Curso:
2024/25
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA POR EL
METODO DE FILTRACION Profesores:
Módulo: ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
Ciclo: LABORATORIO DE ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD
1. OBJETIVO:
Determinar el número y tipo de bacterias existentes en el agua de muestra. En este grupo se
incluyen bacterias patógenas y no patógenas (alterantes, saprófitos, etc.). El recuento nos
permite conocer la calidad microbiológica del agua.
2. FUNDAMENTO TEÓRICO:
El método se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de
membrana microporosa en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Después,
se incuba la membrana sobre un medio de cultivo adecuado, a la temperatura y durante el
tiempo necesario, para posteriormente contar las colonias directamente sobre la superficie
de la membrana.
El tipo de medio utilizado permite realizar la investigación y el recuento de diversos tipos de
bacterias. Se utilizaran placas comerciales para análisis de aguas con los siguientes medios
de cultivo, algunas de las cuales son:
• Placas con agar PCA, medio general utilizado para recuento de microorganismos
aerobios mesófilos totales.
• Placas con Agar VRBG, medio selectivo para enterobacterias, que originan colonias de
color rojo-púrpura tras incubación a 37 ºC durante 24 h.
• Placas con agar Chapman, medio selectivo y diferencial para el recuento de E. coli y
coliformes, incubando a 44ºC y a 37 ºC respectivamente durante 24 h. las colonias
positivas son amarillas oscuras con el centro naranja, el medio es amarillo.
• Placas con agar Dextrosa-Sabouraud + Cloranfenicol, este medio presenta elevada
concentración de dextrosa, pH ácido y cloranfenicol, un antibiótico que inhibe el
crecimiento de la mayoría de las bacterias. Por tanto es un medio selectivo para el
cultivo y aislamiento de mohos y levaduras. La incubación se realiza a 30 ºC de 3 a 7 días.
• Placas con agar Slatnetz-Bartley, medio selectivo para enterococos intestinales
(estreptococos fecales). Tras la incubación a 37 ºC durante 48 h y las colonias de
enterococos presentan color rojo o marrón.
• Placas con Agar m-CP: selectivo para Clostridium perfringes, tras la incubación en
condiciones anaerobias a 44 ºC durante 24 h las colonias positivas son amarillas y
cambian a rosa o rojo tras la exposición a vapores de amoniaco durante 20-30 s.
• Placas con agar cetrimida: selectivo para Pseudomas aeruginosa, tras la incubación las
colonias positivas presentan un color verde amarillento fluorescente debido a la
producción de un pigmento.
3. MATERIAL:
Material estéril por grupo: 1 frasco estéril (con tiosulfato si es necesario), probeta estéril.
Equipo de filtración Millipore: rampa de filtración, membranas estériles de porosidad 0,45,
embudos de filtración estériles.
Bomba de vacío. Mechero Bunsen.
Pinzas. Jarra de anaerobiosis
4. REACTIVOS:
• Desinfectante: Etanol
• Sobres generadores de anaerobiosis.
• Placas con los medios de cultivo indicados según disponibilidad en el laboratorio.
• Tiosulfato de sodio 20 a 50 mg, o 0,2 ml de dicho compuesto al 30 % en un volumen
total de 250 ml de muestra.
5. MÉTODO OPERATIVO:
1. Tomar la muestra en un frasco estéril y añadir tiosulfato si es necesario.
2. Montar el equipo de filtración en condiciones asépticas.
3. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros.
4. Colocar un filtro de membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas de acero
previamente flameadas con alcohol.
5. Situar un embudo sobre el soporte hasta que esté fijo.
6. Verter la muestra de agua problema en el embudo (100 ml medidos con probeta estéril)
y aplicar el vacío hasta que el líquido se haya filtrado.
7. Romper el vacío y extraer el embudo. Con las pinzas flameadas se extrae el filtro del
soporte.
8. Se coloca el filtro dentro de una placa Petri sobre el medio de cultivo, con la cuadricula
hacia arriba, procurando que no se formen burbujas entre la membrana y el medio de
cultivo.
9. Las placas se llevan a incubar en posición invertida en la estufa en las siguientes
condiciones:
Placas PCA: 24-48 h a 30 ºC. Placas Slatnetz- Bartley: 48 h a 37 ºC.
Placas VRBG: 24 h a 37 ºC. Placas m-CP: 24 h a 44 ºC en jarras de
Placas Chapman: 24 h a 44 ºC. anaerobiosis.
Placas Dextrosa-Sabouraud Cloranfenicol, Placas cetrimida: 30-35 ºC, 18-72 h.
3-7 días a 30 ºC.
Nota: mantener las condiciones asépticas durante todo el procedimiento
6. RESULTADOS:
• Expresar recuento de los microorganismos analizados en UFC/100 ml.
• Comprobar si el agua analizada cumple la normativa aplicable.
• Realizar fotos de las placas tras la incubación.
7. DOCUMENTACIÓN APLICABLE:
Instrucciones equipo de filtración Millipore.
Instrucciones jarras y sobres de anaerobiosis.
Normas: UNE-EN-ISO7899-2 (Enterococos), UNE-EN ISO 14189 (Clostridium perfringes) UNE-EN-
ISO 16266 (Pseudomonas aeruginosa)
Legislación vigente en materia de aguas.
Normas de seguridad del laboratorio de microbiología.
Vídeo: Análisis de aguas por filtración.
