Capítulo

Aplicaciones
1 de la microscopía
en la histología
y la biología celular
Armando Zepeda Rodríguez

Microscopía fotónica observar el mundo microscópico de manera sistemática

fueron fabricados por Anton van Leeuwenhoek (1632-
Introducción 1723). La necesidad de mejorar sus descripciones lo llevó a
perfeccionar sus microscopios y a optimizar las lentes que
Una gran variedad de actividades humanas son afectadas fabricaba, con lo cual logró magnificar sus objetos de estu-
por la tecnología que de alguna forma usa energía lumino- dio hasta 266 veces (figura 1-1).
sa. Los fotones forman parte de nuestras actividades coti- Su precario instrumento cambió la historia de las
dianas tanto en el hogar como en la industria, al igual que incipientes ciencias naturales y morfológicas. Con sus
en los laboratorios clínicos y de investigación; sin los foto- microscopios observó gran cantidad de células y organis-
nes, gran parte de nuestras comodidades estarían limita- mos microscópicos como fibras musculares teñidas con
das. Los diagnósticos clínicos y tratamientos quirúrgicos azafrán; elementos celulares de la circulación sanguínea
tendrían poco éxito sin un microscopio que los module de animales y del ser humano, lo que le permitió confir-
para amplificar la eficiencia del sentido de la vista. El ojo mar la teoría de Malpighi sobre la conformación de las
humano es el órgano capaz de percibir la luz del entorno, redes capilares. Dedicó mucho de su tiempo a estudiar
es como una cámara oscura en la que entra la luz a un espermatozoides de distintas especies, y a la reproducción
sistema de lentes que la conducen hasta la retina; en ésta de aves y anfibios. Estudió la morfología y anatomía de
se transforma la energía luminosa en estímulos nerviosos. insectos, de algas microscópicas, y anatomía e histología
La retina está compuesta de conos, bastones y fibras ner- vegetal. Los protozoarios no escaparon a su curiosidad y
viosas que se comunican con el nervio óptico; su sensibili- sagacidad; a todos estos organismos que él puso bajo sus
dad depende del color, la dirección de la luz incidente y del lentes los llamó pequeños Animalcula. Por su habilidad,
tiempo que permanezca el estímulo luminoso. tenacidad, constancia y perseverancia en las observacio-
nes obtuvo importantes distinciones en su época, como
El microscopio —y quizá la más importante— el ser nombrado miembro
de la Royal Society of London, así como recibir el nombra-
La construcción del primer microscopio se atribuye a los miento histórico de “Padre de la Embriología, Protozoolo-
hermanos Hans y Zacharias Jansen en 1590, quienes incor- gía, Bacteriología y por supuesto Padre de la Microscopía”.
poraron tubos de telescopios y lentes convergentes, con lo Pasaron más de 200 años desde el descubrimiento de
que obtuvieron imágenes aumentadas hasta 150 veces, la célula, hasta que en 1872, Ernst Abbe (1840-1905) esta-
aunque con grandes aberraciones. Los primeros estudios bleció las bases y la teoría matemática para fabricar de
sobre la historia del microscopio fueron realizados por el manera científica lentes para los microscopios; desde
filósofo Francis Bacon von Verulam (1561-1630), quien le entonces la microscopía se convirtió en una herramienta
asignó el nombre de “microscopium”. Verulam pertenecía a fundamental para el estudio de células y tejidos; su perfec-
la “Academia del lince”, de la que también era miembro cionamiento ha llevado tres siglos. En la actualidad se
Galileo Galilei. Para otros autores, el término microscopio conoce una docena de sistemas ópticos. Abbe aportó con-
fue acuñado por Anastasius Kircher (1602-1680) quien en tribuciones muy importantes a la óptica, como el cálculo
su libro Ars Magna Lucis et Umbrae realiza la primera cla- del Límite de Resolución que está determinado por la lon-
sificación de microscopios conocidos en el siglo xvii. Sin gitud de onda de la luz (λ) y por la apertura numérica y el
embargo, los primeros microscopios que se utilizaron para condensador que llevan su nombre (figura 1-2).

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4 Histología y biología celular

8. Insertar el filtro azul para compensar a la temperatura

de color generada por la fuente luminosa.
9. Ajustar el enfoque a cada cambio de objetivo.
10. Para objetivos de campo amplio y bajo aumento, aba-
tir la lente frontal del condensador sin alterar la altura
del condensador.
Realizar la iluminación de Köhler en el Sistema Ópti-
co de Campo Claro (CC) antes de analizar cortes histoló-
gicos brinda varios beneficios, como tener un campo
visual iluminado de manera uniforme y neutro, apreciar
imágenes brillantes y nítidas, además de realizar la obser-
vación de manera placentera.

