Proti 2

Método colorimétrico para la determinación de Proteínas

Totales y Albúmina en suero

SIGNIFICACION CLINICA INSTRUCCIONES PARA SU USO

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, Reactivos Provistos: listos para usar.
ampliamente distribuidos en el organismo y esenciales para
la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte PRECAUCIONES
y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
factores de coagulación, etc. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales
La proteína más abundante en plasma es la albúmina. Una de de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos.
sus funciones más importantes es la de permitir el transporte Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de
de ácidos grasos, hormonas esteroides, bilirrubina, cateco- acuerdo a la normativa local vigente.
laminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso. Reactivo A: corrosivo. H315 + H320: Provoca irritación
La concentración de albúmina en plasma influye notable- cutánea y ocular. P262: Evitar el contacto con los ojos, la piel
mente en el mantenimiento de la presión coloidosmótica, o la ropa. P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO
lo que estaría relacionado con su relativamente bajo peso CON LOS OJOS: Enjuagar cuidadosamente con agua durante
molecular y su gran carga neta. varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta
En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnu- fácil. Seguir enjuagando. P302 + P352: EN CASO DE CON-
trición, infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse TACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes.
hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección.
múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de
diversos orígenes, se observan hiperproteinemias. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
En general, ambas situaciones se ven acompañadas tam- ALMACENAMIENTO
bién por hipoalbuminemias. Los aumentos anormales de Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente
albúmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con (< 25ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
deshidratación que produce el consecuente aumento en el Standard: es estable a temperatura ambiente (no mayor de
contenido proteico del plasma. 25oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Una
vez abierto, debe conservarse en refrigerador.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Determinación de Proteínas Totales: INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión REACTIVOS
cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta Variaciones en el pH de los reactivos pueden ocasionar su
con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es pro- deterioro. Por este motivo se recomienda no intercambiar
porcional a la concentración de proteínas totales en la muestra. las tapas de los frascos.
Determinación de Albúmina: Cualquier variación en los caracteres organolépticos del
La albúmina reacciona específicamente -sin separación pre- Standard puede ser indicio de deterioro del mismo.
via- con la forma aniónica de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsul-
fon ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, MUESTRA
en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia Suero
a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es proporcional a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis.
a la cantidad de albúmina presente en la muestra. b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas:
REACTIVOS PROVISTOS - En la determinación de Proteínas Totales no se observa in-
A. Reactivo A: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido terferencia por bilirrubina hasta 100 mg/l, ni hemólisis ligera
de sodio 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP). y en ningún caso se presenta turbiedad por quilomicrones.
B. Reactivo B: solución de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon - En la determinación de Albúmina, no se observan interferen-
ftaleína (en polioxietilén lauril éter). cias por hemólisis moderada, bilirrubina hasta 200 mg/l ni lipe-
S. Standard (Suero Patrón): solución de albúmina y glo- mia hasta 20 g/l. Debido a que no interfieren las globulinas, en
bulinas de origen bovino, con título conocido de proteínas esta determinación no se requiere desproteinización previa.
y albúmina. Consultar los valores asignados en el rótulo, Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las
debido a que los mismos son lote específicos. drogas en el presente método.

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d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si no
se procesa inmediatamente el suero puede conservarse hasta B S D
3 días en refrigerador (2-10oC) o una semana en congelador. Standard - 10 ul -

MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Muestra - - 10 ul

- Espectrofotómetro o fotocolorímetro. Reactivo B 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
- Tubos o cubetas espectrofotométricas. Mezclar con varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28oC
- Baño de agua a 37oC (para Proteínas Totales). durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm
- Reloj o timer. o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando
a cero con el Blanco de Reactivo.
• DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES
CONDICIONES DE REACCION ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
- Longitud de onda: 540 nm en espectrofotómetro o en El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia
fotocolorímetro con filtro verde (520-560 nm). debe ser leída dentro de ese lapso.
- Temperatura de reacción: 37oC
- Tiempo de reacción: 15 minutos CALCULO DE LOS RESULTADOS
- Volumen de muestra: 50 ul Empleando el Standard tal como se indica en PROCEDI-
- Volumen de Reactivo A: 3,5 ml MIENTO, los cálculos se realizan como sigue:
- Volumen final de reacción: 3,55 ml
P.T. (g/dl)
Proteínas Totales (g/dl) = D x f f=
S
PROCEDIMIENTO
En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D Alb. (g/dl)
(Desconocido), colocar: Albúmina (g/dl) = D x f f=
S
B S D
Albúmina (g/dl)
Agua destilada 50 ul - - Relación A/G =
P.T. (g/dl) - Alb. (g/dl)
Standard - 50 ul -
Muestra - - 50 ul Curva de calibración
Para constatar que el colorímetro tenga una respuesta lineal
Reactivo A 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml en las longitudes de onda fijadas para las reacciones, puede
Mezclar con varilla. Incubar 15 minutos a 37 C. Leer en es-
o
prepararse una curva de calibración con cantidades cre-
pectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde cientes de Standard (ej.: 50 y 100 ul para Proteínas Totales;
(520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de Reactivo. 10 y 20 ul para Albúmina) con un volumen de reactivo de
3,5 ml en todos los casos. Si los valores obtenidos para el
segundo tubo se apartan más de un 5 % de los calculados
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL de acuerdo a la lectura del primero debe emplearse para
El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que los cálculos la curva de calibración.
la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
METODO DE CONTROL DE CALIDAD
• DETERMINACION DE ALBUMINA Procesar 2 niveles de un material de control de calidad
(Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas
CONDICIONES DE REACCION de proteínas totales y albúmina, con cada determinación.
- Longitud de onda: 625 nm en espectrofotómetro o en
fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm). VALORES DE REFERENCIA
- Temperatura de reacción: 15-28oC Se determinó el contenido de proteínas totales y albúmina en
- Tiempo de reacción: 10 minutos suero de personas sanas, de ambos sexos, con alimentación
- Volumen de muestra: 10 ul mixta normal y edades entre 17 y 40 años; obteniéndose
- Volumen de Reactivo B: 3,5 ml los siguientes rangos:
- Volumen final de reacción: 3,51 ml
Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dl
Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dl
PROCEDIMIENTO Relación A/G: 1,2 a 2,2
En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D
(Desconocido), colocar: Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios
valores de referencia.

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CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI BIBLIOGRAFIA
Proteínas totales (g/dl) x 10 = Proteínas totales (g/l) - Doumas, B.T.; Watson, W.A. & Biggs, H.G. - Clin. Chim.
Albúmina (g/dl) x 10 = Albúmina (g/l) Acta 31/1:87 (1971).
- Gasbarro, L.; Bandinelli R. & Tomassini, G. - Clin. Chim.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Acta 36:275 (1972).
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Pastewka, J. W. & Ness, A. T. - Clin. Chim. Acta 12:523
- Determinación de Proteínas Totales: (1965).
Puede usarse plasma como muestra, pero el resultado de - Peters, T. Jr. - Clin. Chem. 14:1147 (1968).
la proteinemia estará incrementado en 0,2 g/dl debido a la - Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
presencia de fibrinógeno, que no está considerado dentro C.F. - Bioq. del Atlántico VI/63: 1931 (1974).
de la definición de Proteínas Totales. - Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
- Determinación de Albúmina: C.F. - Bioq. Clin. VIII/4:241 (1974).
Mientras se realice la reacción entre 15 y 28oC puede - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
utilizarse factor para los cálculos. Fuera de este rango, AACC Press, 4th ed., 2001.
cambia la cinética de la reacción y no se completa el
desarrollo del color.
El sistema debe estandarizarse con el Standard provisto, ya
que los standards liofilizados y pools de sueros responden
de distinta forma.
En caso de utilizar un analizador automático se recomien-
da, para una mejor performance, el empleo de Albúmina
AA de Wiener lab.

PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas
muestras en distintos días se obtuvieron los siguientes
resultados:
Proteínas Totales
Nivel D.S. C.V.
4,6 g/dl ± 0,023 g/dl 0,49 %
5,8 g/dl ± 0,023 g/dl 0,40 %
7,0 g/dl ± 0,029 g/dl 0,41 %
Albúmina
Nivel D.S. C.V.
2,6 g/dl ± 0,079 g/dl 3,0 %
3,7 g/dl ± 0,071 g/dl 1,9 %
5,5 g/dl ± 0,070 g/dl 1,3 %
b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de
albúmina y globulinas a distintas muestras se obtuvo una
recuperación de 96 a 103% para Proteínas Totales y entre
98 y 100% para Albúmina.
c) Límite de detección: depende del fotómetro empleado
y de la longitud de onda. De acuerdo con la sensibilidad
requerida para un ∆A mínimo de 0,001, el menor cambio de
concentración detectable será de 0,02 g/dl para Proteínas
Totales y 0,01 g/dl para Albúmina.
d) Linealidad: la reacción es lineal hasta 12 g/dl para Pro-
teínas Totales y hasta 6 g/dl para Albúmina.

PRESENTACION
Equipo para 140 determinaciones de Proteínas Totales y
Albúmina con Standard (Cód. 1690001).
Wiener lab. provee separadamente:
Proti 2 Suero Patrón: frasco de 1,8 ml (Cód. 1690004).

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 Proti 2
Método colorimétrico para a determinação de Proteínas
Totais e Albumina em soro

SIGNIFICADO CLÍNICO INSTRUÇÕES DE USO

As proteínas são compostos orgânicos macromoleculares, Reagentes Fornecidos: pronto para uso.
amplamente distribuídos no organismo e essenciais para a
vida. Atuam como elementos estruturais e de transporte e PRECAUÇÕES
aparecendo como enzimas, hormônios, anticorpos, fatores Os reagentes são para uso diagnóstico "in vitro".
coagulantes, etc. Utilizar os reagentes observando as precauções habituais
A proteína que se encontra em maior quantidade é a albu- de trabalho no laboratório de análises clínicas.
mina. Uma de suas funções mais importantes é a de per- Todos os reagentes e as amostras devem ser descartadas
mitir o transporte de ácidos graxos, hormônios esteroides, conforme à regulação local vigente.
bilirrubina, catecolaminas, que em forma livre, são insolúvel Reagente A: corrosivo. H315+H320: Provoca irritação cutânea
em meio aquoso. e ocular. P262: Não pode entrar em contacto com os olhos,
A concentração de albumina em plasma influi nos níveis de a pele ou a roupa. P305 + P351 + P338: SE ENTRAR EM
pressão coloidosmótica, que estaria relacionado com o baixo CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente
peso molecular e sua grande carga líquida. com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto,
Em condições patológicas como a perda renal, desnutrição, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar. P302 +
infecções prolongadas, etc., apresentam-se as hipoprotei- P352: SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE: lavar com
nemias, não entanto, em outras como o mieloma multíplice, sabonete e água abundantes. P280: Usar luvas de protecção/
endocardite bacteriana e hemoconcentrações de diferentes vestuário de protecção/protecção ocular/protecção facial.
origens, observam-se as hiperproteinemias.
Em geral, nas duas situações podem-se observar, também, ESTABILIDADE E INSTRUÇÕES DE
as hipoalbuminemias. Os aumentos anormais de albumina ARMAZENAMENTO
são ocasionais e relacionam-se quase sempre com desi- Reagentes Fornecidos: são estáveis sob temperatura (< 25ºC)
dratação que produz como conseqüência o aumento no ambiente até a data do vencimento indicada na embalagem.
conteúdo protéico do plasma. Padrão: é estável sob temperatura ambiente (não superior
de 25oC) até a data do vencimento indicada na embalagem.
FUNDAMENTOS DO MÉTODO Uma vez utilizado deve ser conservado sob refrigeração.
Determinação de Proteínas Totais:
As ligações das proteínas reagem com o íon cúprico, em INDÍCIOS DE INSTABILIDADE OU DETERIORAÇÃO
meio alcalino, para se obter um complexo de cor lilás com DOS REAGENTES
máximo de absorbância a 540 nm, cuja intensidade é pro- Variáveis no pH dos reagentes podem ser causa de deterio-
porcional à concentração de proteínas totais na amostra. ração, por este motivo recomenda-se não trocar as tampas
Determinação de Albumina: dos frascos. Qualquer variável nos carateres orgão-lépticos
A albumina reage especificamente -sem previa separação- do Padrão pode ser indício de deterioração do mesmo.
com a forma aniônica da 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon
ftaleína (BCF), em presença de um excedente de corante, AMOSTRA
em meio tamponado a pH 3,8. O aumento de absorbância a Soro
625 nm em referência do Branco de reagente, é proporcional a) Coleta: deve se observar que o soro esteja livre de hemólise.
à quantidade de albumina presente na amostra. b) Aditivos: não são necessários.
c) Substâncias interferentes conhecidas:
REAGENTES FORNECIDOS - Na determinação de Proteínas Totais não observam-se interferên-
A. Reagente A: complexo EDTA/Cu 13 mmol/l em NaOH cias por bilirrubina até 100 mg/l, nem hemólise ligeira, não apre-
875 mmol/l e alquil aril poliéter (AAP). sentando-se turbidez em nenhum dos casos por quilomicrones.
B. Reagente B: solução de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon - Na determinação de Albumina, não observam-se interferên-
ftaleína (em polioxietilén lauril éter) cias por hemólise moderada, bilirrubina até 200 mg/l nem
S. Padrão: solução de albumina e globulinas de origem bo- lipemia até 20 g/l. Não é necessária a desproteinização antes
vino com título conhecido de proteínas e albumina. Consultar do ensaio posto que não tem interferência de globulinas.
os valores assinados no rótulo, devido a que os mesmos Referência bibliográfica de Young para efeitos de drogas
são lote específicos. neste método.

