PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Distintos estudios metabólicos aplicados a microorganismos
viables, que en un medio de cultivo determinado generan
una reacción.
• A partir de dicha reacción se identifican los microorganismos
evaluados, alcanzando algunas veces género y en otras
género y especie.
• Permiten conocer las actividades metabólicas y enzimáticas
de los microorganismos
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Objetivos
• Fundamento
• Medio de cultivo
• Inóculo
• Condiciones de siembra
• Condiciones de incubación
• Revelado de la prueba
• Resultados
• Interpretación
PRUEBAS BIOQUÍMICAS BASADAS EN
PROCESOS METABÓLICOS
Oxidación-Fermentación
Interpretación
Objetivo
Permite determinar el metabolismo oxidativo o
fermentativo de un mo sobre un azúcar.
Fundamento
En la vía oxidativa el aceptor final de electrones
debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso es
aerobio y produce poca acidez
En la vía fermentativa el aceptor final de electrones
es un compuesto orgánico y el proceso es
anaerobio, originando mucha acidez en poco tiempo.
Medio Composición g/l
Medio semisólido de
Hugh-Leifson al que se le
añade glucosa al 1%
Relación
azúcar:peptona 5:1 Siembra
Ansa recta. Tubo abierto vs Tubo sellado con vaselina.
Incubar 24-48 h a 37°C
Metabolismo fermentativo
Metabolismo oxidativo
Metabolismo oxidativo de Pseudomonas
Oxidación Directa Glucosa Oxidación y Fosforilación
Deshidrogenasa
Kinasa-ATP
Gluconato
Glucosa-6P
2-ceto-Gluconato
Kinasa-ATP
2-ceto-6P-Gluconato Deshidrogenasa-NAD
Deshidrogenasa-NADH
6P-Gluconato
Fermentación de Hidratos de Carbono
Objetivo Siembra
Determinar la capacidad de un mo de fermentar un Ansa en anillo. Incubar 24 h a 37°C
determinado H de Carbono
Fundamento Interpretación
Durante la fermentación del H de C se producen Positivo: acidificación con viraje del indicador de
productos ácidos con o sin liberación de gas que pH, y producción de gas visibles como una burbuja
reducen el pH del medio lo cual es detectado por un en la campanita
indicador de pH.
Medio
Medio base al
que se añade el
azúcar filtrado al
1% + campanita
de Durham
Triple Azúcar Hierro-TSI
Objetivo Siembra
Determinar la capacidad de un mo de fermentar glucosa, Ansa de punta por picadura hasta el fondo. Retirar
sacarosa y/o lactosa, con producción de gas y de ácido ansa por mismo camino de entrada y sembrar en
sulfhídrico. estría la superficie del pico de flauta. Incubar a
37° C durante veinticuatro horas. Lectura a 18 y
Fundamento 24 horas
Interpretación
La degradación del azúcar con formación de productos
ácidos se manifiesta por un cambio de color del indicador Pico flauta/Profundidad alcalino (K), ácido (A):
(rojo de fenol) que vira del naranja al amarillo o al rojo en
K/A, con o sin gas: Fermenta glucosa
caso de alcalinización. La producción de gas se evidencia A/A, con o sin gas: fermenta glu, lac, (sacarosa).
por agrietamiento o levantamiento del medio. El tiosulfato K/K, o sin cambio: no fermentan glu ni lactosa
es reducido a SH2 que reacciona con la sal férrica (sacarosa)
produciendo S3Fe2 color negro.
Medio
Medio sólido TSI
Relación glu:lac:sac
=[Link].
Realción azúcar
:peptona 1:1
El medio se envasa de forma tal que la zona
inferior sea recta y la superior en pico de flauta.
Pico de flauta (mayor concentración O2) : monosacáridos glucólisis piruvato
Ciclo Krebs CO2, H20 y ATP.
Zona recta (menor concentración O2): monosacáridos glucólisis piruvato
fermentación ácidos orgánicos, CO2, H20 y ATP
Producción de SH2 (color negro): la bacteria ha realizado una respiración anaerobia
utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte en SH2
que con el Fe3+ origina S3Fe2 sulfuro de hierro (III) (color negro)
Rojo de Metilo-Voges Proskauer
Reveladores
Objetivo
RM: Indicador de pH Rojo de metilo
Determinar la capacidad de un mo de producir pH < 4 Rojo. Añadir 3 o 4 gotas sobre
compuestos ácidos estables o neutros a partir de la el medio.
fermentación de un H de C VP: α naftol + KOH/NaOH
Fundamento
Interpretación
Dos vias de fermentación
Fermentación Acido Mixta: Ácidos, CO2 y H2, de pH.
