas inmunológicas sensibilidad y especificidad para la detección
• Técnicas moleculares de Ag y Ac. Utilizan antígenos y anticuerpos
marcados para poder medir la reacción y
TECNICAS INMUNOLÓGICAS cuantificarlos cuando se forman los
Las técnicas inmunológicas se utilizan para complejos inmunes.
detectar, identificar y cuantificar antígenos
• Radioinmunoanálisis
en muestras clínicas, así como para evaluar
Los Ac están marcados con compuestos
la respuesta humoral frente a la infección y
radiactivos y la detección de las emisiones
los antecedentes de exposición a agentes
radiactivas se realiza con un contador de
infecciosos de un individuo (es decir,
rayos gamma (RIA o IRMA). Presentan gran
búsqueda de anticuerpos).
sensibilidad, pero ya no se usan porque los
Por esto, las pruebas inmunológicas sirven isótopos radiactivos se degradan y
tanto como métodos directos, como actualmente hay disposiciones más
indirectos (podemos buscar antígenos de un rigurosas para el manejo de materiales
microorganismo en las muestras del radioactivos.
paciente, o podemos buscar anticuerpos del
• Enzimoinmunoanálisis
paciente frente a la infección).
Usan Ac marcados con una enzima y según
En la interacción antígeno – anticuerpo el sustrato utilizado pueden producirse
(unión), se distinguen 2 etapas: la interacción reacciones de cambio de color o producción
primaria (que no es visible), y la interacción de luz (luminiscencia). Son muy sensibles,
secundaria (se caracteriza por la aparición pero requieren instrumental complejo. El
de un fenómeno visible). método más utilizado es ELISA para la
detección de numerosos analitos en
Así podemos clasificar a las técnicas
muestras biológicas, tanto Ag como Ac.
inmunológicas en:
• Fluoroinmunoanálisis
• Técnicas de interacción primaria
Usan Ac marcados con sustancias
• Técnicas de interacción secundaria
fluorescentes (fluorocromos) y son de alta
sensibilidad. Se dividen en directa (IFD) e
indirecta (IFI).
 • Quimioinmunoanálisis Las técnicas de precipitación se basan en la
Usan Ac marcados con sustancias que formación de un complejo antígeno-
producen luz como resultado de una anticuerpo insoluble, el cual precipita en un
reacción química. Mediante esta técnica medio líquido o semisólido.
puede realizarse la detección de numerosos
Al mezclar cantidades suficientes de Ag
analitos en muestras biológicas. Tienen alta
solubles con Ac específicos, la interacción
especificidad y sensibilidad.
Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de
Inmunoblots ser visualizada como un precipitado. Esta red
Los inmunoblots usan Ag de un son grandes complejos inmunes formados
microorganismo adherido sobre un soporte por la interacción Ag-Ac.
de nitrocelulosa (papel) y sirven para
Sirven tanto para búsqueda de antígenos
detectar Ac del paciente. Las reacciones Ag-
como de anticuerpos.
Ac se desarrollan sobre el soporte y se
revelan en forma similar a un ELISA. La Además de la avidez de los Ac, la
formación del complejo inmune se pone en precipitación depende de las proporciones
manifiesto por bandas coloreadas sobre el relativas de Ac y Ag presentes → la zona
papel. La interpretación se realiza donde la precipitación es óptima se
comparando en forma visual la respuesta de denomina zona de equivalencia y se
la muestra del paciente con los controles produce cuando las concentraciones de Ag
positivos y negativos. Son métodos altamente y Ac son equivalentes.
específicos que se utilizan para confirmar
Cómo se evalúan:
resultados positivos de Ac en muestras de
suero obtenidos con otras técnicas >En los medios líquidos, los resultados se
inmunológicas. Los más utilizados son evalúan por turbidimetría o nefelometría. Es
Western blot para infección por VIH y decir, se utilizan equipos especiales que
Recombinant inmunoblot assay (RIBA) para miden la variación de la intensidad de la luz
infección por hepatitis C. transmitida en el tubo de reacción producida