Figura 1-1. Microscopio fabricado por Anton van Leeuwenhoek,

dimensiones reales, referencia a una mano de tamaño regular. Cuidados del microscopio
Una de las maneras más sencillas de conservar limpio un
microscopio es mantenerlo cubierto con una funda pro-
Los descubrimientos realizados con el microscopio tectora. Existen dos maneras de mantenimiento para un
comenzaron en 1665 cuando Robert Hooke descubre y se microscopio, uno es el mantenimiento preventivo y el otro
acuña el concepto de “célula”; en 1833, Brown escribe sus es correctivo; el primero debe realizarlo el usuario, pero el
observaciones sobre el núcleo celular; en 1838, Mathias segundo sólo el personal capacitado. El sitio de instalación
Schleiden y Theodor Schwann proponen la “teoría celu- de un microscopio debe ser en un lugar libre de polvo, en
lar”; Kolliker en 1857 observó por primera vez mitocon- un clima templado y estable, en un cuarto que sea posible
drias. Los descubrimientos estaban a la orden del día, en oscurecer en forma parcial y sobre una mesa libre de vibra-
1879, Fleming describió cromosomas en mitosis, 20 años ciones. Cuando debido a su uso sea indispensable limpiar
más tarde, Camilo Golgi describía lo que hoy se conoce alguna pieza, es necesario contar con aplicadores de made-
como “aparato de Golgi”. En la primera mitad del siglo xx ra, algodón, agua destilada, brocha de pelo natural, pinceles
el microscopio fotónico se acercaba a su límite de magni- finos y bulbos de goma. Lo primero que debe eliminarse,
ficación que, a su vez, era el límite de resolución. es el polvo de la superficie de las lentes, primero debe inten-
tarse sólo con aire, si éste no se elimina hay que hacerlo
Iluminación de Köhler con un algodón sobre un aplicador humedecido con agua
destilada, y secarlo con otro aplicador seco. Una observa-
El procedimiento se desglosa en los siguientes pasos:
ción importante es que aunque tenga polvo nunca debe
1. Subir por completo el condensador con la lente fron- frotarse la lente con lienzos secos. Si sobre las lentes hay
tal introducida. manchas muy adheridas que no se limpiaron como ya se
2. Enfocar la preparación con los objetivos 10. indicó, es preciso limpiar con un algodón humedecido con
3. Observar y cerrar el diafragma de campo. una solución de cuatro partes de bencina de petróleo, cua-
4. Bajar el condensador hasta obtener máxima nitidez tro partes de etanol absoluto y dos partes de éter. Es preci-
de la imagen del diafragma. so nunca utilizar xilol, tolueno o benceno.
5. Centrar el diafragma de campo al campo visual, con Las partes mecánicas se limpian con un trapo de algo-
los tornillos de centrado del condensador. dón humedecido con agua destilada, si requiere detergen-
6. Abrir el diafragma de campo, casi hasta el borde, y te éste debe ser neutro y en bajas concentraciones. La
centrarlo de nuevo, abrirlo hasta que desaparezca lubricación de las guías y cremalleras debe ser efectuada
detrás del borde del campo visual. por un experto.
7. Regular el contraste de la imagen con ayuda del dia-
fragma del condensador.
Sistema óptico de campo claro
El microscopio compuesto en su forma más elemental está
formado por un par de juegos de lentes; el primer juego más
cercano al espécimen es el objetivo, que forma una imagen
real, aumentada e invertida del objeto; el segundo juego
está próximo al ojo, es el ocular, éste amplifica la imagen
formada por el objetivo; la distancia entre el foco posterior
Figura 1-2. Ecuación de Abbe, que describe la resolución en fun- al objetivo y el foco anterior al ocular se llama longitud del
ción de la longitud de onda y de la apertura numérica. tubo, que generalmente es de 16 cm (figura 1-3).

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 Capítulo 1 ■ Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular 5

OCULAR

df oc

Figura 1-4. Condensador de campo claro con lente abatible y

diafragma de iris.
L

Este sistema óptico utiliza una lámpara de halógeno

de bajo voltaje (6 a 12 V), la temperatura de color de dicha
lámpara alcanza unos 5 000 Kelvin, comparable con la
temperatura de color de la luz de día (5 500 K); si no alcan-
za esas condiciones se utilizan filtros azul o magenta para
dt obj compensar la temperatura de color. En la salida de la lám-
para se encuentra el diafragma de campo que dirige la luz
OBJETIVO al condensador. Es un conjunto de lentes que tienen la
función de agrupar los rayos de luz provenientes de la
lámpara y enfocarlos en el plano de la preparación. El con-
densador más utilizado es el de CC, es el condensador de
Abbe, el cual incluye un diafragma de iris y una lente fron-
tal abatible (figura 1-4).
Los objetivos cuentan con una serie de datos inscritos
en el exterior del mismo. Con letras impresas se lee el tipo
de objetivo, el valor del aumento está inscrito por un
Figura 1-3. Representación esquemática de un microscopio for- número seguido de ×, el siguiente dato está colocado des-
mado por dos lentes convergentes que representan el trabajo óptico pués de una línea diagonal y corresponde al valor de la
de las lentes, la magnificación y la función de la longitud del tubo apertura numérica, más abajo se localizan dos datos sepa-
(λ). rados por una línea diagonal; el primero indica la distancia
de trabajo de ese objetivo y puede leerse un símbolo de
infinito o bien un número (160); el siguiente dato corres-
Con todo su arsenal de sistemas ópticos, una variedad ponde al espesor del cubreobjeto, o bien, puede tener una
que incluyen campo claro (CC), luz polarizada (LP), con- línea que indica que ese objetivo podría trabajar sin cubre-
traste de fases (CF), contraste diferencial de interferencia objeto en la preparación; a continuación se marca un ani-
(CDI [conocido también como sistema de Nomarsky]) y la llo superior de color específico para cada aumento. El
fluorescencia, entre otros, la Biomedicina ha explorado el anillo proximal es una banda visible de color situada casi al
maravilloso mundo de la estructura y la fisiología celular borde de la camisa principal; con este distintivo se recono-
in vitro e in vivo. El sistema óptico de CC se llama así debi- ce el factor de aumento de cada objetivo (figura 1-5). El
do a que la luz que debe llegar hasta los oculares debe ser anillo inferior de los objetivos está colocado en el borde de
totalmente neutra, por lo que el campo debe ser blanco. la lente y corresponde a un código de colores y de líquido
Cuando en la trayectoria de esta luz blanca se colocan cor- de inmersión.
tes histológicos con tinciones, la estructura histológica En los oculares se inscriben características importan-
que ha incorporado alguno de los colorantes debe saltar a tes como la magnificación y el campo visual, así como las
la vista, contrastándose contra el fondo que es totalmente correcciones. La magnificación se identifica con un ×, des-
uniforme y neutro. pués de la diagonal se puede leer la cifra de campo (figura

