CARRERA DE MEDICINA
Laboratorio de Biología Molecular
Arianna Alvarez, Melany Caisalitin, Mishell Vizuete
2 semestre
Paralelo ¨B¨
Grupo de trabajo: E
11/07/2025
1. OBJETIVO
El propósito de estas tres prácticas fue aprender a trabajar con el ADN humano desde su extracción
hasta su análisis final. Para eso, primero obtuvimos el ADN genómico a partir de una muestra de
sangre, luego lo amplificamos usando la técnica PCR para multiplicar una región específica del gen de
la β-globina, y finalmente observamos los resultados mediante un gel de agarosa en una electroforesis,
que nos permitió visualizar el ADN y comprobar si todo el proceso estaba bien realizado
2. RESULTADOS
CARRIL MUESTRA CARGADA RESULTADO OBSERVADO EXPLICACIÓN
1 TrackIT 1kb Ladder Banda múltiple de Sirve como escala para comparar el
referencia tamaño de los fragmentos presentes
en otras muestras.
2 ADN genómico (10 Banda grande y que se El ADN genómico es de gran tamaño
µL + buffer) encuentra bien marcada y migra lentamente; su presencia
por la presencia de confirma una buena extracción.
grandes cantidades de
ADN en la parte superior
(15,000 bp)
3 Producto PCR con Banda nítida en región Confirma una amplificación
primers conocidos esperada (262 pb) específica. El tamaño del fragmento
(KM29 y KM38) (10 concuerda con lo esperado.
µL + buffer)
4 Producto PCR con Banda única no tan Dependiendo del grupo, se observó
primers marcado pero que se amplificación no específica o
desconocidos (KM29 puede visualizar en el ausencia total; esto puede deberse a
y PC04) (10 µL + marcador de 205 pb compatibilidad o no de los primers
buffer) con el ADN molde.
5 Agua destilada (10 No se observa ninguna Control negativo. La ausencia de
µL + buffer) banda bandas confirma que no hubo
contaminación durante la
preparación de la PCR.
1
6 PCR mezclada Banda no tan marcada Confirmación adicional del producto
directamente con pero se puede visualizar de PCR con primers conocidos.
buffer (10 µL) en un aproximado de 325
pb
7 PCR con primers Banda única no tan La banda corresponde al tamaño
GH20 y GH21 (408 marcada con primers esperado para este par de primers,
pb) (10 µL) (GH20 Y GH21) (408 pb) confirmando una amplificación
exitosa.
8 TrackIT 100 bp Bandas claras entre 100 y Permite estimar con precisión el
Ladder 2000 bp tamaño de productos más pequeños.
Durante el desarrollo de las tres prácticas de laboratorio no se evidenciaron inconvenientes
significativos que afectaran la obtención o interpretación de los resultados. Uno de los puntos más
importantes fue la observación del ADN genómico, el cual se presentó con una banda de alta
intensidad, bien definida y completamente visible en la zona superior del gel, lo que confirma que la
extracción fue exitosa. A diferencia de muestras mal preparadas, donde el ADN puede visualizarse de
forma tenue, degradada o con aspecto opaco, en este caso la nitidez permitió verificar su buena
calidad.
Por otro lado, los productos de PCR mostraron amplificaciones compatibles con los tamaños
esperados. En particular, se corroboró que la amplificación con los primers conocidos KM29 (forward)
y KM38 (reverse) generó una banda de aproximadamente 262 pb, tal como indicaban los protocolos.
Este resultado fue especialmente relevante, ya que permitió confirmar que tanto el diseño de los
primers como las condiciones de reacción fueron adecuadas.
Finalmente, en la muestra adicional amplificada con primers desconocidos, se detectó una banda
cercana a los 205 pb, correspondiente a la combinación KM29 (forward) y PC04 (reverse). Aunque esta
amplificación fue menos intensa, también fue específica y se ubicó dentro del rango esperado, lo que
sugiere que los primers utilizados sí lograron reconocer una secuencia blanco en el ADN molde.