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d) Estabilidade e instruções de armazenamento: de não
B P D
ser processado rapidamente o soro pode ser conservado sob
refrigeração (2-10oC) até 3 dias ou uma semana congelado. Padrão - 10 ul -
Amostra - - 10 ul
MATERIAL NECESSÁRIO (não fornecido)
- Espectrofotômetro ou fotocolorímetro. Reagente B 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
- Micropipetas e pipetas para medir os volumes indicados. Misturar com uma vara. Manter os tubos entre 15-28oC
- Tubos ou cubetas espectrofotométricas. durante 10 minutos. Ler em espectrofotômetro a 625 nm ou
- Banho-maria a 37oC (para Proteínas Totais). em fotocolorímetro com filtro verde (620-650 nm) zerando
- Relógio ou timer. o aparelho com Branco de Reagente.

• DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS

ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL
CONDIÇÕES DE REAÇÃO A cor é estável 20 minutos devendo ler a absorbância dentro
- Comprimento de onda: 540 nm em espectrofotômetro ou deste período de tempo.
em fotocolorímetro com filtro verde (520-560 nm).
- Temperatura de reação: 37oC CÁLCULOS DOS RESULTADOS
- Tempo de reação: 15 minutos Utilizando o Padrão segundo é indicado no PROCEDIMEN-
- Volume de amostra: 50 ul TO, os cálculos devem ser realizados da seguinte maneira:
- Volume de Reagente A: 3,5 ml
- Volume final de reação: 3,55 ml P.T. (g/dl)
Proteínas Totais (g/dl) = D x f f=
P

PROCEDIMENTO Alb. (g/dl)

Albumina (g/dl) = D x f f=
Em três tubos marcados B (Branco), P (Padrão) e D P
(Desconhecido), colocar:
Albumina (g/dl)
B P D Relação A/G =
Água destilada 50 ul - - P.T. (g/dl) - Alb. (g/dl)

Padrão - 50 ul - Curva de calibração

Amostra - - 50 ul Para conferir o bom desempenho do aparelho linear nas
comprimentos de onda fixadas para as reações, pode-se pre-
Reagente A 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
parar uma curva de calibração com quantidades crescentes
Misturar com uma vara. Incubar 15 minutos a 37oC. Ler de Padrão (ex. 50 e 100 ul para Proteínas Totais; 10 e 20 ul
em espectrofotômetro (540 nm) ou fotocolorímetro com para Albumina) com um volume de reagente de 3,5 ml em
filtro verde (520-560 nm) zerando o aparelho com Branco todos os casos. Se os valores obtidos para o segundo tubo
de Reagente. fogem de 5% dos calculados conforme à leitura do primeiro
deve ser utilizado para os cálculos a curva de calibração.

