TEMA 6. METABOLÓMICA.
1. INTRODUCCIÓN.
La metabolómica se define como el complemento cuantitativo de todos los metabolitos
endógenos de bajo peso molecular y aquellos intermedios, incluidos los productos de
sustratos y los factores regulares en un estado fisiológico o de desarrollo particular.
Los metabolitos son pequeñas moléculas caracterizadas por ser compuestos orgánicos de
bajo peso molecular (no son polímeros). Además. el límite superior de peso molecular es de
800Da. (Es decir, son moléculas pequeñas que como mucho pueden presentar 800Da de
tamaño).
El metaboloma presenta el rendimiento más alto de todos los -omas. Es un sistema que
evoluciona rápidamente por lo que a la hora de evaluarlo es mucho más complejo que con
los transcriptomas y proteomas.
A día de hoy, se sigue investigando en relación a la tecnología metabolómica y aún se está
estudiando la composición del metaboloma humano. No obstante, una estimación reciente
del conjunto total de moléculas pequeñas que se esperan encontrar en el cuerpo humano
supera la 19000. Este número no solo incluye metabolitos endógenos, sino que también
incorpora metabolitos externos al organismo como metabolitos derivados de alimentos,
medicamentos, microbiota que habita el cuerpo o medio ambiente.
A diferencia de otras medidas “ómicas”, refleja directamente la actividad bioquímica
subyacente y el estado de las células/tejidos. Por tanto, la metabolómica representa mejor
m el fenotipo celular.
El metaboloma es inherentemente muy dinámico: las moléculas pequeñas se absorben,
sintetizan, degradan e interactúan continuamente con otras moléculas, tanto dentro como
entre sistemas biológicos, y con el medio ambiente. Al ser un sistema que evoluciona
rápidamente, el momento de evaluar el contendio es fundamental y la ventana de medición
es muy pequeña, no podemos sobrepasar los 300 segundos. Son fundamentales las
escalas de tiempo para hacer medidas en metabolómica. ¿Por qué? Porque, a veces,
cuando estudiamos el metaboloma, este varía tanto que sin darnos cuenta podemo
modificarlo al tratar las muestras.
La transcriptómica no se relaciona tan directamente con el fenotipo. La proteómica si que
tenía más relación. Pero, sobre todo, la relación más importante en las ciencias ómcias y lo
que realmente nos va a dar el fenotipo, son las redes de interacciones genéticas. Todas las
conexiones se relacionan con el metaboloma y eso será lo que nos indique el fenotipo.
2. Aproximaciones de la metabolómica.
Existen dos aproximaciones principales en la metabolómica:
1. Enfoque orientado/dirigido.Se centra en el estudio de un conjunto determinado de
metabolitos, implicados en una ruta concreta y específica. Y se realiza cuando hay
una pregunta bioquímica que se pretende responder. Este enfoque se utiliza a
menudo en estudios farmacocinéticos del metabolismo de fármacos y cuando se
analiza el efecto de terapias o modificaciones genéticos sobre una enzima
específica. Se buscan hacer perfiles de expresión y perfiles metabólicos.
2. Enfoque no orientado/no dirigido. Este enfoque evalúa el metaboloma completo
(mide tantos metabolitos como sea posible a partir de una variedad de muestras
biológicas sin ningún sesgo intencionado).
El enfoque elegido determinará cómo será el diseño del experimento, cómo se deben
preparar las muestras y que técnicas analíticas serán las que se utilicen).
3. Inconvenientes de la metabolómica.
La metabolómica requiere metodología avanzada. El equipo es cara, no hay un
procedimiento estándar para todos los metabolitos (a diferencia de los
transcritos y proteínas, cada metabolito es diferente y son distintos los unos con
respecto a los otros). Además, se necesitan métodos de enfriamiento y de
extracción→ No hay ningún método estándar.
Los metabolitos son diversos, no volátiles, presentan una polaridad elevada, presentan
propiedades muy similares por lo que, en general, hay que tratar de distinguirlos. Y su
detección e identificación es pobre (hay rangos de concentraciones diferentes entre unos
metabolitos y otros).
