1- ¿En qué consiste un laboratorio de Biología Molecular?
El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas de biología molecular
en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido
desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de “Biología
Molecular” se aplicó a los trabajos realizados sobre el ADN. Esta molécula, descubierta por el biólogo y
médico suizo Johan Friedrich Miescher en el año 1869, capturó la atención de la comunidad científica,
luego que los investigadores James D. Watson, Francis Crick y Rosalind Franklin descubrieran la
estructura del ADN en el año 1953 (Watson y Crick, 1953). Este descubrimiento abrió un nuevo horizonte
para futuras generaciones en diferentes áreas de la ciencia, incluida la investigación biomédica.
2- ¿Cuál es la utilidad de un laboratorio de Biología Molecular?
Implementa el desarrollo de nuevas técnicas lo que da diagnóstico más rápido y precisos (eficaz)
3- Áreas que conforman un laboratorio de Biología Molecular.
Áreas de extracción, de preparación de reactivo y de amplificación
4- Requisitos que debe cumplir el personal que labora en un laboratorio de biología molecular.
El personal debe estar capacitado en las técnicas de biología molecular debe también trabajar en equipo
y conocimiento de seguridad
En el caso del COVID-19 necesitamos un área previa que es el área donde se hace la preparación e
inactivación de la muestra
Si hablamos del nivel de riesgo es el área más expuesta es por eso que en esta área ocupamos un equipo
de protección personal nivel 3 y una cabina de bioseguridad biológica, luego de este proceso cuando
inactivamos al virus pues ya los procesos se vuelven menos riesgosos
O talvez en el cuarto blanco no hay ningún tipo de riego biológico entonces tenemos el cuarto de
extracción, el de preparación de reactivos y tenemos un área que es el área de adición
Esta área es una excepción siempre y cuando contemos con un espacio podríamos tener el área de
adición, pero sino lo tenemos podemos compartir el área adición con el área de extracción y siempre y
cuando se tenga una estación de trabajo para poder realizar el procedimiento que es un procedimiento
adicional y por último el cuarto de amplificación
5- Características del área de extracción de ácidos nucleicos.
(ya sea extracción manual o autorizada) cuarto gris
El área de extracción debe tener, equipos y suministros exclusivos para manipulación de las muestras
como los son:
•Cabina de seguridad biológica clase 2
• Congelador / refrigeradora dedicado al almacenamiento de muestras
• Microcentrífuga
• Mezclador vortex
• Micropipetas de diferentes volúmenes
• Puntas deben ser con filtro para evitar aerosol
• Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y deben ser libres de ADNasa / ARNasa
• Equipo de protección personal
6- Características del área de preparación de reactivos.
• Esta debe ser el área más limpia
•Estación de trabajo o cabina de PCR con luz ultravioleta
• Freezer dedicado para el almacenamiento de los reactivos
• Micropipetas de diferentes volúmenes
• Puntas deben ser con filtro para evitar aerosol
• Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y deben ser libres de ADNasa / ARNasa
• Placas de reacción de reacción óptica
• Reactivos para la amplificación
7- Características del área de amplificación (área sucia)
• Área de termociclador (plataformas de PCR en tiempo real)
• Equipos requeridos:
- Microcentrífuga de placa
- Sistema de PCR en tiempo real (Termociclador)
- Computadora para análisis de datos
Los reactivos de la RT-PCR y de ácido nucleico extraído no deben, manipularse en esta área ya que el
riesgo de contaminación es alto
8- Medidas de Bioseguridad a cumplir en un laboratorio de Biología molecular.
Nivel 2 Tipo de laboratorio Servicios de atención primaria; diagnostico, investigación
Prácticas de laboratorio TMA (técnicas microbiológicas apropiadas) y ropa prosectora; señal de riesgo
biológico
Equipo seguridad trabajo en mesa al descubierto y CSB (cabina de seguridad biológica) para posibles
aerosoles
9- Recomendaciones para evitar contaminación de reactivos, muestras del laboratorio y áreas de
trabajo para evitar falsos positivos.
• Mantenga equipos y suministros dedicados para el montaje del ensayo y la manipulación de muestras
/ acidas nucleidos extraídos.
• Mantenga los reactivos y los tubos de reacción tapados o cubiertos tanto como sea posible.
• El área de trabajo y las pipetas deben descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10% y etanol al 70%
para minimizar el riesgo de contaminación por acido nucleido.
• El ARN debe mantenerse en bloques fríos o en hielo durante la preparación y uso para asegurar la
estabilidad.
• Deseche las muestras humanas de acuerdo con las regulaciones locales, estatales y federales.
