RT-PCR: PCR en tiempo real
La prueba se basa en la reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR por sus siglas en
inglés) donde un fragmento de ADN conocido es copiado y amplificado billones de veces.
El producto del PCR (punto final) es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y
proporciona evidencia cualitativa de la presencia de ese fragmento de ADN en la
muestra.
La PCR en tiempo real es una modalidad del PCR de punto final, donde la acumulación de
ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir:
“En tiempo real” esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al
ADN amplificado, donde el incremento de esta fluorescencia es la proporcional al
incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.
RT-PCR: PCR en tiempo real
La PCR cuantitativa es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizada para amplificar y cuantificar simultáneamente de forma absoluta el producto
de la amplificación (segmentos de ADN, comúnmente llamado amplicón). La medición
es por ciclo, por lo que se le denomina PCR en tiempo real. La PCR cuantitativa (qPCR)
se hace posible gracias a que el amplicón es marcado con un fluoróforo que tras ser
excitado a cierta longitud de onda es detectado por los sensores del termociclador, lo
que permite cuantificar la fluorescencia emitida.
Estrategias de cuantificación:
1. Cuantificación Absoluta: Determina el número exacto de moléculas de ADN (qPCR) ó
ARN (qRT-PCR) presentes en una muestra determinada.
2. Cuantificación Relativa: No es necesario saber la cantidad precisa de la secuencia de
interés, para poder hacer su cuantificación.
RT-PCR: PCR en tiempo real
La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR)
o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de
forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato
con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se
aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la
ADN polimerasa.
RT-PCR: PCR en tiempo real
Requerimientos de la Muestra:
[Link] requieren al menos de 30-40ug de ARN total para cada una de las condiciones a evaluar.
[Link] muestras de ARN deberán entregarse liofilizadas o en agua.
[Link] cliente deberá proveer información del cociente D.O. 260/280 y D.O. 230/260, obtenido al momento
de la cuantificación de las muestras, este, en ambos casos deberá ser ≥ 2.0.
Recomendaciones para la purificación y extracción del ARN:
Se recomienda a los usuarios que la extracción del ARN se lleve a cabo mediante Fenol ácido, y el ARN
extraído sea sometido a un paso de purificación posterior haciendo uso de columnas de sílica gel.
Cuantificación:
Se sugiere que la cuantificación sea realizada por espectrometría o fluorometría, con la idea de lograr
una medición lo más exacta posible. El cliente deberá proveer información del cociente D.O. 260/280 y
D.O. 230/260, obtenido al momento de la cuantificación de las muestras, este, en ambos casos deberá
ser ≥ 2.0.
Requerimientos para los OligoNucleótidos (iniciadores):
El grado de pureza recomendado para los mismos es HPLC, sin embargo, en la mayoría de los casos,
oligonucleótidos únicamente desalados pueden emplearse sin problema alguno. Junto con las muestras
y los oligonucleótidos, se debe entregar el formato de solicitud de servicio.
Aplicaciones tecnológicas
Usos en diagnóstico
La PCR cuantitativa se utiliza para el diagnóstico de enfermedades, tales como enfermedades infecciosas, cáncer y anormalidades genéticas. La introducción de ensayos de PCR cuantitativa
en laboratorios de microbiología ha mejorado el diagnóstico de enfermedades infecciosas y se utiliza además como herramienta para detectar nuevas enfermedades emergentes.
Usos microbiológicos
La Q-PCR es utilizada también por microbiólogos en el campo de seguridad y deterioro de los alimentos, riesgo microbiológico en la calidad del agua y en la protección de la salud pública.
Usos en investigación
En el campo de la investigación, la PCR cuantitativa se utiliza mayormente para mediciones cuantitativas de la transcripción y expresión génica, determinando como cambia la expresión de un
gen concreto a lo largo del tiempo o en determinadas condiciones como la administración de un fármaco, y analizando la respuesta de las células de un tejido al mismo, además del progreso
de la diferenciación celular o respuestas frente a cambios en las condiciones ambientales. También se utiliza para determinar la cigosidad de animales transgénicos utilizados en investigación,
es decir, determinar la homocigosis o heterocigosis de un individuo para un determinado gen.
Detección de fitopatógenos
La producción de propágulos vegetales o plántulas libres de patógenos es una constante en la industria agronómica por cuestiones económicas y sanitarias. Para el caso de Phytophthora
ramorum, un hongo que causa muerte súbita en robles y otras especies, se han desarrollado sistemas basados en sondas Taqman capaces de detectar una cantidad de 10 a 100 fg mezclados
en el ADN de la planta hospedadora. La discriminación entre el ADN del patógeno y de la planta se hace amplificando secuencias espaciadoras transcritas internas (ITS), unos espaciadores
situados en la zona codificante de los genes de ARN ribosomal característicos para cada taxón.29 Existen variantes con sondas Scorpion, Molecular Beacon y LAMP para el mismo patógeno
que, además, pueden ser aplicadas en campo.30
Detección de OGM
La Q-PCR (precedida de retrotranscripción) se emplea en la detección de OGM debido a la alta sensibilidad y rango dinámico de detección de ADN; sus alternativas, como son el análisis del
ADN o de las proteínas, suelen mostrar menos sensibilidad. Para ello se emplean cebadores específicos que amplifiquen no ya el propio transgén, sino su promotor, terminador e incluso sus
secuencias intermedias, empleadas durante el proceso de ingeniería del vector. Además, puesto que el proceso de creación de una planta transgénica suele conducir a la inserción de más de
una copia del transgén, debe evaluarse su cantidad; para ello se efectúa una cuantificación relativa empleando como gen control uno propio de la especie tratada, que se encuentre en copia
única.3132
Cuantificación y genotipado en clínica
Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patógenos concretos o a coinfecciones, y este hecho no solo puede dificultar el diagnóstico mediante las técnicas
clásicas, sino que puede redundar en un pronóstico diferente y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la Q-PCR posibilita tanto la cuantificación como el
genotipado (caracterización de la cepa, que se hace mediante curvas de melting) de virus como el HBV (virus de la hepatitis B).33 El grado de infección, cuantificado como las copias de
genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos. Por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple de tipo 1 se reactive está relacionada con el
número de neuronas infectadas en los ganglios.34 Esta cuantificación se realiza con retrotranscripción o sin ella, en el caso de que los virus se integren en el genoma humano en algún
momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano), alguna de cuyas variantes está asociada con la aparición de cáncer de cérvix.35
RT-PCR: PCR en tiempo real
