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Selección e idetificación de hongos magallánicos potencialmente

degradadores de hidrocarburos: características biocinéticas

Thesis · December 2010

DOI: 10.13140/RG.2.1.1133.1684

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1 author:

Vartan Ishanoglu
Pontificia Universidad Católica de Chile
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE
ESCUELA DE INGENIERÍA

SELECCIÓ E IDETIFICACIÓ DE
HOGOS MAGALLÁICOS
POTECIALMETE DEGRADADORES
DE HIDROCARBUROS:
CARACTERÍSTICAS BIOCIÉTICAS

VARTA ISHAOGLU MARZUCA

Memoria para optar al título de

Ingeniero Civil de Biotecnología

Profesor Supervisor:
CÉSAR ATOIO SÁEZ AVARRETE

Santiago de Chile, 2010

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE
ESCUELA DE INGENIERÍA
Departamento de Ingeniería Química y Bioprocesos

SELECCIÓ E IDETIFICACIÓ DE
HOGOS MAGALLÁICOS
POTECIALMETE DEGRADADORES DE
HIDROCARBUROS: CARACTERÍSTICAS
BIOCIÉTICAS

VARTA ISHAOGLU MARZUCA

Memoria presentada a la Comisión integrada por los profesores:

CÉSAR ATOIO SÁEZ AVARRETE

CRISTIA TEJOS UÑEZ

ALBERT LEADRO HERRERA ZEPPELI

Para completar las exigencias del título de

Ingeniero Civil de Biotecnología
Santiago de Chile, 2010
 A Onnik

i
Agradecimientos

Quisiera agradecer a mi profesor supervisor para la presente Memoria de Título, César Sáez
Navarrete (PhD.), profesor del Departamento de Ingeniería Química y Bioprocesos, no sólo por la gran
ayuda entregada en la realización de la investigación, sino también por los consejos, dirección y apoyo
brindado en todo momento durante mi estadía en la universidad.
También quisiera agradecer la ayuda de Profesor Patricio Arce (PhD.) y Felipe Aquea (PhD.) de la
Facultad de Ciencias Biológicas (PUC) que brindaron sus servicios para la caracterización genética en mi
investigación.
Agradezco a todas las personas que me dieran su apoyo, recomendaciones y ayuda durante mi
vida universitaria y que me apoyaran constantemente en este trabajo.

ii
Índice General

Página

Agradecimientos ....................................................................................................................................................... ii
Índice General .......................................................................................................................................................... iii
Índice de Tablas ........................................................................................................................................................ iv
Índice de Figuras ....................................................................................................................................................... v
Índice de Gráficos ..................................................................................................................................................... vi
Resumen.................................................................................................................................................................. vii
Abstract .................................................................................................................................................................. viii
1. Introducción.................................................................................................................................................1
2. Los Hongos Filamentosos ............................................................................................................................3
3. Actividad Ecológica de los Hongos Filamentosos: Biodegradación de la Lignina. .......................................5
4. Biorremediación ........................................................................................................................................ 10
5. Biodegradación de Hidrocarburos .............................................................................................................13
6. Micorremediación .....................................................................................................................................17
7. Agentes Fungicidas, Fungistáticos y Drogas Antifúngicas .........................................................................20
8. Materiales y Métodos ...............................................................................................................................22
9. Resultados .................................................................................................................................................28
10 Análisis y Discusión .................................................................................................................................... 38
11 Conclusiones ..............................................................................................................................................50
12 Referencias ................................................................................................................................................52
Anexo A. Imágenes del crecimiento de hongos de turba magallánica sin contaminante orgánico. .......................56
Anexo B. Imágenes crecimiento de hongos tolerantes a contaminantes orgánicos...............................................58
Anexo C. Imágenes crecimiento hongos en medio con 30 g/L de n-dodecano. .....................................................60
Anexo D. Imágenes Penicillium purpurogenum en crecimiento radial ...................................................................61
Anexo E. Imágenes inóculo. ....................................................................................................................................64
Anexo F. Imágenes crecimiento hongos en tierra contaminada con petróleo diesel. ............................................65

iii
Índice de Tablas

Página

Tabla 5.1: Alcanos ...................................................................................................................................................13