ESTABILIDADE DA MISTURA DE REAÇÃO FINAL MÉTODO DE CONTROLE DE QUALIDADE

A cor é estável durante 12 horas devendo ler a absorbância Processar 2 níveis de um material de controle de qualidade
dentro deste período de tempo. (Standatrol S-E 2 niveles) com concentrações conhecidas
de proteínas totais e albumina, com cada determinação.
• DETERMINAÇÃO DE ALBUMINA
CONDIÇÕES DE REAÇÃO VALORES DE REFERÊNCIA
- Comprimento de onda: 625 nm em espectrofotômetro ou Foi determinado o conteúdo de proteínas totais e albumina
em fotocolorímetro com filtro verde (620-650 nm). em pessoas sadias, de ambos os sexos, com hábitos alimen-
- Temperatura de reação: 15-28oC tares normais e idades entre 17 e 40 anos. Foram obtidos
- Tempo de reação: 10 minutos os seguintes dados:
- Volume de amostra: 10 ul Proteínas totais: 6,1 a 7,9 g/dl
- Volume de Reagente B: 3,5 ml Albumina: 3,5 a 4,8 g/dl
- Volume final de reação: 3,51 ml Relação A/G: 1,2 a 2,2
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sues pró-
prios valores de referência.
PROCEDIMENTO
Em três tubos marcados B (Branco), P (Padrão) e D CONVERSÃO DE UNIDADES AO SISTEMA SI
(Desconhecido), colocar: Proteínas totais (g/dl) x 10 = Proteínas totais (g/l)
Albumina (g/dl) x 10 = Albumina (g/l)

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LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO - Peters, T. Jr. - Clin. Chem. 14:1147 (1968).
Vide Substâncias interferentes conhecidas em Amostra. - Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
- Determinação de Proteínas Totais: C.F. - Bioq. del Atlántico VI/63: 1931 (1974).
Pode ser utilizado plasma como amostra, mas o resultado - Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
da proteinemia será incrementado em 0,2 g/dl pela presen- C.F. - Bioq. Clin. VIII/4:241 (1974).
ça de fibrinogênio, que não é considerado pela definição - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
de Proteínas Totais. AACC Press, 4th ed., 2001.
- Determinação de Albumina:
Pode ser utilizado fator para os cálculos, sempre que a
reação seja realizada com temperatura entre 15 e 28oC.
Fora desta faixa, muda a cinética da reação e não é com-
pleto o desenvolvimento da cor.
O sistema deve ser padronizado com o Padrão fornecido,
já que os padrões liofilizados e pools de soros respondem
de diferentes maneiras.
Caso de utilizar um analisador automático recomenda-se,
para um melhor desempenho, Albumina AA de Wiener lab.

DESEMPENHO
a) Reprodutibilidade: processando duplicatas das mesmas
amostras em diferentes dias obtiveram-se os seguintes
resultados:
Proteínas Totais
Nível D.P. C.V.
4,6 g/dl ± 0,023 g/dl 0,49 %
5,8 g/dl ± 0,023 g/dl 0,40 %
7,0 g/dl ± 0,029 g/dl 0,41 %
Albumina
Nível D.P. C.V.
2,6 g/dl ± 0,079 g/dl 3,0 %
3,7 g/dl ± 0,071 g/dl 1,9 %
5,5 g/dl ± 0,070 g/dl 1,3 %
b) Recuperação: adicionando quantidades conhecidas
de albumina e globulinas a diferentes amostras obteve-se
uma recuperação de 96 a 103% para Proteínas Totais e 98
a 100% para Albumina.
c) Limite de detecção: dependendo do fotômetro utilizado
e da comprimento de onda, conforme com a sensibilidade
necessária para um ∆A mínimo de 0,001, a menor mudança
de concentração detectável será de 0,02 g/dl para Proteínas
Totais e 0,01 g/dl para Albumina.
d) Linearidade: a reação é linear até 12 g/dl para Proteínas
Totais e até 6 g/dl para Albumina.

APRESENTAÇÃO
Kit para 140 determinações de Proteínas Totais e Albumina
com Padrão (Cód. 1690001).
Wiener lab, fornece por separado:
Proti 2 Suero Patrón: frasco de 1,8 ml (Cód. 1690004).

REFERÊNCIA
- Doumas, B.T.; Watson, W.A. & Biggs, H.G. - Clin. Chim.
Acta 31/1:87 (1971).
- Gasbarro, L.; Bandinelli R. & Tomassini, G. - Clin. Chim.
Acta 36:275 (1972).
- Pastewka, J. W. & Ness, A. T. - Clin. Chim. Acta 12:523 (1965).

