Electroforesis

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga
un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse
cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la
relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa
más rápida será la migración. Es decir, la velocidad de migración electroforética depende
de la densidad de la carga de la molécula (relación carga/masa), del voltaje aplicado y de
la porosidad del gel de electroforesis. Por lo tanto, la velocidad de migración (v) de la
partícula es directamente Proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente
de potencial eléctrico (E) e Inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a
la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio (v = q E / f) El
voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor.
En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación, por causa de la
difusión por un tiempo muy prolongado de corrida electroforética.
METODOLOGIA 1) Preparación del gel Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la
bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar
TEMED (N,N,N,N'- tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S2O8-) que
se añade en forma de persulfato amónico. Las soluciones de acrilamida se desgasifican
pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además, durante la polimerización se
libera calor que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel. La velocidad
de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y
TEMED (iniciador). La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de
poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs.
acrilamida se use. El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de
separación del gel. Habitualmente los geles se denominan en función del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en
el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar
proteínas de gran tamaño. 2) Separación electroforética En función del estado de las
proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético éstas se clasifican
en electroforesis nativas o desnaturalizantes: 1) una electroforesis desnaturalizante, la más
común, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la completa
desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración
es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente
desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
2) Una electroforesis nativa es la que se somete a las proteínas a migración sin
desnaturalización. En esta situación las proteínas migran en función de su carga, de su
tamaño y de su forma.
Pueden realizarse estudios de funcionalidad de las proteínas separadas (actividad
enzimática, capacidad de unión de anticuerpos, unión a receptores, etc). Hay 2 formas de
realizarla:
1. -Gel con pH alto para que las proteínas adquieran carga neta negativa y se muevan en
dirección al ánodo.
 2. -Se siembra la disolución proteica en el centro del gel, así proteínas ácidas corren hacia
el ánodo y básicas hacia el cátodo.
Figura 1 La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando sistemas de
uno o más tampones, en estos casos se habla de sistemas tampón continuos o
discontinuos. En los sistemas discontinuos el primer tampón asegura la migración de todas
las proteínas en el frente de migración, provocándose la acumulación de todas las que se
han cargado en el pocillo. El buffer que contiene a la muestra y el del gel espaciador tiene
un pH dos unidades menor que el del reservorio inferior. El pH del buffer del reservorio
superior, que debe contener un acido débil (por lo general glicina, pKa2= 9,78) se ajusta a
un valor cercano al del reservorio inferior. La separación realmente comienza a partir del
momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón. En la
FIGURA 1 se muestran secuencialmente la situación en (a) al principio de la electroforesis,
(b) durante el proceso de apilamiento ('stacking') y (c) durante la separación en el gel
resolutivo. El primer gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de
acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel que es el que
realmente separa las proteínas. Este sistema es especialmente adecuado para analizar
muestras diluidas sin perder resolución.
SDS-PAGE Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE,
polyacrilamide gel electrophoresis), probablemente la más utilizada es la modalidad que se
lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para
analizar mezclas de proteínas, como para ser combinadas con técnicas de
inmunoelectrotransferencia. Gracias al SDS la mayoría de las proteínas adquieren una
relación carga/masa idéntica por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la
diferencia de peso, a la longitud de la cadena (tamaño) y la forma de la proteína. El SDS
desnaturaliza las proteínas, elimina sus estructuras secundarias y terciarias (sin alterar los
enlaces disulfuro) y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a
su masa. Esta técnica tiene gran utilidad ya que a través de la movilidad electroforética
relativa podemos determinar el peso molecular de las proteínas. En la práctica utilizamos
un patrón de peso molecular PM conocido y solo comparando las distancias recorridas
podemos calcular el peso molecular.
3) DETECCION Tras la electroforesis, el gel debe ser teñido (lo más habitual con
Coomassie blue o tinción argentea, permitiendo la visualización de proteínas separadas por
su procesamiento posterior). Tras la tinción las diferentes proteínas aparecerán como
bandas distintas en el gel. Es común correr marcadores moleculares de tamaño molecular
conocido en una calle aparte del gel para calibrarlo y determinar el peso de las proteínas
desconocidas comparando la distancia recorrida con la del marcador. Aun así se pueden
dar falsos positivos y negativos., un contaminante que migre conjuntamente puede aparecer
en la misma banda que la proteína deseada. Esta co-migración también puede hacer que
la proteína migre en una posición diferente o que no sea capaz de penetrar en el gel.