ENZIMAS
Las técnicas de biología molecular son posibles gracias a la acción catalizadora de enzimas específicos que
son aislados de todo tipo de microorganismos virus, bacterias y células eucariotas.
Estas enzimas realizan in vitro las mismas actividades que llevarían a cabo en condiciones fisiológicas. Estas
enzimas son por lo tanto muy importantes en biología molecular.
Las enzimas son proteínas complejas que producen un cambio o reacción química específica. Por
ejemplo, pueden ayudar a descomponer los alimentos que consumimos para que el cuerpo los pueda usar.
La coagulación de la sangre es otro ejemplo del trabajo de las enzimas.
NUCLEASAS:
Son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del
enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.
Clasificación de las nucleasas:
Según el tipo de ácido nucleico que atacan:
Nucleasas de ARN.
Nucleasas de ADN.
Según el tipo de cadena que atacan:
Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias.
Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias.
Según la situación del punto de corte:
Exonucleasas: Eliminan nucleótidos uno a uno desde el extremo (5’-3’,
3’-5’ o en ambas).
Endonucleasas: Cortan en puntos intermedios de la molécula
Según la especificidad del corte:
Nucleasas que cortan aleatoriamente.
Nucleasas que cortan en sitios concretos de la molécula → Endonucleasas
de restricción (gran relevancia en biología molecular).
Endonucleasas de restricción:
Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN
bicatenario (de entre 4-8 pb). Producen un corte en la doble cadena en esa secuencia
o cerca de ella, fragmentan de la molécula.
Las secuencias de ADN específicas que reconocen se las denomina: secuencias de
restricción, secuencias de reconocimiento o dianas de restricción.
Tipos:
Se extraen de bacterias que las usan de defensa como sistema inmune ante fagos
(bacteriófagos- virus que atacan bacterias), puesto que su función biológica es
degradar el ADN exógeno o ajeno
Tipo I:
- No tienen gran utilidad en biología molecular.
- Reconocen su diana de restricción, efectúan un corte. Cada vez que cortan la
misma molécula de ADN, generan fragmentos distintos. Patrón de corte
aleatorio.
- Necesitan ATP
Tipo II: las más empleadas: elevada precisión en reconocer y cortar secuencias.
- Reconocen la secuencia de restricción y cortan en puntos
específicos(normalmente dentro).
- En consecuencia, estas enzimas generan patrones específicos y
reproducibles de fragmentos.
- Sitios de corte palindrómicos, es decir, reconocen secuencias leídas de la
misma forma en ambas direcciones.
- Solo necesitan Mg²⁺
Lo hace con un patrón específico
que produce dichos extremos
para después facilitar su
complementariedad
1º Enzima de restricción reconoce secuencia y corta ADN (doble cadena) 2º Fragmentos generados
(cadena sencilla)
Tipo III:
- Reconocen una secuencia no palindrómica de 5 a 6 bases y requieren dos
sitios de reconocimiento orientados de forma inversa para la escisión.
- Una vez unida, la enzima se desliza a lo largo del ADN y, al encontrar un
segundo complejo, rompe el ácido nucleico a 25-28 bases de distancia
- Necesitan ATP
Nos centraremos en el estudio de las enzimas de Tipo II: *cuadro*
Nomenclatura:
- 3 letras cursivas (1ª género, 2ªˢ especie).
- Números romanos (orden en el que se aisló la enzima, porque puede haber
varias en la misma cepa).
- A veces 4ª letra (cepa). EcoR V E.coli, cepa RY13.
Tipo de corte:
A) Extremos romos. Ejemplo corte con EcoR V. el corte se produce en el mismo
punto en las dos cadenas.
B) Extremos cohesivos. Ejemplo corte con EcoR I. El corte se produce en distintos
puntos de ambas cadenas. Fragmentos monocatenarios muy reactivos
Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología.
Aplicaciones en biología molecular:
1) Permite crear moléculas de ADN recombinante.
a) Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de
restricción.
b) Al mezclarse los fragmentos generados (extremos cohesivos) se unirán por la
complementariedad
c) Finalmente, las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y
se obtiene una molécula híbrida recombinante.
De esta manera se puede insertar un determinado gen de un organismo (que sea
responsable de la producción de una determinada proteína) en otro diferente, con la
finalidad de producirla en grandes cantidades. Ejemplos: antibióticos, hormonas…
La primera proteína recombinante que se produjo en E.coli fue la somatostatina,
una hormona anti-crecimiento de 14 aminoácidos.