Fermentación Butanodiolica. Por descarboxilación de dos RM
moléculas de ácido pirúvico, conduce a la formación de
2, 3 butanodiol o acetoína productos neutros.
Medio
VP
Siembra
Ansa en anillo. Incubo 24-48 h a 37°C
Acetoína NaOH o KOH + O2 diacetilo.
diacetilo + compuestos guanidina* compuesto rojo-violáceo
Reducción de Nitratos
Reveladores e Interpretación
Objetivo
Determinar el tipo de metabolismo del nitrato N2: gas campana Durham
que realiza el mo NH3: Nessler (iodomercuriato de potasio) iones
amonio ioduro de dimercuriamonio
Fundamento
Positivo: precipitado color ladrillo
Asimilación: NO3- NH3 (fuente N)
Desasimilación: NO3- NO2 – NO2-: á[Link]ílico+NO2- sal diazonio + α-
último dimetilnaftilamina p sulfurobenceno azo α - naftilami
Desnitrificación: NO3- N, N2O
aceptor Positivo: color rojo en la superficie.
de e
Medio Presencia NO3- en el medio: Zn: NO3- Zn NO2-
Rojo indica NO3 en el Incoloro indica reducción del
medio reacción (-) NO3 en el medio reacción (+)
Se añade campanita de Durham
Siembra
Con ansa en anillo. Se incuba por 24h a 37°C
Utilización del citrato
Objetivo
Interpretación
Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar
el citrato como única fuente de C y energía.
Fundamento
El citrato puede ser metabolizado mediante la enzima citrato
oxalacetato liasa que lo desdobla en acetato y oxalacetato
(Ciclo reductivo de Krebs). Este ultimo es convertido luego en
piruvato, que proporciona asi materias primas para la
biosíntesis. El metabolismo del pvto produce carbonatos y
bicarbonatos que alcalinizan el medio
Medio
Siembra
Siembra por estría con ansa recta. Incubación 24
horas a 37 °C
PRUEBAS BIOQUÍMICAS BASADAS
EN LA DETECCIÓN DE ENZIMAS
Prueba de Lecitinasa
Objetivo Interpretación
Acción microorganismos sobre un fosfoglicérido Las colonias con actividad lecitinásica formarán un
(Lecitina o Fosfatidil colina) halo opaco a su alrededor.
Fundamento
La enzima lecitinasa hidroliza el Fosfolípido lecitina
Medio
Para la prueba se utilizan medios sólidos a los cuales se les
agrega yema de huevo (que contiene lecitina). Ejemplo
Agar Mossel (B. cereus) Agar Baird Parker (S. aureus)
Siembra
Mediante estrías con ansa en anillo. Incubar
24h a 37 °C
Prueba de Oxidasa
Interpretación
Objetivo
Determinar la presencia de la enzima citocromo c oxidasa
Fundamento
Esta enzima actúa, en presencia de oxigeno, activando la
oxidación del citocromo reducido" de la cadena
transportadora de electrones
Aparición de color violáceo en el disco
en forma inmediata prueba (+)
Reactivo
Se emplea tetra para fenilendiamina, impregnada en
discos de papel como sustrato artificial que es oxidado
por la citocromo C oxidasa
Preparar una suspensión densa del mo en SF en un
tubo y colocar el disco dentro / Colocar con un ansa
plástica parte de la colonia sobre el disco
Prueba de Catalasa
Interpretación
Objetivo
Verificar la presencia de la enzima catalasa; propia
de la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias Burbujeo (+)
facultativas
Fundamento
Reactivos
Peróxido de H al 3%. En un portaobjetos
suspender parte de una colonia en gotas en
agua oxigenada. También puede hacerse
directamente sobre el cultivo. No partir de
medios con sangre
Producción de Indol
Reactivos
Objetivo
Determinar la capacidad de un microorganismo Reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehído en
de degradar el aa Trp liberando el anillo de indol alcohol amilico y HCl.
Agregar al tubo desarrollado 5 gotas y agitar.
Fundamento
Interpretación
La aparición de color rojo en la capa alcohólica se
debe a la formación de un compuesto
de condensación entre el reactivo y el indol.