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6 Histología y biología celular

Sistema óptico de luz polarizada

Existen cuatro tipos de polarización: absorción, reflexión,
dispersión y por birrefringencia (doble refracción). El sis-
tema óptico de LP utiliza como base al de CC. Cuando en
forma consecutiva a lo largo de un mismo eje óptico se
colocan dos polarizadores, al primero se le denomina
polarizador mientras que al segundo analizador. Si los ejes
de polarización están cruzados (90º entre ambos) la luz no
logrará salir del analizador, según la ley de Malus (MOS-
CA). El polarizador se coloca entre la fuente de ilumina-
ción y la base del condensador, el analizador se coloca en
el eje óptico entre el objetivo y el ocular. El campo forma-
do entre el polarizador y el analizador se conoce como
Figura 1-5. Revólver con objetivos que poseen inscripción de las “campo de luz polarizada”, de tal modo que el analizador
características sobre la funda. bloquea las longitudes de onda orientadas conforme al
polarizador, por lo que es imposible registrar algún rayo
de luz por la salida del ocular. Cuando en la platina se
coloca una preparación con actividad óptica al campo de
1-6). Este valor es muy útil para calcular el diámetro total luz polarizada, ésta cambiará su patrón de vibración por
del campo visual; por ejemplo, para calcular el valor del birrefringencia. Este sistema es ideal para analizar la pre-
campo visual de un ocular con valor de 10×/20 con un sencia de cristales como el almidón, oxalatos, urea, o polí-
objetivo de 100×, se divide el valor de la cifra de campo meros incluidos en tejidos con o sin tinción y aun en forma
(20) entre el valor de amplificación del objetivo (100), es aislada. Estos materiales aparecen en el campo de obser-
decir 20/100 el resultado es 0.2 mm, lo que significa que el vación con algún patrón de formas y colores característi-
diámetro del campo observado es la cuarta parte de un cos, contrastados contra el resto del campo que es negro
milímetro, por tanto, el campo total de observación en por la ausencia de luz. La óptica utilizada en este sistema
estas condiciones es de 200 micrómetros. debe ser destensada para evitar la inducción de birrefrin-
gencia. Los condensadores y objetivos son identificados
con la leyenda “Pol” en color rojo.

Sistema óptico de contraste de fases

Fritz Zernike revolucionó la investigación en la Biología
celular con la innovación del sistema óptico de contraste
de fases (CF), mediante el cual fue posible observar espe-
címenes biológicos como células en cultivo y organismos
vivos sin teñir; esto le valió el Premio Nobel en Física en
1953. El sistema óptico (SO) de CF revela las diferencias
entre los índices de refracción de los diferentes compo-
nentes celulares y el citoplasma, contrastándolos y eviden-
ciándolos por su grosor y densidad como diferencias de
intensidad luminosa. Estas pequeñas diferencias de con-
traste se producen por la naturaleza de la muestra y se
intensifican por el diseño del sistema óptico. El sistema
se construye a partir de un sistema óptico de CC al que se
incorporan un par de anillos de fase (Ph) que trabajan
de manera complementaria, el primero es un anillo claro
por el cual pasa la luz y está inscrito en una placa que blo-
quea el resto de la luz desde el condensador. El segundo
anillo es el inverso del primero, es oscuro y sólo él bloquea
la luz que ha dejado pasar el anillo del condensador, es
decir, que tanto el centro como la periferia del objetivo
Figura 1-6. Ocular con datos inscritos en el anillo frontal, Kpl: dejan pasar la luz. La combinación de este conjunto de ani-
plan acromático, W: campo amplio. 10×: magnificación. /20: diáme- llos logra desfasar hasta en 1/4 algunas longitudes de onda.
tro de campo de observación. Tanto el objetivo como el condensador tienen una leyenda

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 Capítulo 1 ■ Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular 7

Ph seguida por un número que va de 1 a 3 (p. ej., Ph2), que

al utilizar este SO deberán ser superpuestos y alineados
entre sí (figura 1-7). La eficiencia de este SO se alcanza con 565 nm visible
luz verde monocromática; observando organismos y célu-
las in vivo muy delgados y en solución acuosa, el núcleo y
los organelos aparecen más oscuros que el citoplasma,
mientras que los contornos celulares se aprecian como
halos brillantes. E