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 Proti 2
Colorimetric method for the determination of Total
Proteins and Albumin in serum

SUMMARY WARNINGS
Proteins are macromolecular organic compounds widely Reagents are for "in vitro" diagnostic use.
distributed in the body and are essential for life. They act Use the reagents according to the working procedures for
as structural and transport elements and also appear as clinical laboratories.
enzymes, hormones, antibodies, coagulation factors, etc. The reagents and samples should be discarded according
Albumin is the most abundant protein in serum. One of its to the local regulations in force.
most important functions is to enable the transportation of Reagent A: corrosive. H315+H320: Causes skin and eye
fatty acids, steroid hormones, bilirubin, and catecholamines, irritation. P262 Do not get in eyes, on skin, or on clothing.
which in their free form are not soluble in a water medium. P305 + P351 + P338 IF IN EYES: Rinse cautiously with water
Albumin concentration in plasma significantly influences on for several minutes. Remove contact lenses, if present and
the stability of the coloidosmotic pressure, which is related easy to do. Continue rinsing. P302 + P352 IF ON SKIN: Wash
to its relatively low molecular weight and its high net charge. with plenty of soap and water. P280 Wear protective gloves/
Under pathological conditions such as renal loss, malnutri- protective clothing/eye protection/face protection.
tion, long-term infections, etc., hypoproteinemias may ap-
pear; while hyperproteinemias are observed with multiple STABILITY AND STORAGE INSTRUCTIONS
myeloma, bacterial endocarditis and hemoconcentrations Provided Reagents: are stable at room temperature (<
of diverse origins. 25ºC) until the expiration date shown on the box.
Both situations are usually accompanied by hypoalbumin- Standard: stable at room temperature (no higher than 25oC)
emias. Abnormal albumin increases are occasional and are until the expiration date shown on the box. Refrigerate after
mostly related with dehydration that produces the concomi- opening.
tant increase in the plasma proteic content.
INSTABILITY OR DETERIORATION OF REAGENTS
PRINCIPLE Variations in the pH of the reagents may cause their dete-
Total Proteins Determination: rioration. Do not exchange the bottle caps.
Protein peptidic bonds react with the cupric ion in alkaline Any variation in the organoleptic characteristics of the Stan-
medium, rendering a violet complex with a maximum absorp- dard may indicate its deterioration.
tion at 540 nm, being its intensity proportional to the total
proteins concentration of the sample. SAMPLE
Serum
Albumin Determination: a) Collection: obtain non-hemolyzed serum.
Albumin specifically reacts -without previous separation- with b) Additives: not required.
the anionic form of the 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon phta- c) Known interference substances:
lein (BCP), in the presence of an excess of dye in buffered - In Total Proteins determination no interferences from biliru-
medium at pH 3.8. The absorbance increase at 625 nm, bin up to 100 mg/l, nor from mild hemolysis are observed.
related to the reagent Blank, is proportional to the albumin Turbidity caused by chylomicrons has never been observed.
quantity present in the sample. - In the Albumin determination no interferences from mod-
erate hemolysis, bilirubin up to 200 mg/l nor from lipemia
PROVIDED REAGENTS up to 20 g/l are observed. No previous deproteinization is
A. Reagent A: 13 mmol/l EDTA/Cu complex in 875 mmol/l required, since globulins do not interfere in this test.
NaOH and alkyl aryl polyether (AAP). See Young, D.S. in References for effect of drugs on the
B. Reagent B: 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon phtalein present method.
(BCP) solution (in polyoxyethylene lauryl ether). d) Stability and storage instructions: if the serum is not
S. Standard: bovine albumin and globulins solution with immediately tested, it can be stored up to 3 days in refrigera-
known proteins and albumin titers. Check the given values tor (2-10oC) or a week in freezer.
on the label, since they are lot specific.
REQUIRED MATERIAL (non-provided)
INSTRUCTIONS FOR USE - Spectrophotometer or photocolorimeter.
Provided Reagents: ready to use. - Micropipettes and pipettes to measure the stated volumes.

