Microscopia - lab 1

Microbiología (2017543)

MICROSCOPIA: PREPARACIONES DE FRESCO Y

TINCIONES SIMPLES

Informe de laboratorio

Integrante: Clara Nathalia Mojica Morales ([email protected])

OBJETIVOS:

 Reconocer el microscopio como herramienta de observación y

análisis de microorganismos.
 Distinguir las partes del microscopio y los mecanismos que hacen
parte de este.
 Indagar sobre los diferentes tipos de microscopia.
 Conocer y analizar la técnica de preparación en fresco y tinciones
simples para la observación de microorganismos.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN:

El microscopio ayuda a
dar una visualización de
una muestra y conocer la
microbiota existente en
ella, se usa
mayoritariamente el
microscopio óptico para
observación en muestras ya
que se usa para aumentar el
tamaño de la imagen
aparente de los objetos,
permitiendo observar los
detalles estructurales de
los microorganismos. Con Figura 1. Imágenes de diferentes tipos de
la
microscopías ópticas en diferentes aumentos.
Tomado de:
0 0
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U
2j_PreparacionesMicrobiologicas_17194.PDF
microscopía óptica se pueden lograr aumentos de 100 a 1,000 diámetros
y, en algunos casos, hasta 2,000, según el tipo de luz que se utilice y la
forma de iluminar el objeto en estudio o preparación. Los microscopios
ópticos pueden ser de varios tipos, siendo el microscopio óptico de
campo claro, el más utilizado en microbiología porque el campo
microscópico está brillantemente iluminado y los objetos en estudio
aparecen más oscuros en el fondo, se observa la figura 1 varias
imágenes de otros tipos de microscopias comparadas con la microscopia
óptica de campo claro [1]. Para la muestra se utilizan diferentes técnicas
como en seco o hidratada que depende también del objetivo que se
utilizará y lo que se requiera; estas técnicas se usan como método de
estudio de los microorganismos, estos métodos puede ser preparaciones
en fresco o con ‘‘tinciones’’ negativas o tinciones.

Preparación en fresco: La preparación en fresco se usa para observar

muestras con microrganismo vivos, pero el inconveniente de la
observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la
preparación. Por tanto, su uso, con un
microscopio óptico de campo claro, está
bastante limitado [2,3]. Existen 2 clases,
una preparación en fresco simple que
Figura 2. Imagen de
montaje de una microscopía consiste en colocar una gota de líquido con
con preparado en gota los microorganismos sobre un portaobjetos
pendiente. Tomado de:
http://campus.usal.es/~micr y a continuación cubrirla con un
omed/Practicas_odontologia
/unidades/labv/LabMicro/Dia cubreobjetos. Y, una preparación en gota
g_directo.html
pendiente se realiza colocando una gota del
material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos
(invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado) figura 2
[2].

Preparación con tinción: Son preparaciones para observar

mayoritariamente microorganismos muertos, además, de ser preparados

0 0
 fijos y teñidos que son más útiles para la microscopía de campo claro ya
que los colorantes nos ayudan a aumentar el contraste. Los colorantes
pueden teñir células vivas, sin embargo, al ser fijados ya sea por calor
de o de forma química se encuentran muertos [2,3]. La fijación posee
algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia
real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite
la observación del movimiento de los microorganismos [2]. Las
‘‘tinciones’’ negativas o con tinta china se tiñe es el fondo sobre el que
están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teñir
(figura 3a). Las clases de tinciones son 2, las tinciones simples (figura
3b) que usan solo un colorante; y las tinciones diferenciales (figura 3c)
utilizan más de un colorante y permiten la agrupación de las bacterias
de acuerdo con su diferente afinidad tintorial; existen algunas tinciones
especiales o específicas como las tinciones fluorescentes, tinciones de
determinadas estructuras como la tinción del esporo, tinción de flagelos,
etc. [2,4].

C
B

Figura 3. Imagen de las diferentes tinciones en un preparado para microscopía. A) Tinción

negativa B) Tinción simple C) Tinción diferencial. Tomado de:
http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/unidades/labv/LabMicro/Diag_directo.html
https://raizrevoluta.wordpress.com/2018/01/31/laboratorio-tincion-simple-y-tincion-diferencial-de-
bacterias/
http://hkoraa.blogspot.com/2014/09/tincion-diferencial.html

Estos métodos nos ayudan a conocer la microbiota de algunas muestras,

por ejemplo, la que está en la cavidad bucal que poseen de forma
abundante bacterias anaerobias donde el número de bacterias en la
cavidad bucal ronda las 1011 bacterias/g de placa dental y 108–109

0 0
bacterias/ml de saliva, mientras que en las heces las cifras alcanzan las
1011–1012 bacterias/g. De hecho, la cavidad bucal contiene diferentes
microambientes en mejillas, paladar, lengua, etc. donde en cada zona
tiene diferencias de hábitat afectando a cada especie su capacidad de
colonizar y dominar, aunque siempre habrá especies comunes que
pertenecen a los géneros los géneros Gemella, Granulicatella,
Streptococcus y Veillonella [5].