Microscopía de fluorescencia UV 365 nm invisible

El británico sir George G. Stokes acuñó el término “fluo-

rescencia” después de observar el mineral fluorspar cuan- Figura 1-8. Representación del principio de fluorescencia. Ener-
do lo iluminaba con energía ultravioleta. La microscopía gía ultravioleta (UV) no visible, es dirigida puntualmente al espéci-
men, el cual emite una longitud de onda más larga que la que
de fluorescencia fue en un inicio estudiada por August
recibió, al salir del sistema de fluorescencia es visible al observador.
Köhler y Carl Reichert, después hubo un largo periodo en
que quedó casi en desuso; en fechas recientes se ha conso-
lidado como una técnica indispensable en la medicina y la
biología celular. Muchos especímenes, como minerales,
cristales, resinas, fármacos, mantequilla, clorofila, ceru- po marcado con fluoresceína. Dicha técnica ha resuelto
men y vitaminas muestran autofluorescencia cuando son interrogantes sobre la estructura y función de órganos,
radiados con energía ultravioleta. En el decenio de 1930- tejidos y células, además de ser fundamental en estudios
1939, el austriaco Max Haitinger desarrolló la técnica de de inmunolocalización de proteínas y macromoléculas
fluorescencia secundaria empleando fluorocromos para participantes en vías de señalización.
marcar componentes celulares, de bacterias y de otros El fenómeno de la fluorescencia se basa en la luminis-
microorganismos sin autofluorescencia (figura 1-8). En cencia, definida como la capacidad de un cuerpo para
1950, Albert Coons y Nathan Kaplan demostraron la loca- emitir energía ultravioleta (UV), infrarrojo (IR) o luz visi-
lización de antígenos en tejidos tratados con un anticuer- ble durante el paso de un estado de excitación a su estado
de reposo (el estado básico). La luminiscencia tiene dos
fenómenos, el primero —la fosforescencia— en la que un
cuerpo emite energía continua por un tiempo prolongado.
El segundo fenómeno es la fluorescencia, la capacidad de
algunas sustancias químicas conocidas como fluorocro-
mos para absorber longitudes de onda, almacenarla y libe-
rarla después como luz visible de mayor longitud de onda.
Se conocen dos tipos del sistema óptico de fluorescencia,
el primero por transiluminación y el segundo por epifluo-
rescencia. La fuente de iluminación es una lámpara a base
de vapor de mercurio que emite un espectro en azul y en
ultravioleta. Esta energía es filtrada en forma selectiva por
un juego de filtros de excitación antes de llegar al espéci-
men, que luego de ser radiado emite longitudes de onda de
la luz visible. Después de pasar por el objetivo y antes del
ocular pasa por un juego de filtros barrera que bloquean el
exceso de energía ultravioleta y sólo dejan pasar la longi-
tud de onda seccionada; revelando sólo la fluorescencia. El
campo visual es un campo oscuro en el que resaltan los
colores de la autofluorescencia o bien de los fluorocromos.
El condensador y los objetivos utilizados en este sistema
deben ser corregidos y destensados.
Una de las técnicas más comunes es el DAPI (4´,6-dia-
midino-2-fenilindol), un fluorocromo que marca el ácido
A B C desoxirribonucleico (DNA), el cual tiene alta afinidad por
Figura 1-7. Representación esquemática de: A) Sistema óptico las bases adenosina-timidina (A-T) regiones de pares de
de campo claro; B) Sistema óptico de luz polarizada. C) Sistema ópti- bases en el DNA, es excitada por ultravioleta con rangos
co de contraste de fases. de absorción de 355 nm.

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8 Histología y biología celular

Microscopio de barrido láser confocal Fotomultiplicador

La microscopía fotónica ha sido objeto de muchos cam-

bios en las últimas dos décadas, el mejor ejemplo es la Apertura
microscopía de barrido láser confocal, que constituye un
sistema especializado, en el que uno o varios rayos láser
barren distintos planos focales de un mismo espécimen y
forma imágenes seriadas, que son almacenadas a través de
un software como archivo digital. Este sistema ha revolu- Láser
cionado la biología celular, proporciona ventajas extraor-
dinarias, debido a su magnífica nitidez y capacidad de
información en 1.5 veces más que la microscopía fotónica, XY
también constituye una poderosa herramienta para anali- Divisor
zar la estructura de células y tejidos vivos así como frag-
mentos histológicos sin que éstos sufran daño tanto por Barrido
transmisión como por reflexión. La extensión de la magni- XY
Objeto
ficación permite hacer reconstrucciones tridimensionales
con gran precisión y reduce de manera notable el blan- Espécimen
queo de la fluorescencia por exposición innecesaria y —tal
vez lo más importante— elimina el efecto de desenfoque.
Estas ventajas han hecho de la microscopía una disciplina
Control en z
de gran popularidad gracias a su opción de generar imáge-
nes limpias y bien definidas, incluso de especímenes vivos Z
en tercera dimensión con amplia profundidad de campo. Figura 1-9. Representación esquemática de un microscopio de
El rayo láser es la piedra angular en este sistema, su nom- barrido láser confocal.
bre es un acrónimo de su nombre en inglés: light amplifi-
cation by stimulated emission of radiation; se trata de un
dispositivo que crea y amplifica un fino haz de luz, inten- por los investigadores son: marcaje múltiple, barrido en
sificándolo y haciéndolo coherente. Fue inventado por línea, cortes aislados, reconstrucción tridimensional (3-D)
Arthur L. Schawlow y Charles H. Towens y publicado en y estéreo de imágenes. Las imágenes obtenidas con este
la revista Physical Review en 1958. La estimulación de la sistema pueden ser editadas desde la pantalla y almacena-
radiación es producida por un cristal de rubí o por la pre- das o impresas. Las unidades de memoria sirven para
sencia de gases como el argón. Este láser barre en x, mien- almacenar muchas imágenes en unidades de disco extraí-
tras que la muestra es movida en eje z —al final de su bles. Recientemente el sistema de “deconvolución digital”
trayectoria el detector y su fotomultiplicador con apertura capta imágenes desde un microscopio convencional de
especial—, un objetivo de gran apertura numérica y un fluorescencia y de manera digital elimina el desenfoque.
espejo dicroico.
El rayo láser incide sobre la muestra por una pequeña
apertura y es enfocado sobre el plano de la imagen del Después de la muerte de Carl Zeiss, su
objetivo, así la luz reflejada regresa al mismo punto pero entrañable amigo Ernst Abbe estableció
reenfocada y transmitida por una apertura muy pequeña en 1889 la fundación Carl Zeiss y dos años
sin pérdida de señal, de manera que la luz colateral a los más tarde cedió los derechos que su amigo le había heredado
ejes principales dispersa es bloqueada por la apertura de las industrias Zeiss junto con los talleres óptico y de vidrio
principal y la imagen es de gran definición. Tanto la aper- Schott a los trabajadores, dejándolos como únicos propieta-
tura de iluminación como la de retorno tienen un foco rios desde 1891 y hasta la fecha.
común (figura 1-9).
Las aplicaciones del microscopio confocal láser son
muy diversas en la biología celular, pues permiten analizar Microscopía electrónica
microtúbulos, mitocondrias, DNA, actina, retículo endo-
plásmico, membrana celular, marcadores inmunológicos,
Introducción
cultivos celulares, biopsias, etc. Todas las ventajas que la Desde su aparición, el microscopio electrónico ha contri-
microscopía confocal ofrece son respaldadas por sofistica- buido de manera sustancial al conocimiento de la ultra-
dos equipos de cómputo y software capaces de integrar estructura celular y tisular, ha permitido describir la orga-
imágenes y presentarlas en tercera dimensión en forma nización celular y los organelos, así como su relación entre
dinámica, así como almacenarlas y procesarlas con exce- ellos, tanto en vegetales como en animales. También ha
lente resolución. Algunas de las técnicas más utilizadas contribuido de manera significativa a encontrar respues-