CONCLUSION
Las tres prácticas realizadas nos permitieron confirmar que el ADN puede ser extraído, amplificado y
visualizado correctamente si se siguen bien todos los pasos, pero en general el proceso fue exitoso y
comprendimos la utilidad de estas técnicas en diagnóstico molecular
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3. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS
Preguntas de la guía 1:
1. ¿Cuál es el objetivo de la extracción de DNA?
Lo que se busca es sacar el ADN que está dentro de las células para poder trabajarlo en otras pruebas,
como por ejemplo la PCR. Es el primer paso para poder estudiar un gen en específico.
2. ¿Cómo se ha realizado la lisis celular?
La lisis la hicimos usando una mezcla con detergentes y enzimas que rompen las membranas de la
célula y del núcleo quedando sí el ADN libre para poderlo extraer.
3. ¿Qué función cumple la proteinasa K?
Esta enzima ayuda a romper y eliminar las proteínas que están unidas al ADN, permitiendo que el
material genético quede más limpio y sea más fácil de purificarlo
4. ¿Qué función cumple la RNasa A?
Sirve para destruir el ARN que pueda estar mezclado con el ADN, para que en la muestra solo quede
ADN puro y sin contaminación
5. ¿Qué tipo de purificación se ha realizado?
Hicimos una purificación con columnas. Este método permite que el ADN se quede atrapado en la
columna mientras se eliminan otras sustancias que no nos sirven.
6. ¿Dónde y cómo se une el DNA durante la purificación?
El ADN se pega a la membrana de la columna cuando se mezcla con etanol. Estas condiciones hacen
que el ADN se adhiera a la columna.
7. ¿Cuál es el objetivo de añadir EtOH en la muestra antes de colocarla en la columna?
El etanol cambia el ambiente de la solución y permite que el ADN se una bien a la membrana de la
columna. Sin el etanol, el ADN no se pegaría.
8. ¿Por qué es esencial realizar los pasos de lavado de la membrana?
Los lavados se hacen para quitar cualquier cosa que no sea ADN, como proteínas, sales o restos
celulares. Si no se lava bien, la muestra puede estar sucia o dar errores después.
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9. ¿Cómo se consigue obtener el DNA durante la elución?
Para recuperar el ADN, le echamos agua a la columna y luego se centrifuga. Con esto el ADN se
desprende de la membrana y cae al tubo limpio que vamos a usar.
10. ¿Qué factores pueden alterar la concentración y pureza del DNA extraído?
Puede influir la calidad de la muestra, si mezclamos mal los reactivos, si no lavamos bien la columna o
si usamos soluciones contaminadas.
Preguntas de la guía 2:
1. ¿Cuál es el objetivo de amplificar este gen?
El objetivo de amplificar este gen fue visualizar que coincidiera con los resultados esperados de 262
pb.
2. ¿Cuáles son los componentes completos de la reacción de PCR?
• DNA genómico previamente extraído
• GoTaq®Green Master Mix, 2X (Promega)
• Primers específicos para el gen humano de la β-globina(β-globin (human) Primer set, Takara
Code No. 3868)
• Agua estéril libre de nucleasas Tubos de 0.2 mL Juego de micropipetas y puntas (10 µL, 100
µL)
• Termociclador
3. ¿Qué esquema se utilizó para la amplificación?
Desnaturalización inicial: 94ºC por 4 min
30 ciclos, cada ciclo compuesto por:
• Desnaturalización: 94ºC por 60 segundo.
• Alineamiento: 55ºC por 90 segundos
• Extensión: 72ºC por 60 segundos
• Extensión final: 72ºC por 5 min
4. ¿Por qué el paso de hibridación es importante para determinar la especificidad de la reacción?
La hibridación asegura que los primers se unan solo a la región específica del ADN molde. Si la
temperatura de hibridación es adecuada, se minimiza la unión inespecífica de los primers y se favorece
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la amplificación del fragmento deseado. Si es demasiado baja, puede producirse amplificación de
regiones no deseadas.