>El western blot es el método de elección para cuando se forman los complejos inmunes.
confirmar la serología positiva de VIH por ELISA. El
>En medio sólido, como un soporte de agar,
reactivo de laboratorio es un soporte de papel que
se evidencia como una o varias líneas de
posee varios Ag de VIH separados en bandas. El
suero del paciente se agrega sobre el soporte y
precipitación visibles. Este tipo de
luego se revela la presencia de Ac anti-VIH. Se precipitación puede realizarse por difusión
considera positivo si aparecen dos o más bandas pasiva o mediante la aplicación de un
específicas del virus cuando se enfrenta con el campo eléctrico (electroforesis).
suero del paciente.
Las más usadas son la inmunodifusión doble
TÉCNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA (IDD) y la contrainmunoelectroforesis (CIEF).
Son sencillos y económicos.
→La IDD puede conocer si 2 Ag son iguales
>Inmunodifusión doble (IDD) (identidad), distintos (sin identidad) o
Precipitación
>Contrainmunoelectroforesis (CIEF)
comparten algún epitope (identidad parcial)
>Aglutinación directa (AD)
y permite enfrentar distintos sueros de
>Aglutinación (AP)
Aglutinación >Aglutinación reversa pasiva pacientes (Ac) contra un mismo Ag conocido.
>Inhibición de la aglutinación Se utiliza para el diagnóstico de hidatidosis
>Coaglutinación (infección causada por Echinococcus
granulosus)
→La CIEF es similar a la IDD pero tiene la distintos Ag bacterianos: O
ventaja de ser más rápida. Se trabaja (somático) y H (flagelar).
aplicando un campo eléctrico, para que el Ag • Serotipificación de Escherichia coli
y el Ac difundan con mayor velocidad y para la detección del serotipo [Link]H7
precipiten en menos tiempo. Se utiliza para productor de una toxina que es la
diagnosticar infecciones micoticas causante del síndrome urémico
producidas por hongos del género hemolítico (SUH).
Aspergillus, Histoplasma o Paracoccidoides.
→La aglutinación pasiva (AP) emplea
Las técnicas de aglutinación utilizan Ag o Ac partículas inertes recubiertas de Ag. Se
adheridos a partículas inertes como látex, pueden utilizar partículas de látex, bentonita,
bentonita, eritrocitos o bacterias muertas, glóbulos rojos. En este último caso se habla
que al ponerse en contacto con el Ac o Ag de hemaglutinación.
complementario producen un agregado
• Detección de Ac contra Ag de S.
visible.
pyogenes
Las reacciones de aglutinación presentan • Detección de Ac anti-Trichinella
mayor sensibilidad que las de precipitación y spiralis
no requieren equipamiento completo. Estas • Identificación de pacientes con
técnicas permiten identificar Ag o Ac pero Brucelosis, infección producida por
deben utilizarse siempre con controles bacterias del género Brucella. En este
positivos y negativos, respetando las caso, la reacción de aglutinación se
condiciones de reacción. denomina "Reacción de Huddleson" y
detecta Ac en el suero del paciente.
Generalmente se usan en forma cualitativa
• Detección de Ac en el suero contra
(+ o -), pero pueden realizarse diluciones de
parásitos como Trypanosoma cruzi,
la muestra para informar el título del Ac.
Toxoplasma gondii o contra virus
Las técnicas de aglutinación se agrupan por como el VIH o el virus de hepatitis B
el tipo de partícula utilizada en la reacción, o (VHB).
según si se adhiere un Ag o un Ac al soporte:
Este método puede presentar aglutinaciones
• Aglutinación directa inespecíficas debidas a la presencia de IgM,
• Aglutinación pasiva por lo tanto, las condiciones de reacción
• Aglutinación reversa pasiva deben ser cuidadosamente controladas e
• Inhibición de la hemaglutinación interpretadas.
• Coaglutinación
→La aglutinación reversa pasiva (ARP) es un
→La aglutinación directa es una técnica que método en el que las partículas inertes tienen
utiliza Ag que naturalmente se encuentran en adherido el Ac con la zona de unión al Ag
una partícula. Por ejemplo, si se combina una libre para reaccionar.
suspensión bacteriana con un antisuero y se
Este tipo de prueba se utiliza
produce una aglutinación, esto indica una
fundamentalmente para la detección de Ag
reacción positiva. Este método requiere la
microbianos:
aplicación de controles positivos y negativos
procesados junto con las muestras. • Ag de Streptococcus agalactiae
• Ag de Staphylococcus aureus
• Serotipificación de Salmonella spp: se
• Ag de Neisseria meningitidis,
basa en la aglutinación de la bacteria
• Ag de Streptococcus pyogenes
con Ac que reaccionan contra los
• Ag de Haemophilus influenzae
 • Rotavirus TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS
• Cándida albicans Se realizan mediante diluciones seriadas e
• Criptococcus neaformans informan resultados en unidades relativas.

