Guía 9.

Identificación molecular (parte III): Reacción en cadena de la polimerasa

Docente: Leidy Yanira Rache, Hansen Murcia. Biología molecular.

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Introducción

La “Reacción en Cadena de la Polimerasa” o PCR por sus siglas en inglés, es una técnica que se
fundamenta en sintetizar muchas veces un fragmento o región de ADN utilizando una polimerasa que
puede trabajar a temperaturas elevadas, como la Taq polimerasa, que proviene del microorganismo
Thermus aquaticus el cual vive en ambientes que se encuentran a altas temperaturas (79ºC a 85ºC).
Cuando se realiza una PCR se simula lo que sucede en una célula cuando se replica el ADN y en el tubo
se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que
queremos estudiar y donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los oligonucleótidos
(llamados también primers, iniciadores, cebadores u oligos) necesarios para que se inicie el proceso,
deoxinucleótidos (dNTPs) y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente, como el pH,
concentración de MgCl2 , KCl, tiempo y temperatura. En algunos casos se pueden necesitar otras sales
o reactivos, dependiendo del tipo de polimerasa utilizada.

Una vez están listos los tubos con lo necesario para que la amplificación del fragmento que nos interesa
se realice, se colocan en el termociclador, el cual calienta o enfría los tubos a temperaturas muy precisas.
Amplificación hace referencia a sacar múltiples copias de una región definida en el ADN de interés.
Para amplificar nuestro fragmento de un tamaño determinado, ocurre lo siguiente: el termociclador
calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez, lo que se llama los
ciclos de reacción. La primera temperatura es a 95ºC, donde ocurre la desnaturalización de ADN
(temperatura de denaturación) durante la cual la doble cadena del ADN se separa o desnaturaliza,
quedando en forma de cadenas sencillas. Luego el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo
entre 40º y 60ºC, temperatura que se conoce como de anillamiento. A esta temperatura se forman y se
rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos y el ADN, pero aquellas
uniones más estables (las que son complementarias) durarán mayor tiempo, quedando los
oligonucleótidos “anillados” formando una pequeña región de doble cadena. Después la temperatura
sube a 72ºC (paso que se conoce como temperatura de extensión), ya que 72ºC es la temperatura en la
cual la polimerasa alcanza su máxima actividad (temperatura óptima) y continúa la síntesis de los
fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se habían alineado. La polimerasa se une
entonces a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ – 3. Al
agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión
y el oligonucleótido permanece en este sitio.

En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán los primeros fragmentos a partir del ADN
genómico (ADNg). Estos primeros fragmentos no tendrán el tamaño esperado, serán un poco más
grandes ya que la Taq polimerasa copiará hasta donde le sea posible (figura 1). Después se repiten una
vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los oligonucleótidos, además de unirse al ADN
que pusimos al inicio, también se unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo. Por lo
tanto, en este segundo paso la polimerasa sintetizará 2 fragmentos largos copiados directamente del
ADN y 2 fragmentos del tamaño esperado, que es el tamaño que hay entre los dos oligonucleótidos que
hemos usado (figura 2). De esta forma con cada ciclo aumentará el número de fragmentos del tamaño
que queremos. Cabe mencionar que antes y después de estos ciclos se programan dos pasos, uno de 95ºC
durante un par de minutos para iniciar con la desnaturalización y al final de los ciclos, un último paso

1
de extensión a 72ºC para permitir que la Taq polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que
pueden haber quedado incompletos (5 minutos).

Figura 1. Primer ciclo de amplificación de un segmento de ADN por PCR. Fuente: Parkes, H. 2003.
Food for Thought. http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1999/parkes_may99.htm

Figura 2. Segundo ciclo de amplificación de un segmento de ADN por PCR. Fuente: Parkes, H. 2003.
Food for Thought. H., Parkes. http://www.chemsoc.org. http://www.chemsoc.org. [En línea] 2003.
[Citado el: 9 de marzo de 2015.] http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1999/parkes-may99.htm.