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 Capítulo 1 ■ Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular 9

tas a interrogantes fundamentales relacionadas con la segunda mitad del siglo xix se innovaron y desarrollaron
estructura celular normal y patológica. técnicas de preparación de muestras para ser analizadas
En 1924, Prince Pierre Raymond Louis-Victor de Bro- con el instrumento recién comercializado. Investigadores
glie (1892-1987) propuso que cuando los electrones eran de distintas áreas aplicativas contribuyeron con muchas y
sometidos a campos magnéticos, éstos modificaban su diferentes técnicas, entre ellos están los nombres de Albert
trayectoria. En 1926, H. Busch descubrió que los electro- Claude, Don Fawcett, Earnes Fullam, Andrey Glauert,
nes liberados de un átomo pueden describir trayectorias al Hugh Huxley, Bob Horne, Charles Leblon, John Luft,
igual que el comportamiento ondulatorio de la luz, con la George Palade, Daniel Pease y Fritjof Sjöstrand. En 1974,
condición de hacerlos viajar en un ambiente sometido al Palade y Claude recibieron el Premio Nobel de Medicina
vacío; de esta manera alcanzan una longitud de onda de por sus contribuciones con microscopía electrónica a la
0.004 nm, reduciendo en unas 100 000 veces el valor de la Biología celular. En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel
longitud de onda de los fotones. En 1931, Ernst Ruska y de Física en reconocimiento a su importante contribu-
Max Knoll plasmaron todos esos conocimientos y cons- ción.
truyeron el primer microscopio electrónico de transmi- Algunas ciencias que se han visto beneficiadas con las
sión (figura 1-10). Con este desarrollo tecnológico se abrió aplicaciones del microscopio electrónico son Anatomía,
la puerta a un mundo inaccesible hasta entonces; así, se Bioquímica, Microbiología, Patología, Fisiología, Toxico-
inició una nueva era en el conocimiento. Los detalles de la logía, Virología, Biología estructural y Biología celular,
Naturaleza a nivel de estructuras subcelulares serían vis- entre otras. En particular, los anatomistas, los biólogos
tos y cuestionados por cientos de investigadores en todo el celulares y los patólogos son los investigadores más ligados
mundo, muchos biólogos celulares hasta entonces supo- al uso del microscopio electrónico. El constante perfeccio-
nían que la célula era una bolsa llena de enzimas con un namiento de este instrumento lo ha llevado a resoluciones
protoplasma desprovisto de estructura interna. En la nanométricas, con amplificaciones hasta de un millón de
veces. En un inicio se desarrollaron dos tipos básicos
de microscopios electrónicos: microscopio electrónico de
transmisión (TEM) y microscopio electrónico de barrido
(SEM), con grandes variantes y múltiples aplicaciones en
un mismo equipo (figura 1-11). En cuanto al primer SEM

Figura 1-11. Fotomontaje de las primeras electronmicrografías.

Figura 1-10. Esquema del prototipo de columna electrón-óptica Es un fibroblasto de embrión de pollo en un cultivo de tejidos,
para la formación de imagen en el microscopio electrónico realiza- tomada por Albert Claude, George Palade y Ernest F. Fullam en 1945,
do por Ernst Ruska en marzo de 1931. Fuente: Ruska (1986). con un microscopio de transmisión RCA modelo EMB a 50 kV.

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10 Histología y biología celular

fue construido por von Ardenne en Alemania, y el primero de lentes electromagnéticas y, según su función, se clasifi-
fabricado de manera comercial data de 1963. can en condensadoras, objetivas y proyectoras, además de
algunas bobinas correctoras de astigmatismo. Entre la
Microscopio electrónico de transmisión (TEM) última lente condensadora y la proyectora está la platina
El TEM está conformado por sistemas básicos para su encargada de dar movimiento a la rejilla en la que se colo-
funcionamiento. La columna electrónica es el elemento ca la muestra; otro elemento importante son las aperturas
principal, en ella se aloja el cilindro de Wehnelt (CW) o colocadas en diferentes regiones de la columna y que se
cañón de electrones, lentes electromagnéticas, lentes encargan de optimizar el haz de electrones y de incremen-
correctoras de astigmatismo, aperturas y una platina tar el contraste.
(figura 1-12). Además de un sistema de enfriamiento de La eficiencia del sistema de vacío determina de mane-
las lentes. En lo más alto de la columna está el CW, en su ra importante la calidad de las imágenes. La presencia de
interior se localiza el filamento (por lo general de tungste- cualquier molécula gas en la trayectoria de los electrones
no) que es alimentado por un voltaje de baja intensidad les impediría llegar al espécimen e interaccionar con éste,
para calentarlo; de forma independiente, el CW recibe una bloqueando la posibilidad de generar imágenes, por lo que
corriente negativa de alta tensión, lo que establece la columna del microscopio electrónico debe estar some-
una diferencia de potencial eléctrico entre éste y el ánodo, tida a presión negativa por un eficiente sistema de vacío.
proyectados al vacío por el voltaje de aceleración desde el Este sistema se activa en dos etapas, la primera es el preva-
filamento, alcanzando unos 150 000 km/s a 80 kW. La con- cío y la segunda es el alto vacío. En el primer caso, una o
ducta de los electrones por efecto del voltaje de acelera- dos bombas mecánicas evacuan grandes volúmenes de
ción y de su carga hacen que este sistema funcione como gas y sirven de apoyo permanente a las bombas de la
una lente electrostática, formándose un primer foco o segunda etapa, que son bombas de alta eficiencia y actúan
crossover en las inmediaciones del ánodo. Hay tres tipos evacuando gases a nivel molecular.