→La inhibición de la hemaglutinación (HA) No puede conocerse la concentración

utiliza glóbulos rojos como partículas. Puede verdadera de Ag o Ac, por lo tanto, el
utilizarse para la detección de antígenos y de resultado se expresa en diluciones.
anticuerpos.
El título de una reacción se define como la
• Defección de Ac contra ciertos virus máxima dilución de la muestra que da
como el virus de la rubéola, positiva en una prueba inmunológica. Para
sarampión, influenza y adenovirus. calcular el título de Ac se realizan diluciones
seriadas del suero del paciente y se
→La coaglutinacion (CoA) es una técnica
enfrentan a una concentración constante y
que utiliza bacterias muertas como soporte
conocida de Ag.
inerte de la reacción. La bacteria mas
utilizada es Staphylococcus aureus, porque TÉCNICAS CUANTITATIVAS
naturalmente une Ac por su región constante Expresan su resultado en cantidades o
(Fc) dejando el sitio activo del Ac para concentraciones, pueden expresarse
interactuar con el Ag específico. entonces como unidades o índices.

Esta prueba se utiliza para la detección de Ag La expresión con unidades está sujeta a la
bacterianos en LCR para identificar bacterias comparación entre los resultados de la
productoras de meningitis (Neisseria muestra respecto a una muestra calibradora.
meningitidis, Haemophilus influenzae y Esto presenta ciertas contras que lo vuelven
Streptococcus preumoniae). poco viable, ya que, por ejemplo, los
resultados que arroje la muestra calibradora
están sujetos al fabricante. Debido a esto se
utilizan índices, que se definen como la
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS relación entre el valor de la muestra sobre la

TÉCNICAS CUALITATIVAS del calibrador. De esta forma, toda muestra

Informan la presencia o ausencia de un Ag o con un índice superior a 1 será clasificada

Ac, por lo que los resultados son como positiva y si es inferior, como negativa.
Esto permite unificar los resultados haciendo
• positivo/negativo o reactivo/no comparables las diferentes marcas entre sí.
reactivo
• Detectado/no detectado
• Presencia/ausencia. TÉCNICAS MOLECULARES

→Las técnicas de interacción secundaria Se basan en la detección de ADN o ARN de

(aglutinación) permiten obtener los microorganismos presente en muestras
directamente el resultado. biológicas o en cultivos.

→Las técnicas de interacción primaria (ELISA) Técnicas sin

• Hibridación
el resultado obtenido será un número que amplificación del
• Microarray
debe compararse con un valor numérico ácido nucleico

estandarizado para esa prueba, denominado Técnicas con

• PCR
amplificación del
punto de corte. El resultado será positivo si el • Filmarray
ácido nucleico
número es mayor al punto de corte
establecido.
 El cultivo convencional es utilizado en el Microarray
diagnóstico microbiológico de los gérmenes Es una automatización de las técnicas
de crecimiento rápido que se desarrollan clásicas de hibridación molecular. Puede
bien en los medios de cultivo. Para aquellos haber múltiples sondas de ADN en el soporte
que no crecen en los medios artificiales o lo del Microarray, lo que permite el análisis de la
hacen muy lentamente, se utiliza la presencia/ausencia o de la expresión de
detección del ácido nucleico del germen muchísimos más genes, e incluso de
directamente en la muestra del paciente, lo genomas compuestos, en una única prueba.
que permite realizar un diagnóstico certero
En el Microarray las sondas de ADN se
en menor tiempo.
encuentran unidas al soporte en una
Esta técnica es más compleja que el enfoque disposición regular y prefijada, donde la
tradicional del cultivo y tipificación de los muestra problema se marca con un
microrganismos, pero la disminución de los fluorocromo. Puede ser ADN o ARN. El soporte
tiempos de incubación y el procesamiento de utilizado comúnmente es el formato porta de
muestras de difícil cultivo mejoraron el vidrio de microscopía debido a su baja
diagnóstico y disminuyeron los tiempos fluorescencia basal y a que admite
requeridos para instaurar el tratamiento. tratamientos de superficie para la unión
covalente de las sondas de ADN.
Como toda técnica de laboratorio debe ser
llevada a cabo con controles positivos y Se utiliza en los estudios de patogenicidad,
negativos de la reacción. determinación de interacciones
microorganismo-hospedador en una
TÉCNICAS SIN AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO
infección, identificación de genes bacterianos
NUCLEICO que codifican para factores de virulencia,
Se basan en la detección de ácidos nucleicos genómica comparativa, genotipado y
microbianos presentes en la muestra filogenia microbianas.
biológica.
Microarray es una palabra inglesa que se
Hibridación utiliza para denominar al “chip de ácidos
Utiliza una sonda de ADN complementaria al nucleicos”.
ADN del microorganismo que se quiere
detectar. La sonda complementaria se TÉCNICAS SIN AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO
encuentra marcada con una sustancia que NUCLEICO
genera una respuesta medible cuando se Se basan en la multiplicación exponencial de
une al ácido nucleico del germen (color, los ácidos nucleicos microbianos presentes
fluorescencia, radioactividad o en la muestra biológica antes de su
quimioluminiscencia). detección.