Medio
Siembra
Ansa en anillo. Cultivar 24 h a 37°C
Hemólisis
Objetivo Siembra
Determinar la presencia de factores de virulencia llamados
Estrías con ansa en anillo. Incubar 24 h a
citolisinas que son capaces de formar poros en la membrana
37°C
citoplasmatica de diferentes células eucarióticas
Interpretación
Fundamento
Los glóbulos rojos constituyen un sistema indicador
adecuado porque su lisis es evidente
Medio
Agar sangre. Agar base +5% de sangre de oveja
α hemólisis: destrucción parcial de los glóbulos rojos
acompañada por una coloración verdosa o parduzca.
b) β hemólisis: destrucción total de los glóbulos rojos
que se observa como una zona transparente
alrededor de la colonia.
c) γ ausencia de hemólisis: no hay cambios visibles.
Licuefacción de la gelatina
Objetivo Siembra
Determinar la capacidad de un microorganismo de Se siembra por punción. Luego se incuba a 37ºC
producir enzimas del tipo proteolítico (gelatinasas) durante 24hs a 48 hs. Antes de la lectura se debe
enfriar los tubos
Fundamento Interpretación
Las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, Observar la presencia de desarrollo y licuefacción
gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para comparando con un tubo control.
desdoblar las proteínas. La degradación del os
polipéptidos de la gelatina le hace perder las
propiedades de gelación.
Medio
Se envasa y esteriliza por tindalización.
Hidrólisis de Almidón
Objetivo Siembra
Esta prueba pone en evidencia la capacidad del Estrías con ansa en anillo. Incubar 24 h a 37°C
microorganismo del hidrolizar el almidón
presente en el medio de cultivo. Revelador
Fundamento Solución de Iodo-Idduro al 5% . Lugol . Bañar la
placa de cultivo con la solución de lugol
Los iones I3- se sitúan
dentro de la
macromolécula de Interpretación
almidón produciendo
un efecto óptico de El medio conteniendo almidón se teñirá de azul,
color azul -púrpura contrastando con el halo incoloro que se
observa alrededor de la estría del cultivo capaz de
hidrolizar el almidón
Medio
Hidrólisis del DNA
Objetivo Siembra
Permite demostrar la presencia de la enzima DNAsa Se siembra en la superficie del medio de cultivo, con
ansa en anillo en forma puntual (spot) sobre la placa.
Se incuba 24 h a 37°C
Fundamento
Revelador
La DNAasa hidroliza las hebras del ADN Se revela cubriendo la placa con una solución de HCl
rompiendo los enlaces fosfodiéster 1N. El HCl provocará la precipitación del DNA intacto.
Medio
Interpretación
Ensayo positivo: se observa una zona clara
alrededor del spot que contrasta con la turbidez.
El medio se puede modificar agregando azul de
toluidina o verde de metilo . El colorante se une
al DNA polimerizado. Permite detectar la
actividad de DNasa mediante la transparencia del
colorante alrededor de las colonias productoras
de DNasa.
Coagulasa
Objetivo Siembra e Interpretación
Detectar la presencia de la enzima coagulasa Prueba rápida en portaobjetos: se prepara una
suspensión bien homogénea del microorganismo
Fundamento sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma
de conejo. Si se observan grumos la pba es (+)
La coagulasa es capaz de activar específicamente la
cascada de coagulación por activación conformacional Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de
(no proteolítica) de la protrombina. Este proceso plasma y una ansada cargada de la bacteria. Rotar
desencadena la conversión de fibrinógeno en fibrina lo suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35ºC 2-4
cual da lugar a la coagulación aún en presencia de horas y observar cada 30 minutos.
anticoagulantes como el citrato o el oxalato PRECAUCIÓN: no sacudir el tubo durante la
observación, inclínelo suavemente para ver el
coágulo. Si este no es visible al final de las 3 horas,
Medio déjelo en la estufa por 24 hs. Prueba positiva coágulo
Plasma de conejo parcial o completo
Ureasa
Objetivo Siembra
Determinar la capacidad de un organismo para Siembra con ansa en anillo Incubación 35-37 ºC, en
desdoblar la urea, en amoníaco y CO2, por acción de aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y
la ureasa. 48 horas de incubación. Para aquellos
microorganismos que hidrolizan lentamente la urea,
incubar hasta 72 horas. -
Interpretación
Viraje del indicador a Rojo-rosado (+)
Fundamento
La producción de amoníaco alcaliniza el medio
que es detectado por un indicador de pH
Medio
Caldo de Stuart
Es un medio con alta capacidad buffer y
pobre en nutrientes.
Sistemas multipruebas miniaturizados Sistemas Automatizados
API
MicroScan
Paneles realizan a
la vez la ID y el
ATBgrama
TSI sin sembrar
TRIVIA
Coagulasa
Citrato
Indol
TSI ácido/ácido
DNAsa