Tabla 5.2: 16 USA – EPA PAH ...................................................................................................................................15
Tabla 7.1: Sitios de acción de agentes químicos antifúngicos.................................................................................20

iv
Índice de Figuras

Página
Figura 2.1: Árbol filogénetico ....................................................................................................................................3
Figura 2.2: Monómeros de la lignina.........................................................................................................................6
Figura 2.3: Estructura de un polímero de la lignina ..................................................................................................7
Figura 5.1: Mecanismo biodegradativo de los PAH.................................................................................................14
Figura 5.2: Fenantreno ............................................................................................................................................16
Figura 5.3: Benzo[a]pireno ......................................................................................................................................16
Figura 9.4.1: Árbol filogenético de los hongos P. varibiale, P. rugulosum y P. purpurogenum...............................30
Figura 9.5.1: Microscopía P. purpurogenum 1. .......................................................................................................36
Figura 9.5.2: Microscopía P. purpurogenum 2 ........................................................................................................36
Figura 10.2.1: n-dodecano ......................................................................................................................................40
Figura 10.2.2: Furfural .............................................................................................................................................40
Figura 10.2.3: Antraceno .........................................................................................................................................40
Figura A.1: Crecimiento hifas en turba magallánica................................................................................................56
Figura A.2: Subcultivo hongos en PDA primer día ...................................................................................................56
Figura A.3: Subcultivo hongos en PDA segundo día ................................................................................................56
Figura A.4: Subcultivos del género Penicillium........................................................................................................57
Figura B.1: Crecimiento hongos sobre turba con contaminantes orgánicos ..........................................................58
Figura B.2: Subcultivos hongos en medio HAF ........................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura C.1: Crecimiento hongos sobre turba con 30 g/L n-dodecano. ....................................................................60
Figura C.2: Subcultivo hongos en medio con 30 g/L n-dodecano. ..........................................................................60
Figura D.1: Control negativo segundo día. ..............................................................................................................61
Figura D.2: Crecimiento hongos en n-dodecano segundo día. .................................. ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.3: Control positivo tercer día ....................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.4: Crecimiento hongos en antraceno tercer día. ......................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.5: Crecimiento hongos en antraceno cuarto día.......................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.6: Crecimiento hongos en furfural cuarto día .............................................. ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.7: Crecimiento hongos en n-dodecano cuarto día....................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura D.8: Control positivo y control negativo.......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura E.1: Inóculo ...................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura F.1: Crecimiento hongos tierra contaminada con petróleo ............................ ¡Error! Marcador no definido.
Figura F.2: Crecimiento hongos en tierra contaminada en placas de Petri ............... ¡Error! Marcador no definido.
Figura F.3: Esporulación en placas de Petri con tierra contaminada ......................... ¡Error! Marcador no definido.

v
Índice de Gráficos

Página

Gráfico 9.5.1: Crecimiento radial control positivo y control negativo ....................................................................31

Gráfico 9.5.2: Crecimiento radial P. purpurogenum en furfural .............................................................................32
Gráfico 9.5.3: Crecimiento radial P. purpurogenum en 10 g/L dodecano ...............................................................32
Gráfico 9.5.4: Crecimiento radial P. purpurogenum en 20 g/L dodecano ...............................................................33
Gráfico 9.5.5: Crecimiento radial P. purpurogenum en 40 g/L dodecano ...............................................................33
Gráfico 9.5.6: Crecimiento radial P. purpurogenum en 0.1 g/L antraceno .............................................................34
Gráfico 9.5.7: Crecimiento radial P. purpurogenum en 1 g/L antraceno ................................................................34
Gráfico 9.5.8: Crecimiento radial P. purpurogenum en 2 g/L antraceno. ...............................................................35
Gráfico 9.5.9: Crecimiento radial de P. purpurogenum a 62 horas en distintos contaminantes orgánicos ............35

vi
Resumen

Los objetivos de esta investigación fueron: (i) cuantificar e investigar la actividad degradadora de
hongos de pudrición blanca sobre distintos contaminantes orgánicos; (ii) extraer y cultivar estos
microorganismos originarios de turberas magallánicas empleando turba bien caracterizada y exponerlos
a altas concentraciones de compuestos orgánicos seleccionados; (iii) identificar aquellos hongos
orgánico tolerantes y potencialmente degradadores de hidrocarburos a partir de sus características
morfológicas y genéticas.
Para la metodología de la investigación se realizó una revisión bibliográfica en bases de datos
especializadas respecto de hongos de pudrición blanca empleados en biorremediación de suelos y sus
características metabólicas y degradativas.
Se realizó trabajo experimental para ratificar y complementar los antecedentes disponibles en la
literatura. Sobre la turba empleada se añadieron distintos medios de cultivo selectivos HAF
(hydrocarbon-adapted fungi) para microorganismos que degradan exclusivamente hidrocarburos, como
fuente única de carbono. Los hongos que lograron desarrollarse se subcultivaron, permitiendo
posteriormente una identificación genética y morfológica de las especies dominantes.
Finalmente, el hongo identificado (Penicillium purpurogenum) se cultivó en placas con medio
agar y distintas concentraciones de contaminantes orgánicos seleccionados (n-dodecano, antraceno,
furfural), logrando observar su resistencia, características y crecimiento. Es importante destacar que P.
purpurogenum no tiene estudios previos en la degradación de contaminantes orgánicos.