4. Esquema experimental.
1. Quenching o congelamiento. El metabolismo está cambiando de forma continua. Por
ello, necesitamos detenerlo rápidamente. Ser rápidos es importante porque si
congelamos y no obtenemos la muestra en cuestión de segundos, el sistema podrá
seguir evolucionando. Al hacer el quenching nos aseguramos de que las
concentraciones intracelulares obtenidas son fiables. Se puede hacer de dos formas:
-Con bajas temperaturas. Se hace un enfriamiento con metanol o nitrógeno líquido.
-Con altas temperaturas. Se hace una ebullición con etanol absoluto.
2. Extracción. Se selecciona un procedimiento apropiado para extraer los metabolitos
objetivo y poder analizarlos, posteriormente. Se puede hacer:
-Con bajas temperaturas. Se hace una extracción con metanol en frío, -20ºC:
extracción con croroformo/metanol; o extracción con ácido perclórico (-10ºC).
-Con altas temperaturas. Se hace una extracción con etanol en caliente, 90ºC o con
hidróxido de potasio a 80ºC.
3. Análisis. Se puede usar la MS. La MS nos dará las masas de todas las moléculas
que se pretenden analizar. Es probable que haya solapamiento de masas cuando
queremos analizar todos los metabolitos a la vez. Por ello, es conveniente incorporar
sistemas de separación: LC, GC o EC.
3.1. Separación.
● LC→Cromatografía líquida es una técnica de separación en la que la
fase móvil es un líquido. Una variante es la HPLC, cromatografía
líquida de alta presión/resolución en la que la muestra se fuerza a
través de una columna que está llena de partículas de forma
irregular o esférica o una capa monolítica porosa (fase estacionaria)
mediante un líquido (fase móvil) a alta presión.
En función de la polaridad de la fase móvil y estacionaria, la cromatografía
podrá ser normal (la fase estacionaria es más polar que la móvil) o inversa (la
fase móvil es más polar que la fase estacionaria).
Habitualmente, se usa HPLC o cromatografías bidimensionales donde se
coloca una columna detrás de la otra. Conforme salen las moléculas de la 1ª
columna, se separan por una propiedad determinada y, seguidamente, pasan
a la 2ª columna, donde se separarán en función de otra propiedad distinta. A
la salida de cada columna tenemos detectores.
● GC→Cromatografía de Gases. La fase móvil es un gas portador,
normalmente se usa un gas inerte como el helio o un gas no reactivo
como el nitrógeno. La fase estacionaria es una capa microscópica de
líquido o polímero sobre un soporte sólido inerte, dentro de un trozo de
tubo de vidrio o metal. Los compuestos gaseosos analizados interactúan
con las paredes de la columna, que está recubierta con diferentes fases
estacionarias. Esto hace que cada compuesto eluya en un momento
diferente.
● CE→Electroforesis capilar. La electroforesis de zona capilar (CZE) es el
modo de separación más simple y más utilizado en CE. La separación se
basa en las diferentes.movilidades electroforéticas de solutos, que son
propiedades características del ion analito en un medio determinado y a
una temperatura determinada. Solo los iones cargados se pueden separar
mediante este método. El uso de aditivos como disolventes orgánicos y
agentes complejantes (ciclodextrinas, éteres corona) también es un
método eficaz para mejorar la resolución.
3.2. Ionización.
Las fuentes principales de ionización son MALDI, ESI.
ESI. Ionización por Electrospray→Nivel 1: • La muestra se mezcla con un
disolvente y se introduce en un recipiente. Se le aplica un voltaje muy alto, que
carga las moléculas del disolvente. Las moléculas se repelen unas a otras casi
violentamente. Las gotas se separan formando un fino rocío. Nivel 2: • Las gotas
del spray pasan por una serie de divisiones y se evaporan gradualmente (con la
ayuda de gas nitrógeno) • Cuando estos iones se acercan lo suficiente, se
repelen entre sí, lo que hace que las gotas se dividan en dos gotas más
pequeñas. • Este proceso se repite hasta que el disolvente se evapora por
completo y las gotas se han dividido hasta el punto de que cada una es una
única molécula cargada. • Las moléculas permanecen intactas y no se romperán;
esto es lo que se quiere decir cuando este tipo de ionización se llama suave.
