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Cromatografía Líquida en Columna a Presión Media.
Ana Sofía Guatibonza Buitrago†, Luisa Valentina Palomares Yate†.
†
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
RESUMEN: Se llevó a cabo un estudio enfocado en la separación de 4-hidroxicumarina y timol de una muestra
problema mediante cromatografía líquida en columna a presión media, usando sílice como fase estacionaria y un
gradiente de diclorometano a acetato de etilo como fase móvil. El proceso se siguió mediante cromatografía en
capa fina, evidenciando la rápida elución del compuesto apolar, timol, y la recuperación de la 4-hidroxicumarina
en las últimas fracciones debido a su mayor polaridad. Esta diferencia se explica a partir de sus estructuras,
polaridad y así, capacidad de interacción con la fase estacionaria. Las fracciones recogidas de cada analito se
concentraron a vacío, determinado masas de 358.4 mg para el timol y de 52.2 mg para la 4-hidroxicumarina.
Aunque estos resultados sugieren una mayor proporción de timol en la muestra, se señaló la posible
sobreestimación de este analito ya que no se concentró hasta obtener un sólido. Los resultados obtenidos
evidenciaron la efectividad de la elución en gradiente, así como la importancia de la polaridad en la
cromatografía.
PALABRAS CLAVE: cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, polaridad, separación de compuestos
orgánicos
1. INTRODUCCIÓN cromatográficos: la cromatografía en capa fina
La cromatografía es una técnica de separación de (TLC) y la cromatografía en columna (CC). En
mezclas basada en su velocidad de particular, la CC se caracteriza porque la fase
desplazamiento, la cual depende de su afinidad por estacionaria se encuentra al interior de un tubo de
una fase estacionaria y una fase móvil. Esta vidrio, formando una capa compacta que se
técnica fue desarrollada por el botánico Mikhail impregna con la fase móvil, este método es
Tsvett en 1903, el cual separó varios pigmentos altamente eficiente para la separación y
coloreados de plantas haciendo uso de más de cien purificación de compuestos orgánicos en escalas
adsorbentes. (skoog y leary) Y actualmente, preparativas.2
resulta esencial para la industria, ya que permite la Para el presente estudio se realizó una
separación, identificación y determinación de los cromatografía en columna con el fin de separar y
componentes químicos en mezclas complejas.1 cuantificar 4-hidroxicumarina y timol de una
Como se mencionó anteriormente, la separación se muestra problema. Esto, considerando las
hace con una fase estacionaria y una fase móvil. interacciones entre los analitos de interés y la fase
En particular, la fase estacionaria (adsorbente) móvil utilizada.
usualmente es un sólido poroso y polar que retiene
los compuestos afines a ella. Mientras que la fase 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
móvil (eluyente) interactúa con los analitos, Se separó una mezcla problema conteniendo timol
causando que se desorban de la fase estacionaria y y 4-hidroxicumarina mediante cromatografía
se muevan a través de la columna (elución). De líquida en columna sobre sílice (fase estacionaria)
este modo, los diferentes analitos en la muestra se y con una fase móvil en gradiente de polaridad,
mueven a diferentes velocidades según sus comenzando con DCM y terminando con acetato
propiedades físicas y químicas, como su polaridad, de etilo (AcEt). Se recolectaron 20 fracciones de
solubilidad o capacidad de adsorción. Esto ~5 mL cada una. Las primeras (2-4) conteniendo
finalmente permite la separación de cada analito el analito más apolar (timol), afín a la fase móvil,
dada su fuerza de adsorción sobre la fase y las últimas (16-18) conteniendo el analito más
estacionaria.1,2 polar (4-hidroxicumarina), afín a la fase
estacionaria. La separación se siguió mediante
cromatografía de capa fina (TLC), usando la
Según la disposición de la fase estacionaria, se misma fase móvil que en la columna (Fig. A1). De
pueden evidenciar dos tipos de métodos este modo, se pudo confirmar la extracción de
2
cada analito y en ese caso, a cuál correspondía.