Sin embargo, aunque desde el punto de vista científico fue un éxito, desde el punto
de vista económico fue un fracaso, ya que su utilidad estaba reducida a personas con
problemas de gigantismo y similares, que son poco comunes.
Posteriormente se logró un gran éxito en este campo mediante la producción de
insulina en bacterias.
La insulina presenta la ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por
lo que se evita este problema de su producción en bacterias. Además, la diabetes es
una enfermedad muy frecuente en la sociedad, con unos 347 millones de diabéticos.
2) Patrones de restricción.
El término RFLP, que se traduce al español como "polimorfismo de longitud
de fragmentos de restricción", se refiere a una técnica utilizada en genética
molecular para identificar y analizar la variabilidad en secuencias de DNA.
Se basa en la acción de las secuencias específicas de enzimas de restricción,
las cuales reconocen nucleótidos del ADN y hacen un corte en la cadena.
Por tanto, la digestión (rotura o corte) con estas enzimas generan un número
pequeño de fragmentos de distintos tamaños.
Nos permite detectar fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
Estos fragmentos se pueden separar según su tamaño mediante la técnica de
electroforesis en gel.
Se obtiene un conjunto de bandas que es único para un ADN en particular
y que se denomina patrón de restricción. Ejemplo: detección de posibles
anomalías en el diagnóstico prenatal, genética forense y test paternidad.
Una de las aplicaciones más notables de RFLP en medicina ha sido en el campo
de la genética forense. Al comparar patrones de RFLP de muestras de DNA
de diferentes individuos, es posible determinar si provienen de la misma
persona o de una fuente genética similar.
Esto ha permitido resolver crímenes y casos no resueltos, identificando a
sospechosos o exonerando a individuos previamente acusados.
ADN POLIMERASA:
Actualmente, casi cualquier técnica de análisis de ácidos nucleicos requiere de una
fase previa de amplificación, es decir, obtener un número de moléculas idénticas
suficientemente grande para hacer cualquier estudio.
- La técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
- Las ADN polimerasas replican el ADN para poder tener cantidad suficiente.
- Las ADN polimerasas más usadas son de los tipos I y III.
Actualmente se dispone de numerosas polimerasas. ¿En qué se diferencian?
-Velocidad polimerización: número de nucleótidos
añadidos por segundo.
-Fidelidad polimerización (%errores)
-Termoestabilidad (Tª a la que se inactivan)
-Procesividad (tamaño del amplicón-ADN replicado)
-Actividad exonucleasa adicional.
Dependiendo de la técnica en la que se vayan a usar,
interesarán unos tipos u otros. En la PCR, interesa que
sean termoestables y de elevada velocidad y gran
procesividad, ya que hay 3 ciclos, el 1º a +0ºC, el 2º
+50ºC y el tercero a +70ºC.
RETROTRANSCRIPTASA O TRANSCRIPTASA INVERSA:
Son ADN polimerasas dependientes de ARN (lo necesitan como molde).
El ADN sintetizado se denomina ADN copia.
Se ha aislado en retrovirus, que tienen como material genético ARN. Este ARN
pasa a ADN en la célula infectada y se integra en el genoma del huésped. (VIH)
-Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en combinación con técnicas de
ARN recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADN copia.
-Realizar la amplificación de ARN. La PCR convencional no amplifica ARN (las ADN
pol que se emplean son ADN dependientes). Pero, si se añade un paso previo de
retrotranscripción, sí que se puede (RT- PCR):
DESOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASA TERMINAL (TDT):
Es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxirribonucleótidos al
extremo 3’ de una molécula de ADN.
A diferencia de otras ADN polimerasas: no requiere un cebador ni de una cadena
molde.
Se han aislado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfomas y
leucemias.
Una de sus principales utilidades es el diseño de sondas marcadas con nt
modificados.
Una sonda es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para
encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una muestra.
LIGASAS:
Unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster entre los
extremos 3 de una molécula y 5 de la otra.
Pueden también reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds mediante la
formación del correspondiente enlace fosfodiéster.
Son muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN
de distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción.
Existen también ligasas de ARN que permiten circularizar moléculas
monocatenarias.
TOPOISOMERASAS:
Relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a la burbuja de replicación o
transcripción. Se emplean como paso previo en algunas técnicas de BM.
