AISLAMIENTO DE Listeria monocytogenes A PARTIR DE ALIMENTOS
1. OBJETIVOS
- Identificar el protocolo de aislamiento tradicional de Listeria monocytogenes a partir de muestras de
alimentos.
- Caracterizar bioquímicamente cepas de Listeria monocytogenes mediante técnicas convencionales.
2. PROCEDIMIENTO:
2.1. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO:
Protocolo Aislamiento Tradicional de Listeria monocytogenes:
- Pesar 25 g de la muestra y depositarlos en 225 mL de Caldo Fraser a media concentración incubando
a 30°C/18-24 horas.
- Inocular 0,1 mL del pre-enriquecimiento anterior en 10 mL de caldo Fraser a concentración normal.
Incubar a 30ºC por 24 horas.
- Transferir una asada sobre la superficie del agar Palcam e incubar a 37 °C / 24-48 horas. Observar la
presencia de colonias presuntivas. Las colonias típicas son de 2 mm de diámetro, gris-verdosas y
rodeadas de un halo negro que contrasta con el color rojo del medio.
- Transferir las colonias típicas sobre agar nutritivo, incubando a 37°C/24 horas. Realizar las pruebas de
tinción de Gram, oxidasa y catalasa.
- Realizar las tres pruebas anteriores, además, con la cepa control positivo en Agar Nutritivo. Las cepas
aisladas que sean, bacilos Gram positivos no esprulados, catalasa positivas y oxidasa negativas serán
identificadas utilizando las siguientes pruebas bioquímicas:
2.2. IDENTIFICACIÓN BIOQUIMICA TRADICIONAL:
- Movilidad: Utilizando agar GI, incubando a 25ºC durante siete días, y haciendo lecturas diarias del
crecimiento en sombrilla, típico de la mayoría de las especies de Listeria.
- Fermentación de carbohidratos: Se emplearán soluciones de D-manitol, ramnosa, y xilosa,
esterilizadas por filtración y añadidas hasta una concentración del 1%, al Caldo Rojo de fenol. Tras la
inoculación de las cepas e incubación a 37ºC, se hará la lectura a las 24 y a las 48 horas. Las cepas
capaces de producir ácido a partir del carbohidrato respectivo virarán el color del indicador hacia
amarillo. Las distintas especies de Listeria, dan resultados variados frente a estas pruebas.
- Siembra en el medio TSI: Se utilizará el Agar Tres Azúcares Hierro, sembrando por picadura e
incubando a 37ºC por 24-48 horas. La mayoría de las cepas producen reacción ácida tanto en el fondo
como en el pico del tubo de ensayo sin producción de H2S.
- Prueba del rojo de metilo y Voges-Proskauer: Incubando a 37ºC por 24-48 horas. La mayoría de las
cepas de Listeria son rojo de metilo y Voges-Proskauer positivas.
- Producción de -hemólisis: Se estudiará la actividad -hemolítica en placas de Agar Base Columbia
suplementado con sangre de oveja al 5%, incubando a 37°C por 24-48 horas. Se considerarán
positivas aquellas cepas que presenten un halo de aclaramiento alrededor de la zona de siembra,
como resultado de la lisis total de los eritrocitos presentes en el medio. Se obtienen reacciones variadas
para las especies de Listeria.