5. ¿Cuáles fueron los primers empleados y su secuencia?
Los primers utilizados fueron:
• KM29 (forward): 5′-ATGGGATGGAAAGGGTCTGAA-3′
• KM38 (reverse): 5′-GCTGTCCACAAGGTTGTGGG-3′
• Estos primers están diseñados para amplificar un fragmento específico de 262 pb del ADN
genómico.[2]
6. ¿Cuál es el tamaño del fragmento amplificado que se espera obtener?
Se espera obtener un fragmento de 262 pares de bases (pb), correspondiente a la región delimitada
por los primers KM29 y KM38.
7. ¿Cómo podemos comprobar si la PCR ha funcionado?
Se verifica mediante electroforesis en gel de agarosa. Si la PCR fue exitosa, se observará una banda
nítida a la altura correspondiente al tamaño esperado del fragmento (en este caso, 262 pb),
comparándolo con un marcador molecular.
8. ¿Qué puede generar una ausencia de amplificado?
Se puede dar por diversas razones como:
Errores relacionados con tiempos y temperaturas del ciclado
• Pocos ciclos: Menos de 20 ciclos puede generar amplificación insuficiente. Se recomienda
entre 20 y 35 ciclos.
• Extensión insuficiente: Un tiempo menor a 1 min/kb impide replicación completa.
• Hibridación muy breve: Menos de 30 s no permite buena unión de primers.
• Temperatura de hibridación alta: Si supera la Tm adecuada, los primers no se unen. Debe ser
\~5 °C menos que la Tm del primer.
• Desnaturalización deficiente: Si es <95 °C o muy corta (<30 s), el ADN no se separa bien.
• Desnaturalización excesiva: Tiempo prolongado puede degradar el ADN. Ideal: 3 min al inicio
y 30 s en cada ciclo.
Problemas con los componentes de la reacción:
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• Concentración inadecuada de dNTPs: Muy alta reduce Mg²⁺; muy baja impide la síntesis. Ideal:
200 μM de cada uno.
• ADN rico en GC: (>65%) dificulta la amplificación. Usar DMSO y optimizar hibridación.
• Plantilla dañada o contaminada: Impide amplificación. Usar una nueva o diluirla.
• Primers con impurezas: Pueden inhibir la PCR. Usar cebadores purificados.
• Poca plantilla: Requiere más ciclos o más ADN.
• dNTPs impuros: Contaminantes pueden inhibir la reacción. Usar reactivos certificados.
• Primers mal diseñados: Mal complemento, dímeros o secuencias no específicas. Usar
programas especializados y verificar con BLAST.
• Concentración incorrecta de primers: Muy alta = unión inespecífica; muy baja = poca
eficiencia. Ideal: 0,2–1 µM.
• Enzima insuficiente o inactiva: Afecta la replicación. Verificar cantidad y lote.
• Objetivo demasiado largo: Requiere optimización del protocolo y mayor tiempo de extensión.
• Agua contaminada: Usar agua libre de nucleasas y recién pipeteada.
• Mg²⁺ insuficiente u omitido: Afecta la actividad de la polimerasa. Ideal: 1,5 mM.
Componentes omitidos:
• Ausencia de dNTPs, primers, plantilla, Mg²⁺ o polimerasa: lleva a fallo total de la reacción.
Siempre verificar checklist de mezcla antes de iniciar. [3]
9. ¿Qué ocurre si en el control negativo obtenemos amplificado?
Indica contaminación cruzada o error de manipulación, ya que el control negativo (normalmente agua
o tampón sin ADN) no debería contener ninguna plantilla. La presencia de banda invalida los resultados
y obliga a repetir la prueba.
10. ¿Qué habría que modificar si queremos realizar una qPCR?
Para realizar una PCR en tiempo real (qPCR) se deben realizar los siguientes cambios:
• Uso de una ADN polimerasa compatible con qPCR (como Taq polimerasa con actividad 5′–3′
exonucleasa).