vii
Abstract

The objectives of this research were: (i) quantify and investigate the white rot fungi degrading
activity on different organic pollutants, (ii) extract and cultivate these microorganisms from magallanic
peat lands and then expose them to high concentrations of selected organic compounds, (iii) identify the
organic tolerant and potentially hydrocarbon degrading fungi from their morphological and genetic
characteristics.
For the research, was conducted a literature review (in specialized data bases) of white rot
fungi used in bioremediation of soils and their metabolic and degradative characteristics.
Experimental word was used to confirm and complement de information in literature. On the
peat were added different selective culture media (HAF hydrocarbon-adapted fungi) for microorganisms
that degrade hydrocarbons only (as the sole source of carbon). The dominant fungi species that
developed were subculture, allowing further genetic and morphological identification.
Finally, the identified fungus (Penicillium purpurogenum) was cultured on agar plates and
different concentrations of selected organic pollutants (n-dodecane, anthracene and furfural). It was
able to observe its strength and growth characteristics at different contaminants. Importantly, P.
purpurogenum has no previous studies on the degradation of organic contaminants.

viii
 1. Introducción

La explotación de petróleo alrededor del mundo ha generado la contaminación de los recursos

agua, tierra y aire. Es fácil recordar la emergencia ambiental ocurrida hace un par de meses en el Golfo
de México donde millones de litros de petróleo (con un flujo aproximado de 800,000 litros de petróleo
diarios) contaminaron una gran extensión de kilómetros cuadrados de mar, llegando hasta las costas de
Estados Unidos, provocando el cierre de playas, animales en peligro y la detención de muchas
actividades productivas en la zona costera.
La contaminación del suelo no sólo es consecuencia de terribles desastres ambientales, sino
también de las actividades cotidianas de los seres humanos. El funcionamiento diario de automóviles,
camiones, industrias y viviendas producen accidentalmente mezclas de hidrocarburos como petróleo,
gasolina, diesel, aceites y otros contaminantes orgánicos recalcitrantes, llegando a suelos que son o
serán utilizados en procesos productivos o de vivienda. A través de la contaminación de los suelos,
también resulta evidente la contaminación de fuentes de agua dulce para consumo humano. Esto
conlleva a un peligro directo para animales, plantas y seres humanos (Canet et al., 2001).
Es necesaria la descontaminación de los suelos, ya que implica beneficios para la salud humana,
el medio ambienta y las actividades industriales y comerciales. Para resolver este problema, se han
desarrollado una gran cantidad de técnicas para reducir o eliminar la contaminación de los suelos. La
tecnología de biorremediación brinda la posibilidad de reutilizar suelos contaminados que
anteriormente no podían ser utilizados para procesos productivos o para vivienda.
Se ha tenido éxito en la biodegradación de una gran índole de compuestos a base de carbono:
hidrocarburos aromáticos policíclicos, clorofenoles y otros diversos hidrocarburos procedentes del
petróleo y sus subproductos. El desarrollo de la biorremediación con microorganismos en Chile se ha
enfocado principalmente en el uso de bacterias con la capacidad de mineralizar compuestos a base de
carbono orgánico. El desarrollo científico, publicaciones e investigaciones de campo han logrado buenos
avances para la descontaminación de suelos en diversas zonas del país.
De los microorganismos utilizados para biorremediación, los hongos de pudrición blanca son
una excelente posibilidad para potenciar investigaciones que busquen la recuperación del medio
ambiente. Su uso ha sido probado en experiencias de laboratorio, plantas pilotos y a niveles comerciales
(Bhandari et al., 2007), por lo que ahondar en su utilización en Chile es un factor importante, ya que
abrirá nuevas aristas para el desarrollo de la biorremediación de suelos contaminados.