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

El SEM o scanning posee dos grandes ventajas sobre otros
sistemas ópticos, su gran profundidad de campo y el efec-
to de tercera dimensión (figura 1-13). Es ampliamente uti-
lizado en el estudio de la morfología, la topografía, en
análisis elemental y en la cristalografía.
El microscopio de barrido cuenta con una columna
electrónica más pequeña que la del TEM, el sistema de
lentes crea y modula el haz de electrones y, a diferencia del
TEM, carece de lente proyectora; otra diferencia esencial
es la presencia de una cámara para el espécimen que,
como su nombre lo indica, lo aloja además de los detecto-
res. Se trata de un sistema de lentes colimadoras que
gobiernan la rapidez del barrido y su desplazamiento
sobre la muestra. La superficie es rastreada en forma lineal
por el spot del haz desde un sitio en la esquina superior
izquierda y hasta el final de esa misma línea; este ciclo se
repite en la línea inmediata inferior y así en lo sucesivo
hasta cubrir toda el área observada. El recorrido completo
puede durar desde fracciones de segundo hasta varios
segundos, lo cual significa que el haz se desplaza sobre la
muestra durante la observación, recorriendo punto a pun-
to la superficie y recolectando información en un sistema
de coordenadas (x, y) y además en posición z. Toda la
información es integrada y mostrada en la pantalla del
equipo como una imagen.
La aceleración de voltaje en el SEM va desde unos
500 eV hasta 30 kV. La naturaleza del espécimen determi-
Figura 1-12. Microscopio electrónico de transmisión, marca nará la elección de la diferencia de potencial utilizada para
Zeiss, modelo EM10C a 100 kV. Instalado en el Departamento de su análisis. La materia orgánica está compuesta de ele-
Biología celular y tisular. Facultad de Medicina, Universidad Nacio- mentos ligeros, por lo que es muy lábil cuando se expone
nal Autónoma de México. al haz de electrones sin el tratamiento adecuado.

[Link]
 Capítulo 1 ■ Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular 11

Cátodo
Electrones
Electrones Haz de electrones
secundarios
Auger (SE)
Ánodo
Electrones
retrodispersos
Rayos X (R-X) (BSE)

C1

Espécimen

Figura 1-14. Esquema de la interacción del haz de electrones

C2
con el espécimen. SE, BSE y Auger son electrones producidos por la
interacción con el espécimen. R-X son rayos X.

pasado para revelar la arquitectura celular y aclarar meca-

nismos y procesos fisiológicos como la síntesis de proteí-
AP nas, reconocimiento de sitios antigénicos por anticuerpos,
así como la estructura macromolecular.
El microscopio electrónico también puede ser un ins-
trumento analítico cuando se usa para identificar o carac-
OBJ terizar la naturaleza química de los componentes nativos
o agregados a tejidos en sitios específicos de la estructura
celular.
Cuando una muestra biológica es bombardeada por el
haz de electrones, se generan dos tipos de señales, una for-
Espécimen
mada por electrones y otra por energía producida por la
interacción con la muestra. Esta energía puede ser utiliza-
Figura 1-13. Esquema de un microscopio electrónico de barrido da tanto en modo TEM (figura 1-15, A), SEM (figura 1-15,
(SEM). Representación esquemática de la trayectoria del haz de elec- B) o de barrido en transcripción.
trones en la columna del SEM.
Cuando el haz de electrones impacta un espécimen se
genera la emisión de rayos X (figura 1-16), la cantidad de
emisión depende de la composición de la muestra; para
Cuando el haz de electrones se impacta en la prepara- determinar la composición química del material expuesto,
ción, causa una zona de múltiples colisiones conocida los termoelectrones altamente energizados emiten un
como “volumen de interacción” y se disipa la energía ciné- patrón de rayos X, con dos variantes, como rayos X carac-
tica adquirida en su trayectoria, con lo que se producen terísticos o bien como catodoluminiscencia (CL). Ambas
diferentes señales potencialmente detectables. Las princi- formas de rayos X pueden ser detectadas por sondas espe-
pales son tres tipos de electrones: Auger, electrones secun- ciales, las cuales pueden ser de dos tipos: espectroscopía
darios (SE) y electrones retrodispersos (BSE); además de por difracción de rayos X (EDS) y por longitud de onda
energía en forma de rayos X (figura 1-14). Con estas seña- (WDS); éste es el principio del microanálisis.
les es posible recuperar varios tipos de información en el Ambos tipos de detectores se usan como un impor-
SEM: topograf ía, textura, composición química y estruc- tante recurso en la investigación biomédica y de materiales.
tura cristalina. Los SE generan imágenes de gran defini- Su mérito reside en que usan fragmentos muy pequeños
ción con un juego de contraste y brillo en tercera dimensión. de muestra que bien podrían provenir de pequeños volú-
menes de biopsias. Los rayos X son emitidos desde la
Aplicaciones especiales región más profunda de la zona de interacción, en donde
en la microscopía electrónica se lleva a cabo la mayor cantidad de colisiones elásticas e
inelásticas. Se generan cuando el espacio dejado por un
Microanálisis electrón en su orbital es ocupado por otro electrón de un
Las técnicas de localización como la autorradiografía, orbital más externo y de mayor energía y se libera el exce-
citoquímica e inmunocitoquímica fueron utilizadas en el so de energía, que es emitida en forma de ondas electro-