Las sondas se pueden usar para detectar Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
microorganismos directamente de una Es de gran utilidad para el diagnóstico de
muestra clínica (orina, esputo) o para enfermedades infecciosas ya que es una
confirmar la identificación de un cultivo que técnica sumamente sensible y específica, y
por otros métodos tardaría varios días. aporta resultados en poco tiempo.

También pueden ser usadas en hibridación in La especificidad y sensibilidad radican en la

situ para evaluar la respuesta del huésped a capacidad de esta técnica de amplificar
un agente infeccioso o para determinar la secuencias específicas de ácidos nucleicos
extensión de la infección en muestras de sin importar si se encuentran en bajas
tejido. concentraciones en la muestra biológica.
 • PCR ESTÁNDAR patógenos asociados a diferentes patologías,
Amplifica un segmento de ADN utilizando las cuales generalmente se pueden presentar
cebadores. La confirmación de la en forma de brote o epidemia. Permite la
amplificación se realiza mediante una detección simultánea de bacterias, virus,
electroforesis de ácidos nucleicos. Permite la levaduras, parásitos y genes de resistencia a
detección cualitativa de un segmento de los antimicrobianos.
ADN.
Carga viral
• PCR MÚLTIPLE El estudio de la carga viral consiste en la
Amplifica dos o más segmentos de ADN determinación ADN que está presente en la
utilizando varios cebadores en una única muestra del paciente.
reacción de amplificación. La confirmación
Hay diferentes tipos de pruebas para medir la
de la amplificación se realiza mediante una
carga viral:
electroforesis de ácidos nucleicos. Permite la
detección cualitativa de varios segmentos de →PCR
ADN en una única reacción de PCR.
→BRANCHED ADN
• RT-PCR
Agrega un paso previo a la amplificación que →NASBA

es la conversión del ARN de la muestra a ADN

¿qué es la carga viral no detectable?
por medio de la actividad de una Puede ocurrir muchas veces en el contexto de
Transcriptasa Reversa. Permite evaluar el un paciente que ha consumido determinados
patrón de expresión de genes de un
medicamentos (como lo pueden ser
microorganismos y la detección de virus tipo antivirales, por dar un ejemplo) que
ARN.
interfieren en la capacidad de la técnica de

• PCR en tiempo real o qPCR detectar la presencia del virus. Esto no

Es una PCR estándar que le adiciona tinciones significa necesariamente que el paciente se

o sondas con fluoróforos para la detección de ha curado ni que ha dejado de ser infeccioso,

los fragmentos amplificados al momento de ya que puede deberse a que las pruebas

la reacción, lo que permite prescindir de la utilizadas no son lo suficientemente sensibles

electroforesis de ácidos nucleicos. Permite la como para medir niveles muy bajos de virus

detección cualitativa de uno o varios en la sangre.

segmentos de ADN, la cuantificación de ADN

NUEVAS TÉCNICAS
de la muestra (es decir, la carga) o la
Estudio de polimorfismos genéticos
expresión de genes (si se realiza asociada a
La presencia de variaciones en el ADN entre
una reacción de Transcripción Reversa).
los distintos individuos tiene una gran
Filmarrays relevancia en cuanto a cómo cada
Se trata de un kit comercial de PCR múltiple organismo responde a un microorganismo o
que integra la preparación de muestras, una terapia farmacológica, e incluso puede
amplificación, detección y análisis. Requiere explicar condiciones patológicas particulares.
de una mínima manipulación de la muestra y
El estudio de estas variantes genéticas nos
obtiene resultados en pocas horas.
permite plantear el concepto de “medicina
Está diseñado para ser utilizado con paneles personalizada”, la cual consiste en adecuar el
integrales (respiratorio, hemocultivos, tracto esquema terapéutico que recibe cada
gastrointestinal, meningitis) y cada uno de paciente en función de las características de
estos paneles ofrece pruebas para grupos de su genoma.
Secuenciación de nueva generación
Esta técnica permite la caracterización del
microbioma, la cual está directamente
relacionada con un conjunto amplio de
condiciones patológicas que van desde
desórdenes gastrointestinales hasta
problemas inmunológicos, obesidad y
diabetes, entre otras.