1
 Los hongos son microorganismos eucariontes con paredes celulares rígidas y un metabolismo
adsorbativo. Su proliferación en los ambientes es gracias a su producción de esporas, que soportan
temperaturas y condiciones ambientales extremas sin degradarse. Dentro de la familia de los hongos,
los filamentosos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y son sumamente importantes en las
rutas degradativas de compuestos naturales difíciles de degradar, como celulosa y lignina.
La presente investigación se centró en hongos filamentosos de pudrición blanca. Estos
microorganismos tienen dos sistemas enzimáticos extracelulares: (i) sistema hidrolítico con hidrolasas
que degradan polisacáridos; (ii) sistema oxidativo y lignolítico extracelular, que degrada lignina y abre
los anillos fenólicos. Las enzimas ligníticas tienen un poder altamente oxidativo y son poco específicas en
sus substratos. Las enzimas degradadoras de lignina son principalmente tres: lignina peroxidasas (LiP),
manganeso peroxidasa (MnP) y lacasa (Lac).
El uso de biorremediación con hongos (micorremediación) ofrece la posibilidad de degradar
rápida y eficientemente contaminantes orgánicos, gracias a su gran poder enzimático extracelular. Sin
embargo, la existencia de una gran diversidad de hongos de pudrición blanca que pueden llevar a cabo
la biorremediación se contrapone con los distintos potenciales de biodegradación de cada hongo para
diferentes contaminantes. Por ejemplo, algunos de ellos degradan mejor compuestos aromáticos y otros
son más eficientes mineralizando compuestos lineales de carbono.
De los sitios contaminados con petróleo crudo en las fosas de ENAP Magallanes, en Tierra del
Fuego (Chile), se apreció el crecimiento de hongos de pudrición blanca sobre pilas y piscinas de
biorremediación. Se sospechaba que la presencia de estos hongos se debía a las esporas presentes en la
turba magallánica utilizada como material abultante. Por tanto, se consideró muy relevante identificar y
estudiar la actividad degradadora de hidrocarburos del petróleo de estos hongos, previendo un
potencial muy significativo en el desarrollo tecnológico de sistemas de tratamientos.
Los objetivos de la presente memoria son: la cuantificación e investigación de la actividad
degradadora de hongos de pudrición blanca sobre distintos contaminantes orgánicos; extracción y
cultivo de microorganismos originarios de turberas magallánicas empleando turba bien caracterizada y
exponerlos a altas concentraciones de compuestos orgánicos seleccionados; identificar de hongos
orgánico tolerantes y potencialmente degradadores de hidrocarburos a partir de sus características
morfológicas y genéticas.

2
 2. Los Hongos Filamentosos

En las experiencias de la siguiente memoria se identificó una serie de hongos filamentosos de

pudrición blanca de la especie Penicillium. Se estudió de forma más especifica el crecimiento de
Penicillium purpurogenum ante distintas concentraciones de contaminantes orgánicos. Por eso es
importante conocer las principales características que rigen el desarrollo y crecimiento de los hongos
filamentosos.
Los hongos son microorganismos eucariontes (Figura 2.1). Las células eucariotas, a diferencia de
las procarióticas, poseen en su interior una serie de estructuras características conocidas como
organelos. Dentro de la gran variedad, el de mayor importancia es el núcleo celular, ya que posee la
información genética (DNA) para la posterior traducción de genes (Madigan et al., 2006).

Figura 2.1 El árbol filogenético permite la separación de los organismos a partir de la secuenciación del rRNA. Los datos que
han sido obtenidos a través de los años han permitido la separación de tres dominios principales. La localización en rosado
es la raíz del árbol, representando al ancestro universal de todos los seres vivos (Madigan et al., 1999). Dentro de este
diagrama podemos apreciar que los hongos (fungi) se encuentran en el dominio de los Eukarya.