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- Tubes or spectrophotometric cuvettes.
- Water bath at 37oC (for Total Proteins). Mix with rod. Keep the tubes between 15 and 28oC for
- Stopwatch. 10 minutes. Read in spectrophotometer at 625 nm or in
photocolorimeter with red filter (620-650 nm) setting the
instruments to zero O.D. with the Reagent Blank.
• TOTAL PROTEINS DETERMINATION
ASSAY CONDITIONS
- Wavelength: 540 nm in spectrophotometer or photocolorim- STABILITY OF FINAL REACTION
eter with green filter (520-560 nm). The reaction color is stable for 20 minutes, thus readings
- Reaction Temperature: 37oC should be performed within this period.
- Reaction Time: 15 minutes
- Sample Volume: 50 ul CALCULATIONS
- Reagent A Volume: 3.5 ml Using the Standard as indicated in PROCEDURE, the cal-
- Final Reaction Volume: 3.55 ml culations are performed as follows:
T.P. (g/dl)
Total Proteins (g/dl) = U x f f=
PROCEDURE S
In three test tubes labeled B (Blank), S (Standard) and Alb. (g/dl)
U (Unknown), place: Albumin (g/dl) = U x f f=
S
B S U
Albumin (g/dl)
Distilled Water 50 ul - - A/G Ratio =
T.P. (g/dl) - Alb. (g/dl)
Standard - 50 ul -
Sample - - 50 ul CALIBRATION CURVE
Reagent A 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml To check that the colorimeter has a linear response in the
wavelengths indicated for the reactions, a calibration curve
Mix with rod. Incubate for 15 minutes at 37oC. Read in can be prepared with increasing quantities of Standard (e.g.
spectrophotometer at 540 nm or in photocolorimeter with 50 and 100 ul for Total Proteins; 10 and 20 ul for Albumin)
green filter (520-560 nm) setting the instruments to zero and a reagent volume of 3.5 ml in every case. If the value
O.D. with the Reagent Blank. obtained for the second tube differs more than 5% from the
ones calculated in reference to the first tube reading, the
calibration curve must be used for the calculations.
STABILITY OF FINAL REACTION
The reaction color is stable for 12 hours, thus readings should QUALITY CONTROL METHOD
be performed within this period. Each time the test is run, analyze two levels of a quality
control material (Standatrol S-E 2 niveles) with known total
• ALBUMIN DETERMINATION proteins and albumin concentration.
ASSAY CONDITIONS
REFERENCE VALUES
- Wavelength: 625 nm in spectrophotometer or photocolorim-
The contents of total proteins and albumin was determined
eter with red filter (620-650 nm).
in serum of healthy individuals of both sexes, with normal
- Reaction Temperature: 15-28oC
diet, ages between 17 and 40. The following ranges were
- Reaction Time: 10 minutes
obtained:
- Sample Volume: 10 ul
- Reagent B Volume: 3.5 ml Total Proteins: 6.1 to 7.9 g/dl
- Final Reaction Volume: 3.51 ml Albumin: 3.5 to 4.8 g/dl
A/G Ratio: 1.2 to 2.2
It is recommended that each laboratory establishes its own
PROCEDURE reference values.
In three photocolorimeter test tubes labeled B (Blank), S
(Standard) and U (Unknown), place: SI SYSTEM UNITS CONVERSION
Total proteins (g/dl) x 10 = Total proteins (g/l)
B S U
Albumin (g/dl) x 10 = Albumin (g/l)
Standard - 10 ul -
PROCEDURE LIMITATIONS
Sample - - 10 ul
See Known interference substances under SAMPLE.
Reagent B 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml - Total Proteins Determination:
Plasma can be used as sample, but the result of the pro-

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 teinemia will be increased in 0.2 g/dl due to the presence - Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
of fibrinogen, which is not considered in the definition of C.F. - Bioq. Clin. VIII/4:241 (1974).
the Total Proteins. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests",
- Albumin Determination: AACC Press, 4th ed., 2001.
If the reaction is performed between 15 and 28oC a factor
can be used for the calculations. Out of this range, the
kinetic of the reaction changes and the color development
is not completed.
The system should be standardized with the provided
Standard, as lyophilized and serum pools respond in a
different manner.
If an autoanalyzer is used in order to obtain a better perfor-
mance, it is recommended to Wiener lab’s Albúmina AA.