CONCLUSIONES

 El microscopio es una herramienta de observación el cual tiene

varios mecanismos para mejorar la visualización de los
microorganismos, por ende, es importante conocer el manejo de
sus partes, comprender que el haz de luz sobre mi muestra y su
regulación pueden mejorar el enfoque en ella, el acercamiento o
alejamiento de la platina a los lentes de los objetivos puede
mejorar la resolución de la muestra. El microscopio es una gran
ayuda que al ser utilizado de forma adecuada nos puede brindar
los resultados deseados en un estudio microbiológico.
 Hay que reconocer que objetivos, técnicas, líquido de inmersión,
métodos de estudio, tipos de microscopia etc. se deben usar
teniendo en cuenta la finalidad del estudio y la muestra que se
desea estudiar.

ANEXO 1

Preguntas del informe

1. ¿Cómo se encuentra conformado el sistema óptico del

microscopio?
El sistema óptico se conforma por [1]:

0 0
- Fuente de luz: Emite la luz que pasa por el condensador, para
después iluminar la preparación. Se encuentra debajo del
objeto y integrado a la lámpara un diafragma, el cual se abre o
cierra para regular la intensidad de la luz; en otros únicamente
se regula el voltaje.
- Condensador: Es un gran lente que esta debajo de la platina
que enfoca el haz de luz a la muestra.
- Diafragma iris: Regula y controla el paso de luz a la preparación
a través del condensador para da nitidez a la imagen.
- Objetivos: Son las lentes que delimitan el tamaño de la imagen
que proporcionan diferentes aumentos. Por lo general estos
aumentos son:
 Objetivo de pequeño aumento o "seco débil": Útil para
observar microorganismos grandes, está marcado con un
"3" o "2/3", que significa 2/3 de pulgada o 16 mm.
También está marcado como 10X. Tiene una lente en el
extremo mucho más grande que cualquiera de los otros
objetivos
 Objetivo de gran aumento o "seco fuerte": se usa para el
examen de microorganismos vivos suspendidos en gotas
de agua u otros líquidos. Está marcado con "6" ó "1/6"
que significa 1/6 de pulgada 04 mm. También está
marcado como 45X ó 50X. La lente del extremo es de
menor tamaño que la del seco débil.
 Objetivo de inmersión en aceite: Éste es indispensable
para el examen de frotis de bacterias, teñidos. La lente
visible del extremo es mucho más corta que la de los
objetivos secos. También está marcado "1/12" (1/12 de
pulgada, 1.9 mm, 1.8 mm) y con 97X o 100X.
- Oculares: Son tubos cortos, cada uno con dos lentes que se
encuentran insertados en los tubos intercambiables. La función

0 0
 de éstos es amplificar la imagen del objeto formado por el
objetivo y permite que ésta sea percibida por el ojo. Los
oculares están marcados "5X", "10X", etc. indicando que
amplían la imagen del objetivo 5 veces, 10 veces, etc.
2. ¿En qué consiste el sistema de magnificación?
La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el
producto del aumento individual de los oculares y los lentes
objetivos. Cuando se utiliza el ocular 10X con el objetivo de
pequeño aumento (10X) da una amplificación final de 100 veces.
El de 50X dará una amplificación final de 500 veces y el de 100X
una amplificación final de 1000 veces. La mayoría de los objetivos

Figura 4. Tabla de la banda de color dependiendo de la magnificación del objetivo.

Tomado de: https://www.edmundoptics.es/knowledge-center/application-
notes/microscopy/understanding-microscopes-and-objectives/

3. ¿Qué papel juega el empleo del aceite de inmersión para

observar una preparación al microscopio?
La inmersión es una técnica para aumentar el poder de resolución
de un microscopio usando un aceite con alto índice refractivo ya
que los objetivos de mayor aumento, tienen una distancia focal
muy pequeña y además la primera lente del objetivo es de
pequeño diámetro por lo que los rayos que desde la muestra se
dirigen al objetivo atraviesan el vidrio del cubreobjeto cambiando
de fase (aire) se separan de la normal generando que algunos
rayos incluso sufran de reflexión total en la interfase vidrio-aire,
llegando al microscopio una pequeña parte de la luz que parte de

0 0
 la muestra; al usar un aceite de inmersión, el índice de refracción
es casi igual al vidrio, los rayos emergentes ya no se apartan de la
normal, sino que continúan su camino sin desviación, consiguiendo
así que una mayor cantidad de luz llegue al objetivo, mejorando
notablemente la visión por la formación de una película viscosa
entre el objetivo y el frotis [7,8]. El aceite de inmersión es un
líquido viscoso y transparente que tiene un alto índice refractivo.
Por este motivo es muy utilizado en las observaciones
microscópicas, ya que brinda la propiedad de concentrar la luz
cuando esta pasa a través del objetivo de 100X del microscopio,
aumentando su poder de resolución [8].
4. ¿En qué consiste el poder de resolución?
La resolución se define como la distancia entre dos entidades
estructurales de un objeto en la cual todavía se pueden observar
cómo estructuras separadas en la imagen amplificada. El poder de
resolución de un microscopio está sujeto a la longitud de onda de
la luz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura
numérica (AN). La AN indica la cantidad de luz que entra en un
objetivo desde un punto del campo del microscopio. A menor
longitud de onda de la luz y AN de las lentes, será mejor el poder
de resolución del microscopio. Por lo tanto, queda claro que el
poder de resolución de los microscopios ópticos se encuentra
restringido por AN que se obtenga de los sistemas de lentes y las
longitudes de onda del espectro de luz visible [1].
5. ¿Cómo se puede calcular la magnificación total de un
microscopio de luz?
La magnificación total del microscopio se puede determinar
multiplicando la magnificación del objetivo por el ocular [8]. A
continuación, se encuentra una tabla con los valores de la
magnificación total, los valores en rojo son los aumentos que no
son útiles o son un aumento vacío, esto quiere decir que la imagen