Los hongos poseen paredes celulares rígidas, como las células de algas y plantas, pero a
diferencia de estos, los hongos son organismos no fotótrofos, sino adsorbativos. La pared celular de los
hongos se asemeja mucho estructuralmente a la pared celular de las plantas, pero químicamente no son
iguales. Entre un 80% y 90% de la pared celular de los hongos son polisacáridos, mientras que el resto se

3
divide en proteínas, lípidos, polifosfatos e iones inorgánicos logrando una estructura altamente robusta
(Madigan et al., 2006).
Su proliferación es a base de su producción de esporas como medida de reproducción.
Dependiendo del grupo de hongos, se formaran distintos tipos de esporas. Las esporas de los hongos
son resistentes al calor, congelación y a algunas reacciones químicas. Se puede decir que los hongos
pueden estar presentes casi en cualquier ambiente gracias a su producción de esporas y alta resistencia
ante distintas condiciones medioambientales y químicas.
Se pueden distinguir tres grupos mayores de hongos: moho (hongos filamentosos), levaduras y
setas. Además, los hábitats donde se pueden encontrar son muy diversos. Algunos hongos son
acuáticos, encontrándose la gran mayoría en agua dulce y otros en aguas marinas. Por otra parte, la
gran mayoría de los hongos son terrestres, habitando en la tierra o materia muerta principalmente de
plantas, logrando un importante rol en la degradación de la materia orgánica (Cerniglia, 1992; Rigas et
al., 2007; López et al., 2006).
Los hongos son organismos quimioorganoheterótrofos y generalmente tienen requerimientos
nutricionales simples.
Los mohos crecen en la forma de filamentos pluricelulares. Estos hongos filamentosos están
ampliamente distribuidos en la naturaleza y son organismos obligados aerobios. El tipo de crecimiento
de estos hongos se basa en que cada filamento crece principalmente en la punta por una extensión
llamada hifa. Las hifas crecen usualmente juntas en formas compactadas llamadas micelios.
Ciertas ramas de hifas llegan a sectores con aire, arriba de la superficie, donde se forman
estructuras ramificadas con esporas llamadas conidias. Las conidias son esporas asexuadas –que no
involucran fusión de gametos-, muy resistentes a sectores secos y son generalmente pigmentadas. La
función de las conidias es la dispersión del hongo a nuevos hábitats.
Otros mohos pueden formar esporas sexuales (producidas por reproducción sexual). Estas
esporas se producen por la fusión de gametos unicelulares o por una hifa altamente especializada
llamada gametangia. Alternativamente las esporas sexuales pueden ser originadas por la fusión de dos
células haploides para producir células diploides. Las esporas sexuales son resistentes a sectores secos,
calor, frío y ciertos agentes químicos. Así, esporas sexuales y asexuales de los hongos pueden germinar y
desarrollar hifas y micelios (Madigan et al., 2006).

4
 3. Actividad Ecológica de los Hongos Filamentosos: Biodegradación de la Lignina.

El suelo es considerado un recurso natural de mucha importancia, que puede ser visto como un
reactor natural que conforma el hábitat de una infinitud de organismos de distinto tamaño y funciones
microbiológicas (Volke et al. 2005). Muchos suelos o tierras poseen una gran cantidad de
microorganismos, entre los cuales destacan los hongos, formando un sistema complejo de interacción y
crecimiento. Esta comunidad microbiológica está compuesta por hongos, levaduras, bacterias y otros
microorganismos, que en su conjunto ayudan a mantener la biodiversidad y una importante actividad
ecológica de degradación, formación de vida y reserva genética (Volke et al. 2005).
Una gran e importante actividad de muchos hongos, en especial de los filamentosos, es la
descomposición de madera, papeles, ropa y otros productos derivados, naturales o sintéticos. Los
hongos atacan estos productos porque contienen celulosa, lignina u orgánicos complejos siendo una
fuente de energía y carbono (Madigan et al., 2006).
Debido a que los hongos de pudrición blanca tienen la habilidad de degradar un gran rango de
substancias provenientes de la lignina y la misma lignina, existe gran interés en su aplicación tecnológica
en procesos de biorremediación. En la presente memoria, Penicillium purpurogenum (hongo
filamentosos de pudrición blanca) fue capaz de tolerar distintos contaminantes. Las enzimas lignolíticas
de estos hongos tienen un alto poder degradativo, existen compuestos orgánicos altamente
recalcitrantes que son degradados pobremente (López et al., 2006). A pesar de esto, se espera que en
investigaciones posteriores se pueda ocupar este hongo para la biorremediación de suelos. Debido a
esto es importante conocer las condiciones que permitan el crecimiento de este tipo de hongos, como
también su metabolismo y el accionar de sus enzimas, que se caracterizan por su alto poder
degradativo.
El crecimiento de los hongos es función de la temperatura y requieren humedad para una buena
colonización. Además, necesitan nutrientes inorgánicos como nitrógeno y fosforo, para apoyar su
crecimiento y lograr una mejor asimilación (degradación) de las fuentes de carbono (Hughes et al.,
2007).
También resulta relevante conocer el rango de concentraciones y toxicidad del medio en el caso
de la degradación de distintos compuestos xenobióticos. A ciertos rangos de concentración pueden
ayudar al crecimiento microbiológico y en otros, inhibir o reducir la cantidad de microorganismos debido
a su toxicidad (Hughes et al., 2007).