Como era esperado, el timol se extrajo primero
dada su baja polaridad, este contiene un único
grupo fenólico unido a un esqueleto
monoterpenoide apolar (Fig. 1), haciendo que este
grupo hidroxilo pierda un poco la acidez que
tendría en un alcohol convencional. Su polaridad
general es potencialmente nula por la presencia de Fig.2. Estructura 4-hidroxicumarina
los grupos isopropilo y metilo, los cuales son
El gradiente de polaridad empleado (DCM:acetato
grupos alquilo voluminosos que predominan en la
de etilo) permitió que la 4-hidroxicumarina
molécula y, por ende, en sus propiedades,
migrara de manera eficiente. Esto se puede
haciendo que la polaridad del timol sea
explicar teniendo en cuenta las afinidades que
sumamente baja. Por lo tanto, el timol es poco afín
anteriormente se mencionaron. Con la TLC, fue
con la fase estacionaria, considerando que la sílice
posible evidenciar en qué fracción el timol ya
es muy polar gracias a sus grupos silanol. 3 Si bien
había sido separado, por lo que se procedió a
puede interactuar un poco con el grupo hidroxilo,
aumentar la polaridad progresivamente para sacar
la interacción será más favorable con el DCM ya
con mayor facilidad el analito que quedaba, la 4-
que este es un solvente considerablemente poco
hidroxicumarina. La proporción de cada solvente
polar con un momento dipolar de 1.16D y una
se cambió en el siguiente orden: DCM-AcEt 1:0,
constante dieléctrica de 8.93, haciendo posible la
5:2, 1:1 y 0:1. En este sentido, es esencial resaltar
migración de este analito.4,5
el papel de este nuevo solvente. El AcEt posee un
momento dipolar de 1.78D, pero una constante
dieléctrica de 35.94; bastante grande a
comparación con la del DCM, loque significa que
tiene una separación de carga más fuerte, y así una
fuerza eluyente mucho mayor respecto a la del
DCM. 7
Con esto en mente, las fracciones recogidas con
presencia de cada analito se concentraron con un
rotaevaporador. Luego, se determinaron las masas
de analito extraídas, obteniendo así: mHidroxicumarina =
Fig.1. Estructura Timol. 52.2 mg y mtimol = 358.4 mg. Con estas masas, se
puede sugerir que el timol estaba en mayor
Por otro lado, la 4-hidroxicumarina (Fig. 2) tiene proporción en la muestra problema. Sin embargo,
un carbonilo y un OH fenólico en su estructura, lo se debe considerar que la primera fracción de
que aumenta su afinidad a la fase estacionaria timol concentrada no se rotó hasta obtener un
polar de sílice, debido a su capacidad de formar sólido, como para la hidroxicumarina, por lo que
enlaces de hidrógeno fuertes con los grupos Si-OH puede haber un sesgo en la masa determinada para
en la superficie de la sílice. Por lo tanto, este el analito apolar. Se recomienda usar técnicas de
analito estuvo más retenido por la fase estacionaria caracterización como IR o RMN para confirmar la
y no interactuó mucho con la primera fase móvil extracción de los analitos puros. Igualmente,
usada (DCM).4,6 usando TLC, se puede confirmar la extracción de
estos analitos puros comparando el Rf de lo
extraído y del analito puro.8
3. CONCLUSIONES
Se llevó a cabo un estudio enfocado en la
separación de timol y 4-hidroxicumarina de una
3
muestra problema mediante cromatografía líquida https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.5c00430.
en columna. De este modo, se demostró la (6) Cafeo, G.; Irrera, E.; Russo, M.; Dugo, P.
efectividad de esta técnica para separar y Extraction and Chromatographic Approaches for
cuantificar los analitos de interés. Esta separación Coumarin, Furocoumarin, and
Polymethoxyflavone Characterization in Foods.
se explicó a partir de las diferencias estructurales y
Foods 2024, 13 (16), 2517.
así de polaridad entre ambos compuestos, siendo https://doi.org/10.3390/foods13162517.
el timol una molécula apolar y la 4- (7) Paul, R. C.; Singh, D.; Malhotra, K. C. Ethyl
hidroxicumarina una molécula polar, lo que Acetate as a Polar Solvent, II Formation of Acids
determinó su afinidad a la fase estacionaria y a la and Bases Due to Solvation of Proton in
fase móvil. El uso de un gradiente de elución Ethylacetate. Z. Für Anorg. Allg. Chem. 1963,
permitió optimizar la migración del compuesto 321 (1–2), 70–80.
polar, que permaneció más retenido en la sílice por https://doi.org/10.1002/zaac.19633210107.
(8) Chophi, R.; Sharma, S.; Sharma, S.; Singh, R.
su interacción mediante enlaces de hidrógeno. Los
Trends in the Forensic Analysis of Cosmetic
resultados experimentales sugirieron que el timol Evidence. Forensic Chem. 2019, 14, 100165.
estaría en mayor proporción en la muestra https://doi.org/10.1016/j.forc.2019.100165.
problema (mHidroxicumarina = 52.2 mg y mtimol = 358.4 (9) Heldin, E. CHIRAL SEPARATIONS | Ion-Pair
mg), aunque se deben considerar posibles sesgos Chromatography. In Encyclopedia of Separation
en la determinación de la masa de este compuesto, Science; Elsevier, 2000; pp 2358–2369.
pues no se concentró hasta un sólido como la 4- https://doi.org/10.1016/B0-12-226770-2/03151-
3.
hidroxicumarina. Finalmente, se recomienda
(10) Robards, K.; Ryan, D. High Performance Liquid
emplear técnicas de caracterización como IR, Chromatography: Instrumentation and
RMN para confirmar la pureza de los analitos Techniques. In Principles and Practice of
extraídos. Modern Chromatographic Methods; Elsevier,
2022; pp 247–282. https://doi.org/10.1016/B978-
4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 0-12-822096-2.00009-8.
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https://doi.org/10.1021/cr3003054. 00009-z.