● MALDI→Desorción/ionización láser asistida por matriz.
-Formación de una 'solución sólida', lo que es requerido para producir una desorción
estable del analito
-Excitación de matriz: El rayo láser se enfoca sobre la superficie de la solución
sólida. El cromáforo de la matriz se acopla con la frecuencia del láser provocando
una rápida excitación vibratoria, provocando desintegración localizada de la solución
sólida. Los grupos expulsados de la superficie consisten en moléculas de analito
rodeadas por una matriz e iones de sal. Las moléculas de la matriz se evaporan de
los grupos para dejar el analito libre en la fase gaseosa.
-Ionización de analitos: •Las moléculas de la matriz fotoexcitadas se estabilizan
mediante la transferencia de protones al analito. •Luego, los iones se extraen en el
espectrómetro de masas para su análisis..
3.3.Análisis/detección.
La espectrometría de masas se basa en el análisis de iones que se mueven en el vacío. El
resultado son espectros de masas. Se va a obtener información relacionada con el peso
molecular, estructura, cantidad y pureza. Los analizadores se clasifican en:
● Cuadrupolo-Q. (MS, MS/MS). El analizador de masas cuadrupolo consta de 4
varillas paralelas a las que se aplican voltajes específicos. Los iones del analito se
dirigen hacia el centro de las varillas. Tensiones aplicadas a las varillas.generan un
campo electromagnético.. Este campo determinará qué relación masa-carga de
iones puede pasar a través del filtro en un momento dado. Los iones seleccionados
pasan y se concentran en el detector.
● Tiempo de Vuelo- TOF. Produce la separación de iones en 2 etapas:
1. Pulsador de iones. El haz de iones pasa al pulsador de iones de tiempo de
vuelo..El pulsador de iones es una pila de placas, cada una (excepto la placa
posterior) con un orificio central. Para iniciar el vuelo del ion hacia el detector,
se aplica un pulso de alto voltaje (HV)a la placa trasera. El pulso aplicado
acelera los iones a través de la pila de placas pulsadoras, actuando como
una pistola de iones de disparo rápido.
2. Tubo de vuelo. Los iones salen del pulsador de iones y viajan a través del
tubo de vuelo. En el extremo opuesto del tubo de vuelo hay un “espejo” de
iones, que refleja los iones que llegan cerca del extremo del tubo de vuelo
hacia el pulsador de iones donde está montado el detector de iones.
● Transformación de Fourier→Resonancia de ciclotrón de iones (FT-ICR-MS).
La frecuencia de la señal de cada ion, que sufre una reacción ciclotrón de
iones en un campo magnético, se convierte al valor m/z. El movimiento
de un ion se puede manipular mientras viaja a través de un campo
magnético. La resonancia del ciclotrón de iones aprovecha este principio
no sólo para manipular el movimiento del ión a través de una trayectoria
transitoria, sino también para atraparlo durante un período prolongado.
4. RMN.
En la RMN la señal de cada metabolito es más específica que en MS. En RMN se tiene en
cuenta la masa de la partícula, las interacciones, apantallamientos, localización, etc. Es más
preciso, reproducible, nos permite distinguir unas partículas de otras. Además, es menos
sensible pero más reproducible. No es óptima para análisis y requiere menos muestras y
menos tratamiento de las muestras., pero si es más rápida.
A la vez que sale el metabolito del cromatógrafo, se puede hacer un análisis en el espectro
de masas y podemos derivarla al RMN. Podemos ir comparando la info del espectrómetro
de masas con el RMN.
5. Criterios de valoración de los estudios en metabolómica y ruidos.
Normalmente, el criterio de valoración de los estudios de metabolómica de MS y RMN es
una matriz de características, anotada. Esta matriz de características contiene las
intensidades o abundancias relativas de señales relevantes para cada muestra,
describiendo la huella dactilar de la metabolómica.