• Incorporación de un marcador fluorescente, como SYBR Green o sondas TaqMan, para
detectar la amplificación en tiempo real.
• Uso de un termociclador con detector óptico, que mida la fluorescencia en cada ciclo.
• Optimización de primers para evitar dímeros o estructuras secundarias que interfieran en la
cuantificación.
Preguntas de la guía 3:
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1. ¿Cuál es el objetivo de realizar la electroforesis?
El objetivo es separar y visualizar fragmentos de DNA según su tamaño, utilizando un gel de agarosa
como matriz de tamizaje y un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas. Esto permite
analizar muestras de DNA, verificar la amplificación por PCR o identificar fragmentos específicos.
2. ¿Por qué en las muestras de PCR no se colocó el buffer de carga?
Porque ya contenían buffer de carga incorporado en el mix de PCR.
3. ¿Por qué se utiliza un buffer para correr el gel y no agua?
El buffer (como TBE 1X) mantiene un pH estable y conduce la corriente eléctrica eficientemente. El
agua no tiene la capacidad de tamponar cambios de pH ni transportar iones de manera eficaz, lo que
comprometería la migración y la integridad del DNA.
4. ¿De qué a qué electrodo se mueven los fragmentos de DNA y por qué?
El DNA, que tiene carga negativa por sus grupos fosfato, se mueve desde el electrodo negativo (ánodo)
hacia el positivo (cátodo), ya que es atraído.
5. ¿Cómo afecta el tamaño de los fragmentos de DNA a su movimiento por el gel?
En la velocidad, ya que los fragmentos pequeños migran más rápidamente y recorren mayor distancia,
mientras que los fragmentos grandes avanzan más lentamente por los poros del gel de agarosa.
6. ¿Cómo estimamos el tamaño de los fragmentos obtenidos?
Se compara la posición de las bandas con un marcador de peso molecular (DNA Ladder), que contiene
fragmentos de tamaño conocido. Al comparar la distancia migrada, se puede estimar el tamaño en
pares de bases de cada fragmento.
7. ¿Por qué unas bandas son más anchas que otras?
Las bandas más anchas indican que hay mayor cantidad de DNA en ese fragmento.
8. ¿Por qué y cómo se utiliza luz Ultravioleta para visualizar el DNA?
Se usa un colorante fluorescente como SYBR Safe, que se intercala entre las bases del DNA. Este emite
fluorescencia cuando se expone a luz UV, permitiendo visualizar las bandas de DNA en el gel con un
transiluminador.
9. ¿Qué ha podido ocurrir si vemos más de una banda en nuestra muestra de PCR?
Puede deberse a:
• Amplificación inespecífica (varios fragmentos).
• Contaminación de la muestra.
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• Uso de primers no específicos que se unen a múltiples sitios del DNA molde.
10. ¿Por qué motivos puede que no se evidencien bandas de DNA amplificado (PCR) en el gel?
Algunas razones pueden ser:
• Fallo en la amplificación (problemas con primers, enzimas o condiciones de PCR).
• Degradación del DNA.
• Errores en la carga de la muestra.
• Concentración de DNA muy baja.
• No inclusión del colorante o problemas con el transiluminador.
4. BIBLIOGRAFÍA
1. Salazar Montes AM, Sandoval Rodríguez AS, Armendáriz Borunda J.
Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. 1ª ed. México:
McGraw-Hill Interamericana Editores; 2013. ISBN: 978-607-15-0912-3.
2. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al.
Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebadores con una ADN
polimerasa termoestable. Science [Internet]. 1988;239(4839):487–91.
Disponible en: http://science.sciencemag.org/content/239/4839/487
3. Bio-Rad Laboratories, Inc. Solución de problemas de PCR [Internet]. Bio-
rad.com. [citado el 11 de julio de 2025]. Disponible en:https://www.bio-
rad.com/es-ec/applications-technologies/pcr-
troubleshooting?ID=LUSO3HC4S