5
 Muchos microorganismos tienen la habilidad de degradar y utilizar lignocelulosa como fuente de
carbono y energía. Las lignocelulosas consisten en tres tipos de polímeros: celulosa, hemicelulosa y
lignina. El principal componente de la lignocelulosa es la celulosa, seguido por la hemicelulosa y lignina.
Celulosa y hemicelulosa son macromoléculas construidas de diferentes azúcares (Sánchez,
2009). Por su parte, la lignina es un polímero altamente complejo que está construido en bloques de
compuestos fenólicos (Figura 2.2). La estructura de la lignina es altamente compleja, presentando una
amplia gama de enlaces mostrando polímeros heterogéneos (ligninas). Para simplificar conviene utilizar
el término de lignina para sus distintos polímeros dentro de las diferentes maderas.
Es un importante constituyente de la madera de las plantas y en asociación con la celulosa
brinda la rigidez deseada. Por ello, la lignina es el compuesto más recalcitrante de la pared celular de las
plantas (Sánchez, 2009), de difícil degradación para un gran espectro de microorganismos.

Figura 2.2 La lignina está compuesta por monómeros que son generalmente compuestos fenólicos unidos a través de fuertes
enlaces covalentes. Se puede apreciar dos monómeros de la lignina: (a) alcohol coniferílico y (b) alcohol sinapílico.

La lignina está unida a celulosa y hemicelulosa formando un sello que es una barrera
impenetrable en la pared celular de la planta. Además de lograr impermeabilidad, permite en la pared el
soporte estructural y la resistencia al ataque microbiano y al estrés oxidativo (Sánchez, 2009).
A pesar de la difícil degradación de la lignina, un pequeño grupo de hongos filamentosos ha
evolucionado con la habilidad de romper esta molécula tan compleja. Estos hongos pueden lograr la
degradación de la lignina hasta metabolitos y dióxido de carbono (Walter et al., 2004), logrando un
importante papel del ciclo del carbono. Los metabolitos que cumplan los requisitos podrán entrar a la
matriz celular del hongo.
La descomposición de la lignina (Figura 2.3) se produce casi exclusivamente por la actividad de
ciertos hongos filamentosos llamados hongos de pudrición de la madera (wood rotting fungi). Los dos
tipos de pudrición fúngica de madera son: pudrición café, en la que la celulosa es atacada
preferentemente y la lignina no es metaboliza, y la de pudrición blanca, donde celulosa y lignina son
descompuesta por los hongos. Por eso mismo, los hongos de pudrición blanca son considerados muy
importantes ecológicamente ya que juegan un rol esencial en la descomposición de la madera en los
bosques y otros medios ambientes abundantes en biomasa lignocelulósica.

6
 La habilidad de degradar eficientemente lignocelulosa por parte de los hongos está asociada a
un hábitat donde las micelas pueden crecer.
crecer. Dentro de este hábitat, los hongos pueden obtener
nutrientes como nitrógeno y fósforo como también fuentes de carbono y energía. La degradación ocurre
extracelularmente, principalmente por la insolubilidad de los compuestos que presenta la lignocelulosa
lignocelulos
(lignina, hemicelulosa y celulosa). La fuente principal de nutrientes (carbono, nitrógeno y fósforo) para
los hongos de pudrición blanca son los árboles y celulosa de otras plantas, que están protegidos por el
biopolímero de la lignina (Rigas et al.,
al. 2007).
Es importante reconocer los aportes nutricionales de la madera y sus derivados (celulosa,
hemicelulosa y lignina). Estos tres compuestos están conformados por moléculas de carbono, lo que
sirve como materia prima para una gran cantidad de microorganismos.
microorganismos. Si se aprecia la concentración de
los macro y micronutrientes dentro de la madera en comparación a las concentraciones dentro de los
hongos, los niveles son mayores dentro del microorganismo, por ello cualquiera de estos nutrientes
puede ser el factor limitante para el crecimiento.

Figura 2.3 Estructura de un polímero de lignina.

l Se puede destacar la gran presencia de anillos de fenol, lo que limita la
degradación de la lignina por parte de muchos microorganismos.