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12 Histología y biología celular

A B

Figura 1-15. A) Electromicrografía de transmisión que muestra la ultraestructura de miocardio, sarcómeras, miofibrillas, mitocondrias,
glucógeno; barra = 1 μm. B) Micrografía electrónica de barrido, obtenida por electrones secundarios (SE). Se observa el núcleo, miofibrillas y
sus sarcómeras y mitocondrias cerca del núcleo. Barra = 2 μm.

magnéticas. Los datos generados con los detectores de disco, fabricado a base de sílice y litio. En el pasado, todos
EDS y WDS son analizados por el software de la compu- los semiconductores para microanálisis debían ser enfria-
tadora que traduce en datos presentados de dos formas, dos por nitrógeno líquido a fin de mejorar su resolución y
como “análisis puntual” de un sitio de interés o bien como disminuir el ruido. Hoy en día este tipo de detectores han
un “mapeo”; en ambos casos se revelan cuáles son los ele- caído en desuso y han sido sustituidos por una nueva
mentos químicos analizados. Esta técnica es conocida generación de detectores que no requieren ser enfriados y
como microanálisis, mismo que puede ser cualitativo o tienen una gran resolución, lo cual permite realizar análi-
cuantitativo. Espectroscopía por energía dispersiva de sis cualitativos en periodos cortos. La señal que capta el
rayos X (EDS). detector es transmitida a un amplificador y luego a un
analizador, el cual genera una gráfica en un monitor, que
Espectroscopía por difracción de rayos X (EDS) muestra picos a diferentes alturas, los cuales indican la
Este tipo de detectores por lo común se utiliza en estudios presencia relativa de los elementos en mayor abundancia
biológicos. El sensor es un semiconductor en forma de (figura 1-17).

Rayos X
Electrones

E2

E1

Figura 1-16. Electrones energéticamente cargados dislocan electrones de orbitales de baja energía E1. Subsecuentemente, un electrón de
un nivel energético mayor llena el locus vacante, perdiendo energía en este proceso.

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 Capítulo 1 ■ Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular 13

además de producir imágenes contrastadas en los modos

V = 8 192 H = 10 KEV 3:3 Q AQ = 10 KEV 3Q
TEM y STEM, aunque no es tan común como EDS y WDS.

Criotécnicas
Desde los inicios de la microscopía electrónica, uno de los
objetivos más importantes ha sido preservar en tejidos y
células la estructura de todos sus componentes en su esta-
do nativo. El acelerado desarrollo de la digitalización y de
la tecnología ha promovido el interés por los métodos
de criopreservación; la incorporación de platinas frías e
inclinables ha hecho posible la reconstrucción tomográfi-
ca de muestras biológicas muy delgadas con resolución
AL S K superior a los 3 nm.
La criofijación aporta dos ventajas sustanciales, la alta
CA
velocidad de fijación y la estabilización simultánea de
componentes celulares. Cabe realizar a baja temperatura
< 0.00 KEV XES 10.24 KEV> por medio de “freeze sustitution” una fijación química y a
continuación la deshidratación para evitar daño en los
Figura 1-17. Gráfica de un análisis elemental por EDS de rayos X componentes celulares y así llevar el proceso hasta su
característicos, los picos muestran la proporción de elementos pre- inclusión a baja temperatura para estudios de inmunolo-
sentes en el espécimen analizado. calización.
Los especímenes deben alcanzar un estado de vitrifi-
cación para inhibir la formación de cristales que dañen el
Espectroscopía dispersiva por longitud tejido. El nitrógeno y el etano en fase líquida son excelen-
de onda (WDS) tes criofijadores. Los métodos más comunes de criofija-
ción son: plunge-freezing (congelamiento por inmersión),
En este sistema de microanálisis el detector capta la ener-
propane jet freezing (congelamiento con propano a cho-
gía de rayos X, los cuales son emitidos desde el espécimen
rro), cold metal block freezing (congelamiento en bloque
que son dispersados por un cristal que los difracta y envía
en metal frío) y high pressure freezing (congelamiento a
al detector; este último, a su vez, recibe longitudes de onda
alta presión). Este último es el más eficiente, ahí la veloci-
y las separa por el principio de la ley de Bragg, por lo que
dad de fijación es del orden de 10 000°C/s en un ambiente
cada elemento es identificado de manera individual, ya
de presión de 2 100 bar. En estas condiciones los pocos
que tiene una longitud de onda específica. La WDS se uti-
cristales de hielo que se forman miden entre 10 y 20 nm,
liza con baja frecuencia en estudios biológicos ya que la
ya que los crioprotectores inhiben su formación.
exposición del espécimen a este estudio requiere de perio-
dos de exposición más largos que lo pueden dañar, aunque
tiene mayor sensibilidad que la EDS. Crioelectronmicroscopía
La crioelectrónica alude al proceso en el cual los especí-
Espectroscopía por pérdida de energía menes para microscopía electrónica son procesados de
de electrones (EELS) principio a fin a muy bajas temperaturas, incluso durante
la observación. Los microscopios electrónicos tienen
Tanto las EDS como las WDS analizan el espectro de ener- incorporados sistemas de enfriamiento como platinas
gía de electrones para determinar la composición elemen- frías que conservan al espécimen congelado durante su
tal de un espécimen. La técnica de espectroscopía por estudio. La criofijación, la criosustitución, la crioultrami-
pérdida de energía de electrones (EELS) es utilizada para crotomía, la técnica de crioSEM y la fractura en congela-
detectar, por transmisión, diferencias de energía entre ción son los principales procedimientos involucrados en
electrones que han sido transmitidos a través de un corte; la crioelectrónica.
tales diferencias son determinadas por un espectrómetro
electromagnético. Este mismo principio puede ser utiliza-
do como filtro de energía para incrementar el contraste y
CrioTEM
mejorar la resolución en imágenes de material biológico. La crioultramicrotomía es una técnica de corte a bajas
Los átomos de metales pesados ligados a tejidos o células temperaturas en un crioultramicrótomo. La inmunoquí-
en condiciones experimentales o patológicas pueden ser mica, la inmunohistoquímica, el análisis elemental, la
revelados por esta técnica. Mediante EELS es factible morfología y la microscopía inmunoelectrónica son algu-
determinar y cuantificar la presencia de elementos ligeros, nas de las técnicas más beneficiadas por los cortes prove-