• Es importante evitar la contaminación de reactivos, equipos de laboratorio y del área de trabajo, al
realizar experimentos, para evitar la generación de resultados falsos positivos (resultados que no son los
que deberían de hacer)
10- Aplicaciones diagnosticas de un laboratorio de Biología Molecular.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN CÁNCER
DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DEL TIPO POINT OF CARE
11- Limitaciones del diagnóstico molecular.
Una de las grandes limitaciones del diagnóstico molecular es el costo de los test utilizados. De forma
general, estos test superan los valores de los ensayos comúnmente utilizados en clínica para el mismo
propósito y en la mayoría de ellos no es posible obtener un reembolso por isapres o compañías
aseguradoras, siendo el paciente el responsable de costear estos exámenes
Delmi Lizbeth Recinos y fue del instituto nacional de la salud
Que es la RT-PCR
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática invitro que amplifica millones de
veces una secuencia especifica de ADN durante varios ciclos repetidos en lo que la secuencia blanca es
copiada fielmente.
En la reacción si usamos como sustrato ADN genómico entonces hablamos típicamente de un PCR, pero
si usamos ARNm se le conoce como RT-PCR esta conversación se logra mediante una reacción conocida
como transcripción reversa y es controlada por la enzima transcriptasa reversa capaz de convertir el
ARNm en una molécula de ADN.
Diagnóstico molecular de COVID-19
En enero de 2020 la OMS recomendó a los países realizar la detección molecular del SARS-CoV-2
mediante la metodología de RT-PCR en tiempo real: en muestras de las vías respiratorias (naso y
orofaríngea) ya que es un método que identifica genes del virus
Iniciamos con una toma de muestra nasofaríngeas necesitamos un medio de transporte viral para
mantener y el primer paso que realizamos en el laboratorio es paso previo PCR se llama lisis celular ese
proceso que rompe el virus (la pared celular del virus) y nos permite sacar el ARN viral
Cuando tenemos el ARN viral pues hacemos el proceso de retro transcripción este proceso es el cambio
ahora de ARN a ADN, luego tenemos el ADN molde es que vamos a utilizar para hacer la amplificación
exponencial los miles de copias que nosotros queremos para poder identificar al virus
Estos millones copias van hacer marcadas con florocromo especifico, los cuales van emitir señales de luz
y eso lo vamos a ver a través de curvas o señales de amplificación en un software ahí es donde nosotros
analizamos las muestras en una computadora
Características de los métodos moleculares
Los métodos de detección molecular, como la RT-PCR, producen un gran volumen de ácido nucleico
mediante la amplificación de cantidades muy pequeñas de acido nucleico que se encuentran en las
muestras
Ventaja método altamente especifico y sensible
Desventaja alto riesgo de contaminación
3 variables fundamentales para un laboratorio de biología molecular: Instalaciones, equipamiento,
personal.
Instalaciones:
Para el caso del laboratorio de biología molecular es necesario definir 3 áreas separadas y bien definidas
El primer cuarto es donde hacemos la parte de la extracción el segundo cuarto es donde esta la
preparación de reactivos y el tercer cuarto es donde hacemos la amplificación
Esta división nos va permitir cualquier tipo de contaminación en lo que es laboratorio; este tipo de
diseños de 3 áreas fundamentalmente separadas es para realizar la técnica de RTP-PCR de forma
manual, si nosotros utilizamos una plataforma semiautomatizada entonces utilizaremos solo dos cuartos
o áreas que seria el cuarto de extracción y el cuarto de amplificación
Si tuviéramos una plataforma automatizada totalmente que es un equipo completamente cerrado
entonces, si utilizaríamos un cuarto, esto también va a depender del tipo de plataforma que estaríamos
trabajando, pero la que va estar ahora es la más básica
Otro aspecto es el flujo de aire controlado esto es de acuerdo al proceso que estamos realizando en cada
área
Por ejemplo, en el área de preparación de reactivos necesitamos una presión positiva porque ahí es un
área limpia, entonces ahí es donde necesitamos mantener un ambiente estéril
En el caso donde estamos preparando la muestra o en el cuarto de amplificación dende generamos un
tipo de contaminación es necesario que el aire sea filtrado y limpio
Es por eso que vamos a necesitar en estas dos áreas una presión negativa
Otra de la variable es el flujo de trabajo unidireccional primero empecemos en la parte de extracción
luego nos movemos al cuarto de preparación de reactivos para finalizar en el cuarto de amplificación
No podemos regresar del cuarto de amplificación al cuarto blanco el mismo día, lo ideal es que podamos
regresar al día siguiente porque nosotros mimos podemos llevar el material genético en picones a las
áreas y contaminarlas es por eso que generalmente se recomienda que hayan dos penosas en el área
para que uno haga un procedimiento, por ejemplo, uno haga la extracción otro que haga la preparación
y la amplificación de las muestras si solamente es un recurso entonces que se pueda distribuir el trabo
de tal manera que no regrese a las áreas nuevamente.