7
 Generalmente, el nitrógeno es el nutriente (factor) limitante, estimulando el crecimiento de los
hongos de pudrición blanca. En experimentos donde se colocan hongos sobre madera, al agregar
fuentes de nitrógeno, en comparación a otros nutrientes (vitaminas, elementos esenciales –excepto N-,
glucosa y otros azúcares), la tasa de degradación de la madera disminuye, pero existe crecimiento por
parte de los microorganismos (Boyle, 1998). Por otra parte, las fuentes complejas de nitrógeno
aumentan más el crecimiento de los microorganismos, teniendo poco efecto en la degradación de
lignina.
Cuando glucosa y una fuente de nitrógeno son añadidos, los resultados no difieren de agregar
sólo la fuente de nitrógeno. Los hongos al no poseer una fuente directa de nitrógeno buscan dentro de
los constituyentes de la madera los nutrientes necesarios para su crecimiento.
La disponibilidad de carbohidratos no es el factor limitante de los hongos cuando crecen sobre
madera; por lo que la adición de fuentes complejas de nitrógeno aumenta el crecimiento. Ante la
limitación de nitrógeno el metabolismo de los hongos cataboliza los componentes de la madera de
forma rápida, logrando tener acceso a nutrientes y factores de crecimiento, que están a bajas
concentraciones en la madera (Boyle, 1998).
La adición de nitrógeno, especialmente en formatos de moléculas complejas, produce un buen
crecimiento para los hongos. Además de ser fuente de nitrógeno, también aportan carbono y otros
elementos necesarios para los microorganismos. Al agregar fuentes de nitrógeno no complejas se puede
inhibir la degradación de lignina (Boyle, 1998).
Los hongos filamentosos de pudrición blanca tienen dos sistemas enzimáticos extracelulares. El
sistema hidrolítico que produce hidrolasas que degradan polisacáridos; y un sistema único oxidativo y
lignolítico extracelular, que permite la degradación de lignina abriendo los anillos fenólicos (Sánchez,
2009). Las enzimas ligníticas tienen un poder altamente oxidativo y son poco específicas en sus
substratos (Sánchez, 2009).
La degradación realizada de los hongos de pudrición blanca se basa principalmente en procesos
oxidativos y las enzimas fenol oxidasas son las principales (Sánchez, 2009). Dentro de las estas enzimas
degradadoras de lignina se han estudiado principalmente tres: lignina peroxidasas (LiP), manganeso
peroxidasa (MnP) y lacasa (Lac) (López et al., 2006; Meysami & Baheri, 2003). Estas tres enzimas son
fundamentales para la supervivencia del hongo. Aunque la mejora del crecimiento de los hongos y la
generación de enzimas que degraden lignina en un ambiente natural ha sido difícil de lograr. Se han
descubierto otras enzimas que están involucradas en la degradación de lignina: aryl – alcohol oxidase
(AAO), aryl – alcohol oxidasa dehydrogenases (AAD), quinone reductases (QR) (Rigas et al., 2007).

8
 Los productos metabólicos (simples) de la degradación (extracelular) de la lignina son
incorporadas a través de la hifa para ser utilizadas en las rutas celulares al interior del hongo (López et
al., 2006), donde otra serie de enzimas intracelulares se encargan de su catálisis.
El desarrollo de un sistema capaz de la degradación de lignina va unido al conocimiento que no
existe algún organismo que pueda usar solamente lignina como fuente única de carbono y energía.
Muchos hongos de pudrición blanca degradan de forma simultánea lignina, hemicelulosa y celulosa;
mientras que otros hongos de pudrición blanca remueven la lignina para poder tener acceso a la
celulosa y hemicelulosa (Sánchez, 2009).