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14 Histología y biología celular

nientes de la crioultramicrotomía. La técnica de Tokuyasu con carbón el cual, a su vez, sirve de base a una capa de
es la más utilizada; en ella los cortes se realizan con una platino evaporado. El material orgánico es digerido des-
navaja de diamante, en tanto que se conserva la tempera- pués. La réplica formada es montada sobre una rejilla de
tura entre los –80 y –100°C. El ultramicrótomo es acondi- cobre y se analiza con el TEM. Por ese método se han loca-
cionado con un sistema de control de baja temperatura a lizado e inmunolocalizado una gran cantidad de proteínas
base de nitrógeno líquido. asociadas con la membrana celular, así como a los organe-
los. La ultraestructura de los poros nucleares ha sido estu-
CrioSEM diada de manera profunda utilizando este método.
Los especímenes biológicos contienen en su estructura
hasta 98% de agua, lo cual representa un especial proble-
ma para analizarlos por medio del SEM. Considerando
que los especímenes han sido estabilizados por la criofija- Ernst Ruska y Max Knoll construyeron el
ción y deshidratados por la criosustitución —con la ayuda primer microscopio electrónico de trans-
de platinas frías al vacío—, las muestras se transfieren a la misión en 1931 y que hasta 1986 le otor-
platina fría, donde han de ser sombreadas con carbón y garon a Ruska el Premio Nobel en Física por su invención; el
ionizadas con oro. Por último, se les incorpora al interior premio fue compartido con los dos inventores del microsco-
del microscopio electrónico de barrido para ser analiza- pio de tunelaje, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.
das.
Son varios los equipos en donde se pueden analizar
estas muestras, tanto en “alta presión”, como en LV, VP y
en ESEM. Las ciencias en donde es factible aplicar esta
Bibliografía
técnica son múltiples (Botánica, Micología, Zoología, Bio-
tecnología, Biomedicina y Agricultura, entre otras).
Bozzola JE. Electron Microscopy: Principles and Techniques for
Criofractura Biologists. John J. Bozzola, Lonnie D. Russel. Second Edition.
Jones and Bartlett. Publishers. USA. p. 670; 1999.
La criofractura es una técnica de preparación de tejidos Gest H. Discovery of microorganisms. En: Robert H, Leeuwenhoek
para microscopía electrónica congelados a muy baja tem- AV. Notes Rec. R. Soc. Lond.; 58(2):187-201; 2004.
Hayat, MA. Fixation for electron microscopy. Academic Press,
peratura, a alta velocidad y a alta presión. Russell Steere
Nueva York; 501, 1981.
introdujo el método de criofractura (freeze-fracture) a la Malacara D. Óptica básica. 2a. ed. Fondo de Cultura Económica.
microscopía electrónica en 1957. Al principio congelaban México. Colección: Sección de Obras de Ciencia y Tecnología.
muestras biológicas combinando los diferentes métodos 2004.
conocidos; la propuesta original estuvo bien encaminada Meek GA. Practical electron microscopy for biologist. 2nd. Ed. Edi-
tors John Wiley & Sons. UK. 1981.
a resolver incógnitas de la estructura de las membranas
Postek MT, Howard KS, Johnson A, Mc Michael KL. Scanning
celulares; después siguieron los trabajos de Moore en 1961 Electron Microscopy: a Student Handbook. Ed. Postek MT Jr.
y de Mühlethaler en 1963, y en 1966, Branton reporta que and Ladd Research Industries, Inc. 1980.
la membrana celular estaba formada por una bicapa que se Ruska E. The development of the electron microscope and of elec-
puede separar por su espacio intermedio en una mitad tron microscopy. Nobel Lecture, December 8, 1986.
Severs, NJ. Freeze-Fracture Cytochemistry: Review of Methods. J.
interna y otra mitad externa. El método se inicia con una
Electr Microsc Tech. 13:175-203; 1989.
rápida infiltración de un crioprotector, como la glicerina o Tipler PA, Mosca GG. Física para la ciencia y la tecnología. Luz.
el dimetilsulfóxido (DMSO), a lo que sigue la congelación Vol. 2B 5a. ed. Barcelona, España. Editorial Reverté, S. A. 2003.
a alta velocidad y presión; en seguida se fractura la mues- Yacamán MJ, Reyes J. Microscopía electrónica: una visión del
tra para producir un plano de fractura a través del espéci- microcosmos. México. Fondo de Cultura Económica; 1998.
Yount L, Leeuwenhoek AV. First to see Microscopic Life. Enslow
men, el espécimen fracturado y congelado es colocado en
Publisher, Inc. 1996.
un sistema de alto vacío que a continuación se sombrea

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