PERFORMANCE
a) Reproducibility: when replicates of the same samples
were assayed on different days the following results were
obtained:
Total Proteins
Level S.D. C.V.
4.6 g/dl ± 0.023 g/dl 0.49 %
5.8 g/dl ± 0.023 g/dl 0.40 %
7.0 g/dl ± 0.029 g/dl 0.41 %
Albumin
Level S.D. C.V.
2.6 g/dl ± 0.079 g/dl 3.0 %
3.7 g/dl ± 0.071 g/dl 1.9 %
5.5 g/dl ± 0.070 g/dl 1.3 %
b) Recovery: by adding known quantities of albumin and
globulins to different samples a recovery of 96 to 103% was
obtained for Total Proteins and between 98 and 100% for
Albumin.
c) Detection Limit: it depends on the photometer and the
wavelength. According to the sensitivity required for a ∆A
minimum of 0.001, the smallest detectable concentration
change will be of 0.02 g/dl for Total Proteins and 0.01 g/dl
for Albumin.
d) Linearity: the reaction is linear up to 12 g/dl for Total
Proteins and up to 6 g/dl for Albumin.

WIENER LAB PROVIDES

Kit for 140 Total Proteins and Albumin tests with Standard
(Cat. 1690001).
Wiener lab. separately provides:
Proti-2 Suero Patrón: 1 x 1.8 ml (Cat. 1690004).

REFERENCES
- Doumas, B.T.; Watson, W.A. & Biggs, H.G. - Clin. Chim.
Acta 31/1:87 (1971).
- Gasbarro, L.; Bandinelli R. & Tomassini, G. - Clin. Chim.
Acta 36:275 (1972).
- Pastewka, J. W. & Ness, A. T. - Clin. Chim. Acta 12:523
(1965).
- Peters, T. Jr. - Clin. Chem. 14:1147 (1968).
- Rojkín, M.L.; Olguín de Mariani, M.C.; Drappo, G.A. y Sosa,
C.F. - Bioq. del Atlántico VI/63: 1931 (1974).

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SÍMBOLOS // SÍMBOLOS // SYMBOLS
Símbolos que podrían encontrarse en los kits de reactivos para diagnóstico de Wiener lab. // ��������������������������������
Símbolos que podem ser encontra-
dos nos kits de reagentes para diagnóstico da Wiener lab. // Symbols that might be found on Wiener lab diagnostic reagent kits.

Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnóstico

C "in vitro"// Este produto preenche os requisitos da Diretiva Europeia 98/79 CE para dispositivos médicos de diagnóstico "in vitro"//
This product fulfills the requirements of the European Directive 98/79 EC for "in vitro" diagnostic medical devices

P Representante autorizado en la Comunidad Europea // Representante autorizado na Comunidade Europeia // Authorized represen-
tative in the European Community

V Uso diagnóstico "in vitro"// Uso médico-diagnóstico "in vitro"// "In vitro" diagnostic medical device
Contenido suficiente para <n> ensayos // Conteúdo suficiente para <n> testes // Contains sufficient for <n> tests
X
Fecha de caducidad // Data de validade // Use by
H
Límite de temperatura (conservar a) // Limite de temperatura (conservar a) // Temperature limitation (store at)
l
 No congelar // Não congelar // Do not freeze

Riesgo biológico // Risco biológico // Biological risks

F
Volumen después de la reconstitución // Volume após a reconstituição // Volume after reconstitution

Cont. Contenido // Conteúdo // Contents

g Número de lote // Número de lote // Batch code

M Elaborado por:// Elaborado por:// Manufactured by:

Nocivo // Nocivo // Harmful

Corrosivo / Cáustico // Corrosivo / Caústico // Corrosive / Caustic

Irritante // Irritante // Irritant

i Consultar instrucciones de uso // Consultar as instruções de uso // Consult instructions for use

Calibr. Calibrador // Calibrador // Calibrator

b Control // Controle // Control

b Control Positivo // Controle Positivo // Positive Control

c Control Negativo // Controle Negativo // Negative Control

h Número de catálogo // Número de catálogo // Catalog number

V
M Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina

Wiener lab.
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Autorizado A.N.M.A.T.
Disp. Nº: 1287/77-5349/98 2000 Rosario - Argentina
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