Para el caso del COVID-19 la recomendación es realizarlo en un nivel de seguridad tipo 2, donde las
técnicas microbiológicas deben de ser adecuadas, el uso de protección personal, y el uso de cabinas de
seguridad biológicas.
El equipamiento:
Cada área debe contar con el equipamiento exclusivo nos y debe compartir entre áreas
Estos materiales se deben de descontaminar antes y después de cada uno del procedimiento que
realizamos
Personal:
El personal debe estar capacitado en las técnicas de biología molecular debe también trabajar en equipo
y conocimiento de seguridad
En el caso del COVID-19 necesitamos un área previa que es el área donde se hace la preparación e
inactivación de la muestra
Si hablamos del nivel de riesgo es el área más expuesta es por eso que en esta área ocupamos un equipo
de protección personal nivel 3 y una cabina de bioseguridad biológica, luego de este proceso cuando
inactivamos al virus pues ya los procesos se vuelven menos riesgosos
O talvez en el cuarto blanco no hay ningún tipo de riego biológico entonces tenemos el cuarto de
extracción, el de preparación de reactivos y tenemos un área que es el área de adición
Esta área es una excepción siempre y cuando contemos con un espacio podríamos tener el área de
adición, pero sino lo tenemos podemos compartir el área adición con el área de extracción y siempre y
cuando se tenga una estación de trabajo para poder realizar el procedimiento que es un procedimiento
adicional y por último el cuarto de amplificación
1- Área de extracción de acido nucleicos
(ya sea extracción manual o autorizada) cuarto gris
El área de extracción debe tener, equipos y suministros exclusivos para manipulación de las muestras
como los son:
•Cabina de seguridad biológica clase 2
• Congelador / refrigeradora dedicado al almacenamiento de muestras
• Microcentrífuga
• Mezclador vortex
• Micropipetas de diferentes volúmenes
• Puntas deben ser con filtro para evitar aerosol
• Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y deben ser libres de ADNasa / ARNasa
• Equipo de protección personal
Guantes desechables, estériles sin polvo, batas quirúrgicas desechables, respirador N95, careta o gafas y
gorro
2- Área dedicada a la preparación de reactivos
• Esta debe ser el área más limpia
•Estación de trabajo o cabina de PCR con luz ultravioleta
• Freezer dedicado para el almacenamiento de los reactivos
• Micropipetas de diferentes volúmenes
• Puntas deben ser con filtro para evitar aerosol
• Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y deben ser libres de ADNasa / ARNasa
• Placas de reacción de reacción óptica
• Reactivos para la amplificación
Guantes desechables, estériles sin polvo, batas quirúrgicas desechables, mascarilla quirúrgica y gorro
3- Área amplificación (área sucia)
• Área de termociclador (plataformas de PCR en tiempo real)
• Equipos requeridos:
- Microcentrífuga de placa
- Sistema de PCR en tiempo real (Termociclador)
- Computadora para análisis de datos
Los reactivos de la RT-PCR y de ácido nucleico extraído no deben, manipularse en esta área ya que el
riesgo de contaminación es alto
Guantes, bata de laboratorio o una desechable, mascarilla quirúrgica y el gorro
Recomendaciones para evitar la contaminación de reactivos, equipos de laboratorio y del área de
trabajo, al realizar experimentos, para evitar la generación de resultados falsos positivos
• Mantenga equipos y suministros dedicados para el montaje del ensayo y la manipulación de muestras
/ acidas nucleidos extraídos.
• Mantenga los reactivos y los tubos de reacción tapados o cubiertos tanto como sea posible.
• El área de trabajo y las pipetas deben descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10% y etanol al 70%
para minimizar el riesgo de contaminación por acido nucleido.
• El ARN debe mantenerse en bloques fríos o en hielo durante la preparación y uso para asegurar la
estabilidad.
• Deseche las muestras humanas de acuerdo con las regulaciones locales, estatales y federales.
• Es importante evitar la contaminación de reactivos, equipos de laboratorio y del área de trabajo, al
realizar experimentos, para evitar la generación de resultados falsos positivos
3,500 revoluciones para la centrifugación
Lejia al 10% luego y finalizando con alcohol y luego el proceso de