0 0
 está borrosa y con baja resolución; los valores en verde son los
aumentos útiles.

6. ¿Cuál es el fundamento de las tinciones simples y en que

se diferencian con las preparaciones en fresco?
Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han
desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características
morfológicas de los microorganismos y se fundamenta en la
afinidad que va a tener la pared bacteriana por un colorante.
Se diferencia con las preparaciones en fresco porque ayuda a
visibilizar microorganismos y estructuras dentro de ellos que no
se pueden diferenciar porque tienen una densidad óptica similar al
agua por lo que no son visibles [9].
7. ¿Cuál es el fundamento de la microscopía óptica y que
clases de microscopía pertenecen a ella?
El fundamento de la microscopia óptica es través de la refracción o
reflexión de los rayos luminosos mediante el sistema de lentes del
microscopio, se forma la imagen del objeto, que es más grande
que el objeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en
detalle. Pertenecen a ella las microscopías de [1]:
- Microscopio óptico de campo brillante o campo luminoso
- Microscopio de campo oscuro
- Microscopio de contraste de fase
- Microscopio de luz polarizada

0 0
 - Microscopio de interferencia
- Microscopio de contraste diferencial interferencial
- Microscopio de Luz Ultravioleta (UVA)
- Microscopio de Fluorescencia
- Fluorocromos
- Microscopio Confocal
8. ¿Cuál es el fundamento de la microscopía electrónica de
transmisión y de barrido?
Se fundamenta porque la amplificación de la imagen se obtiene
mediante un haz de electrones el cual sustituye a la luz, y un
campo magnético que hace las veces de lentes, lográndose
aumentos de 200,000 a 400,000 diámetros [1]. Hay dos tipos
básicos de microscopios electrónicos:
- Microscopio electrónico de transmisión (MET): Se utilizan
electrones en lugar de rayos de luz, y la función de las lentes la
realizan electro magnetos, operándose en todo momento a alto
vacío [1].
- Microscopio electrónico con barrido (MES): En la microscopia
SEM es formada mediante la focalización de una fina fuente de
electrones sobre la superficie de la muestra. La fuente de
electrones barre la muestra en una serie de líneas y redes,
construyéndose una imagen de la superficie en un monitor [10].
9. ¿Qué otro tipo de microscopía ha sido desarrollado en base
a los sistemas de luz y electrónicos?
- Microscopia de luz ultravioleta: Iluminan la muestra, como
el nombre indica, con luz ultravioleta. Este tipo de luz tiene una
longitud de onda más corta que la luz visible utilizada en los
microscopios ópticos. La ventaja principal de utilizar esta
técnica es que puede alcanzarse una resolución mejor que con
luz visible. Además, el contraste obtenido en la muestra es
distinto que en los microscopios ópticos. De este modo, con el

0 0
 microscopio de luz ultravioleta pueden observar muestras que
aparecen transparentes si son observadas con luz visible.
- Microscopio petrográfico o de luz polarizada: Esta
microscopia es en realidad un tipo de microscopio óptico al que
se la han añadido dos polarizadores. Esto significa que la onda
de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de
oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para
observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.
- Microscopia de fluorescencia: Se usan las propiedades de
fluorescencia para generar una imagen de la muestra. Este
microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia
cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada.
Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una
lámpara xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos
microscopios incorporan además filtros de luz para aislar la luz
correspondiente a la muestra [11].

BIBLIOGRAFÍA

1. Briones Castañeda María Teresa. Microbiología Aplicada: Manual de

laboratorio. Universidad Autónoma Metropolitana. Azcapotzalco.
2. Microbiología General y Bucal. Práctica 4: Diagnóstico
microbiológico directo.
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abv/LabMicro/Diag_directo.html
3. Preparaciones microbiológicas.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U2j_PreparacionesMicr
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4. Microscopio.
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0 0
5. Barroso Merinero Elvira. Tesis: Interacciones de los polifenoles del
vino con la microbiota de la cavidad bucal humana. Universidad
Autónoma de Madrid. Facultad de Biología.
6. Entendiendo Microscopios y Objetivos. Edmund Optics.
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2002.
8. IVD. Microscopía Aceite de inmersión. Disponible en:
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10. Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia
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Cendejas. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
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