Para este tipo de PCR es necesario que uno de los oligonucleótidos (cebadores o primers) tenga la misma
secuencia que se encuentra en una de las cadenas del ADN, y el otro deberá llevar la secuencia
complementaria que estará al final del fragmento que se quiere amplificar (por lo cual se les llama
forward y reverse) para que uno sea complementario a la cadena que forma el otro. Si no es así, no podría
amplificarse el sitio que se desea amplificar. Como cada pedazo sintetizado sirve como base para
sintetizar otros en el siguiente ciclo, el número de copias aumentará en forma exponencial. Con una sola
molécula de ADN, en el ciclo 1 se producen 21 =2 nuevos fragmentos, en el ciclo 2 serán 22, esto es, 4
fragmentos recién sintetizados, es decir, 2n – 2n amplicones (ADN amplificado) se van a producir,
siendo n el número de ciclos. Así, con 35 ciclos de PCR se producirán 235= 34.359.738.368 nuevos
fragmentos, de los cuales sólo 70 serán fragmentos de un tamaño mayor al esperado (2 por cada ciclo)
obtenidos al sintetizarlos directamente del ADN genómico; esta pequeña cantidad es casi imposible de
detectar al analizar nuestros productos.

Objetivos

- Entender el proceso de reacción en cadena de la polimerasa.

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Materiales

Gradillas para tubos de 200µL Termociclador

Tubos de 200µL MgCl2
Agua destilada estéril libre de DNAsas Tubos de 1.5 mL
Racks con puntas para micropipetas estériles Mix de dNTPs
Taq DNA polimerasa Go Taq Flexi Buffer
Micropipetas de cada volumen: 1000, 100 y 10µL Muestras de ADN extraídas
*Sharpie
*Guantes de nitrilo.

Promega M712B 1010225 Go Taq Green Master Mix 2X 1.25 mL

 Go Taq AND polimerasa (2X)
 Reaction buffer pH 8.5 (2X)
 400 M dATP
 400 M dGTP
 400 M dCTP
 400 M dTTP
 3 mM MgCL2

Oligo: Forward_16S_ Universal._27

 Seq: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
 GC% = 50
 MW = 6148 Da (calculated)
 Yield: OD = 5.5; nmol = 25 (0.025 mol)
 Tm = 59.3 °C
 Volume for 100 pmol/L = 100 M = 250 L

Oligo: Reverse_16S_Universal._1492
 Seq: 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’
 GC% = 38
 MW = 4822.2 Da (calculated)
 Yield: OD = 4.1; nmol = 25 (0.025 mol)
 Tm = 47.6 °C
 Volume for 100 pmol/L = 100 M = 250 L

Nota: Los materiales marcados con * deben ser llevados por los estudiantes

Procedimiento

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PCR convencional

1. En la tabla 1 se presenta un ejemplo de cómo estimar los volúmenes de los componentes de una
reacción de PCR de 50 L a partir de soluciones stock utilizando la ecuación C1V1 = C2V2. De
acuerdo con esto, determine el número de reacciones que necesita, teniendo en cuenta que debe
tener:
a. un control negativo de la reacción, que corresponde a adicionar agua en lugar de ADN en el
tubo.
b. un control positivo, que corresponde a adicionar ADN proporcionado por el docente.
c. un control negativo, que corresponde a adicionar ADN extraído de células eucariotas.
d. por último, el ADN problema extraído en la práctica de “Extracción de ADN bacteriano”.

