Informe N°6
Tamiz Molecular
Bellotto, Conrado; Casco, Alexis
[Link]@[Link]; cascoalexis98@[Link]
Departamento de Química Biológica - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Objetivos
- Aprender cómo utilizar el tamaño (o, más precisamente, el radio hidrodinámico) de
una molécula para separarla de otros componentes presentes en una mezcla.
Materiales
- Dextran-Blue (Azul Dextrano)
- Solución de CoCl2
- Solución de BaCl2
- Reactivo de Bradford
- Columnas de vidrio empacadas con Sephadex G-25
Introducción
La cromatografía de exclusión molecular es una técnica de separación basada en la
distribución diferencial de las partículas entre una fase móvil y una fase estacionaria. La
separación ocurre según el radio de Stokes, con las partículas más pequeñas siendo más
retenidas y las más grandes eluyendo más rápidamente, ya que no pueden penetrar los poros
del gel de la columna.
La fase estacionaria consiste en esferas de polímeros entrecruzados que forman una matriz
tridimensional al absorber líquido. Estas esferas no tienen carga, por lo que no interactúan
con la muestra; la separación se basa únicamente en el tamaño de las partículas. Cada gel
tendrá un rango de separación determinado por el tamaño de los poros de la fase estacionaria.
Todas las especies con un tamaño mayor al rango del gel saldrán juntas en el volumen
muerto, que corresponde al volumen fuera de las esferas de polímero. Las partículas de
tamaño menor al mínimo del rango saldrán juntas en el volumen total de la columna, podrán
recorrer todo el volumen sin ningún impedimento. Se puede calibrar la columna utilizando
Durante la elución, la calibración de la columna permite determinar los volúmenes V0
(volumen muerto) y Vt (volumen total). Las partículas más grandes eluyen en V0, mientras
que las más pequeñas eluyen en Vt.
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Procedimiento experimental
Se siguió el procedimiento descrito en la guía de trabajos prácticos de la materia Química
Biológica, segundo cuatrimestre 2024. Se utilizó una bureta de (10±0,1) ml para medir el
volumen de elución del blue dextrano y el CoCl2 y determinar V0 y Vtot con mayor precisión,
ya que se recolectó volumen de más en algunas fracciones.
Resultados
Se utilizó una mezcla de blue dextrano y cloruro de cobalto para calibrar la columna. En
Tabla 1 se muestra la información experimental de relevancia, y en Figura 1 el perfil de
elución obtenido para la separación de la proteína.
Vtot (CoCl2) (ml) Vtot geométrico (ml) V0 (ml)
15,5 21,2 6,9
Tabla 1: Valores de calibración de la columna de tamiz molecular
Figura 1: Perfil de elución experimental para la desalación de ALA-D por tamiz molecular
Se observó que las fracciones con mayor concentración de proteínas fueron las número 7, 8 y
9. Para la columna que utilizamos, se espera que la proteína ALA-D caiga por fuera del rango
de resolución de la columna (1-5kD), por lo que se la observaría en el V0. El PM aproximado
es de 220 y 320 kD1.
Como en este caso tenemos una muestra ya purificada, que solo se busca desalar, es
razonable utilizar el V0 de forma preparativa. En este caso, sabemos que la muestra está
prácticamente libre de otras proteínas que podrían eluir también en el volumen muerto, por lo
que recolectamos el V0 que tiene la ventaja de generar la menor dilución posible de la
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Guia de trabajos prácticos QB, 2C 2024.
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muestra. El volumen al que eluyó la proteína es algo diferente al V0, pero esta diferencia es
atribuible a factores experimentales relacionadas con la preparación de la columna.
Como se observa en el perfil de elución (Figura 1), se formó un precipitado blanco en las
fracciones 14, 15 y 16. Este precipitado se forma al reaccionar los cationes de bario con
sulfatos, formando así una sal muy insoluble. Se puede utilizar entonces para detectar las
fracciones en las que eluyó el sulfato de amonio presente en la muestra. Como estos iones son
muy pequeños (132 D para la sal no disociada), eluyen en el Vtot. La sal eluyó en un volumen
cercano al Vtot calculado en la calibración, como se esperaba.
Para ninguno de los tubos que contenían a la proteína se observó precipitado blanco, lo que
indica que se logró desalar la muestra como se propuso para la realización de la práctica.
Conclusiones
Se utilizó la cromatografía de filtración molecular para separar la proteína de las sales,
aprovechando la gran diferencia de sus pesos moleculares; los cuales se encuentran
relacionados directamente con el radio hidrodinámico, y permitió separar los dos
componentes mayoritarios de la muestra.
Para ello, inicialmente se determinaron los volúmenes característicos, Vo y Vt calibrando la
columna con blue dextrano y cloruro de cobalto. Era esperable que el ALA-D eluyera en el
volumen muerto, debido a su gran peso molecular. Si bien eluyó en un volumen mayor a Vo,
esto era esperable por distintos factores empíricos.
Se observó poca dilución de la proteína debido a la gran intensidad de las fracciones
correspondientes a la proteína en las que se agregó Bradford, lo que es deseable al momento
de desalar. Además, la ausencia de precipitado de cationes bario en las fracciones donde hay
proteína, deja en evidencia que el desalado se llevó a cabo con rotundo éxito. Esto permitió a
los usuarios familiarizarse con la técnica de tamiz molecular, por lo tanto se lograron
entonces completar todos los objetivos establecidos para el trabajo práctico.
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Anexo
[Link]
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