(4) Malik, A.; Kashyap, H. K. Origin of Structural
and Dynamic Heterogeneity in Thymol and 5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Coumarin-Based Hydrophobic Deep Eutectic
Solvents as Revealed by Molecular Dynamics. 5.1 Cromatografía en columna
Phys. Chem. Chem. Phys. 2023, 25 (29), 19693– En primer lugar, se dispuso del montaje experimental,
19705. https://doi.org/10.1039/D3CP01770B. sujetando la columna verticalmente a un soporte con
(5) Wright, S. W.; Welder, C. O. Elimination of dos pinzas. Luego, se introdujo un pequeño copo de
Dichloromethane from the Introductory Organic algodón en el extremo inferior, y con un Erlenmeyer
Chemistry Teaching Laboratory. J. Chem. Educ. debajo de la columna y un embudo en la parte
2025, 102 (7), 2845–2851.
4
superior, se agregó un poco de arena, sílice hasta la
mitad de la columna y nuevamente arena (~5 mm).
Una vez listo el montaje, se agregó diclorometano
como fase móvil y con la bomba de mano se
introdujo a presión al sistema. Este proceso se realizó
hasta que la columna fuese traslúcida y no se
observaran burbujas ni grietas. Posteriormente, se
sembró la muestra problema (se disolvió la mitad de
la masa entregada en ~2 mL de DCM) con una pipeta
Pasteur. Después, se agregó DCM hasta antes de
llegar al esmeril de la columna y se ejerció presión
con la bomba de mano. Así, se empezó a recoger el
volumen separado en tubos de ensayo. Se tomaron en
total 20 tubos de muestra, a los cuales se les tomó
TLC para saber en cuáles se encontraba cada uno de
los analitos de interés. Cuando se dejó de ver el punto
del analito más afín a la fase móvil, esta se empezó a
polarizar con acetato de etilo. Primero DCM-acetato
de etilo 5:2, luego 1:1 y finalmente con solo acetato
de etilo. La separación se realizó hasta que
desapareciera el punto correspondiente al segundo
analito más polar en la TLC. Finalmente, se juntaron
las fracciones con cada analito en balones diferentes y
se concentraron con ayuda a de un rotavaporador.
5
durante la corrida cromatográfica. Esta puede ser
más efectiva cuando se están manejando analitos
5. ANEXOS con tiempos de retención muy diferentes, ya que
disminuye el tiempo de elución del soluto más
afín a la fase estacionaria.10
d. ¿Por qué en algunos casos es necesario basificar
una fase estacionaria? ¿Qué reactivo se utiliza?
Describa el proceso
En la superficie de la sílice, fase estacionaria
común en la cromatografía de fase normal, se
encuentran grupos silanol (Si-OH). Estos pueden
interactuar fuertemente con analitos mediante
Fig. A1. Placas cromatográficas corridas durante la fuerzas intermoleculares como puentes de
primera parte de la práctica. hidrógeno, lo que aumenta su tiempo de
retención y disminuye la reproducibilidad de la
Solución preguntar guía de laboratorio: elución. Al basificar la fase estacionaria, con una
a. Al cambiar un eluyente menos polar por otro más base como la trietilamina, se pueden deprotonar
polar ¿cómo se afecta la velocidad de elución de los grupos silanol en grupos siloxano (Si-O-Si),
un alcohol? ¿y la de una cetona? lo que disminuye la retención del analito.11
En una cromatografía en fase normal (fase e. ¿Qué es una resina de intercambio aniónica y una
estacionaria polar), los alcoholes interactúan catiónica?
fuertemente con la fase estacionaria mediante En la cromatografía iónica, usada para la
puentes de hidrógeno. Por lo que, con un separación de iones, se usa una resina de
eluyente poco polar, estos compuestos quedan intercambió iónico como fase estacionaria. Para
retenidos y eluyen lentamente.3 A medida que se el análisis de aniones se usan grupos funcionales
aumenta la polaridad de la fase móvil, disminuye de cationes de amonio cuaternario; y para el
la retención del alcohol y eluye a mayor análisis de cationes se usan aniones de
velocidad.9 Por otro lado, en cuanto a la cetona, sulfonatos.12
aunque también se trata de un compuesto polar, f. Indique algunas aplicaciones de la cromatografía
interactúa menos fuertemente con la fase de adsorción por columna
estacionaria, pues solo acepta puentes de
hidrógeno, mas no los dona. Por lo tanto, las La cromatografía de columna es una técnica de
cetonas se retendrán, pero en menor medida que purificación y extracción que puede ser aplicada
los alcoholes. Al polarizar la fase móvil, también para determinar composiciones isotópicas del
aumentará la velocidad de elución de la cetona, carbono.13
pero este cambio será menor que para el alcohol.
b. Explique ¿por qué y cómo se separan los
compuestos de cualquier muestra problema?
En cualquier muestral, los compuestos se separan
principalmente por su diferencia de polaridad y
fuerzas de interacción con la fase estacionaria y
fase móvil. Lo que afecta el tiempo de retención
de cada analito y así, su velocidad de flujo a
través de la columna.
c. ¿En qué consiste la elución en gradiente?
¿Considera que puede ser más efectiva?
La elución en gradiente refiere a una técnica en la
que se altera la composición de la fase móvil
6