2. Ubique en una gradilla los tubos de 200µL que va a utilizar y márquelos con un número.
3. En su cuaderno haga una tabla donde se indica a que muestra corresponde el número de cada tubo.
4. Descargue en internet el inserto de la Taq polimerasa que usará para realizar PCR. De acuerdo con
los reactivos y concentraciones que encuentra en el documento, realice los cálculos correspondientes
para preparar la mezcla maestra (master mix) según las reacciones que determinó va a realizar en el
punto 1.
5. Use uno de los tubos anteriores, adicione cada uno de los reactivos para obtener el mix de PCR. Los
cálculos se basarán en un volumen de 10 L por muestra, multiplicado por el número de muestras +1.
Se debe estimar la cantidad de buffer PCR, MgCl2, dNTPs y primers forward y reverse en la cantidad
que usted calculó. Para completar el volumen final, utilice el agua destilada estéril.
6. Para realizar la mezcla, inicie siempre por el agua destilada estéril y después de adicionar todos los
reactivos mezcle con la micropipeta 6 veces.
7. Dosifique 10µL de mix en cada uno de los tubos de 200µL, tenga cuidado de no dejar burbujas.
8. Adicione a cada tubo de PCR, 5µL de cada una de las muestras que escribió contiene cada tubo (agua
destilada, ADN control positivo, ADN control negativo y ADN problema).
9. Mezcle cuidadosamente con la micropipeta sin formar burbujas.
10. Revise que cada tubo de 200 µL conteniendo la reacción y la muestra se encuentre bien tapado y que
no presente burbujas. En caso de que tenga burbujas, elimínelas dando golpecitos suaves al tubo contra
el mesón.
11. Coloque los tubos en el termociclador y prográmelo según las instrucciones de la Taq polimerasa a
utilizar.
12. Inicie el proceso de PCR.
13. Cuando se termine el proceso, saque los tubos, colóquelos en una gradilla y guárdelos a -20°C hasta
realizar electroforesis.

Go Taq Green Master Mix

Para el uso del Go Taq Green Master Mix 2X de Promega, tenga en cuenta la tabla 2 para la
preparación de una sola reacción de un volumen de 25 L:

Componente Volumen (L) Concentración

final
Go Taq Green Master Mix 2X 12.5 1X
Primer forward 0.25 – 2.5 0.1 – 1.0 M
Primer reverse 0.25 – 2.5 0.1 – 1.0 M
DNA molde 1–5 <250 ng
H2O libre de DNAsas hasta: 25 N.A.

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Tabla 2. Cantidad de Go Taq Green Master Mix 2X, primer forward, primer reverse y agua
para reacción de PCR de 25 L.

Resultados

1. Haga un cuadro en el que muestre los reactivos y las cantidades que adicionó para preparar el
mix de PCR del punto cinco de la metodología.

2. Construya un cuadro en el que muestre los ciclos de PCR que le colocó al termociclador para
amplificar el gen 16S ADNr usando la información que contiene el mismo inserto de la Taq
polimerasa. Estime el tiempo total que tardará le proceso de PCR con un número de 30 ciclos.

3. Realice un cuadro que contenga cada una de las reacciones que colocó en el termociclador y en
la columna del frente escriba los resultados que espera obtener si los reactivos no están
contaminados.

4. Usando la hoja entregada por la docente que contiene información de la Taq polimerasa a utilizar
en la PCR, construya un cuadro en el que muestre los reactivos con sus concentraciones iniciales
y la cantidad en microlitros que dosificará para realizar la reacción en cadena de la polimerasa.

5. Haga una tabla o esquema en el que queden claras las condiciones de temperatura, número de
ciclos y tiempo que colocará en el termociclador la próxima clase para amplificar el gen 16S
ADNr usando la información que contiene la hoja entregada por la docente y que contiene la
guía.

Referencias

1. H., Parkes. http://www.chemsoc.org. http://www.chemsoc.org. [En línea] 2003. [Citado el: 9 de

marzo de 2015.] http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/1999/parkes-may99.htm.
2. Promega. GoTaq® Master Mixes. Protocols. GoTaq® Green Master Mix (M712) Protocol. Fecha
consulta: abril 2025. URL: https://worldwide.promega.com/es-es/products/pcr/taq-
polymerase/gotaq-master-mixes/?catNum=M7122
3. Promega. Biomath Calculators. Tm for oligos. Fecha consulta: abril 2025. URL:
https://worldwide.promega.com/es-es/resources/tools/biomath/tm-calculator/
4. Owczarzy, R., Moreira, B.G., You, Y., Behlke, M.A., Walder, J.A. 2008. Predicting Stability of
DNA Duplexes in Solutions Containing Magnesium and Monovalent Cations. Biochemistry 47:
5336 – 5353. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/bi702363u.
5. Integrated DNA Technologies. The importance of melting temperature in molecular biology
applications. Fecha consulta: abril 2025. Año actualización: 2024. URL:
https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/the-importance-of-tm-in-molecular-
biology-applications