9
 4. Biorremediación

Se entiende por biorremediación a una variedad de técnicas que utilizan el potencial metabólico
de microorganismos vivos para limpiar ambientes contaminados (Boopathy, 2000). El trabajo de
biorremediación depende de un trabajo multidisciplinario que envuelve a la ingeniería, microbiología,
ecología, geología y química.
Investigaciones han mostrado una gran variedad de organismos (plantas, hongos y bacterias)
que logran reducir o eliminar la contaminación de distintos compuestos peligrosos para la salud humana
y el medio ambiente. Para que la biorremediación sea exitosa son necesarios los microorganismos
correctos: bacterias y hongos son una de las mejores opciones para la descontaminación de suelos ya
que tienen la mejor capacidad de degradar contaminantes de diversa procedencia y en distintas
condiciones (Boopathy, 2000).
La biorremediación de suelos se enfoca principalmente en la degradación de distintos
compuestos orgánicos por parte de microorganismos (Mancera-López et al., 2008), aunque se aplica
también para muchos contaminantes inorgánicos (Volke et al. 2005). En resumen, la biorremediación de
suelos implica la descontaminación por vía biológica.
De esta manera, los hongos forman parte importante en la biodegradación de contaminantes
orgánicos, brindando nuevas herramientas y el mejoramiento de tecnologías que logren mejorar los
procesos de descontaminación. La presente investigación se centró en la búsqueda de especies de
hongos de pudrición blanca que brindan nuevas posibilidades en la biodegradación, ya que pueden
poseer rutas metabólicas o enzimas que ataquen de forma más efectiva a un determinado grupo de
contaminantes.
Las bases biológicas de la biorremediación o de la biodegradación de contaminantes orgánicos,
como los diversos constituyentes del petróleo, se fundamenta en la capacidad de los microorganismos
de digerir los compuestos a su alrededor y convertirlos a través de la oxidación en dióxido de carbono
(CO2) y agua.
La biorremediación de suelos tiene muchas ventajas sobre otras técnicas. La biorremediación es
una tecnología que utiliza menos energía, es más amigables para el medio ambiente (Canet et al., 2001),
se puede realizar en terreno, tiene más aceptación pública (Boopathy, 2000) y minimiza los costos de
operación (tecnología costo – efectiva).
Los posibles residuos generados por la aplicación de tecnologías de biorremediación son menos
activos químicamente, en comparación a procesos fisicoquímicos de remediación de suelos. Así, la

10
biorremediación ofrece soluciones más simples y completas que las tecnologías mecánicas o
fisicoquímicas, aunque en tiempos de tratamiento sensiblemente superiores.
A pesar de las ventajas, la biorremediación tiene sus limitaciones: algunos compuestos no se
pueden biodegradar y algunas veces se pueden generar metabolitos tóxicos. Cada sitio contaminado
tiene sus propias características (suelo, microbiota, material orgánico, etc.) por lo que requiere un
estudio individual, para conocer sus cualidades especificas. La tecnología para la biorremediación de un
sitio contaminado en específico necesita ser lo más detallado posible para lograr los resultados
esperados.
En la biorremediación existen relaciones entre los microorganismos (aeróbicos y anaeróbicos),
los contaminantes y el suelo (bioquímicos, fisicoquímicos y condiciones ambientales) que son
importantes de estudiar antes de realizar cualquier proceso. Entre los factores fisicoquímicas y
ambientales que afectan la biorremediación destacan la fuente de energía (donadores de electrones), el
aceptor terminal de electrones, contenido de humedad, nutrientes, pH, temperatura, estructura del
suelo, biodisponibilidad de los contaminantes presentes, presencia de microbiología degradadora
natural del suelo, existencia de transferencia de masa entre fases, envejecimiento de suelos y
contaminantes, sustancias inhibitorias entre otros. Si alguno de estos factores no está dentro de los
rangos en los cuales los microorganismos no puedan biodegradar (o sobrevivir) existirá una resistencia
para la biorremediación del suelo contaminado.
Las tecnologías de biorremediación de suelos se pueden clasificar en in situ y ex situ; las
tecnologías in situ implican el tratamiento de los suelos contaminados en el lugar. Por el contrario, las
tecnologías ex situ involucran la remoción física del material contaminado y un posterior proceso de
tratamiento. Algunos ejemplos de biorremediación in situ y ex situ se dan a continuación (Boopathy,
2000):

- Compostaje: proceso termofílico y generalmente aeróbico en el cual el material contaminado es

mezclado con material abultante. Utilizado es pilas estáticas o pilas aireadas.
- Bioreactores: biodegradación en un contenedor o reactor. Utilizado generalmente para tratar la fases
liquidas o los lodos.
- Tratamiento de tierra: sistema de biorremediación en fase sólida; puede ser realizado in situ y ex situ.
- Bioventilación: se administra oxígeno en el suelo contaminado para estimular la actividad
microbiológica.

11
- Biofiltros: se utilizan columnas de extracción microbiológicas para tratar las emisiones de aire
contaminado que pueda escapar del suelo.
- Bioaumentación: adición de bacterias a un medio contaminado. Generalmente se usa en sistemas in
situ y ex situ.
- Bioestimulación: estimulación de la población microbiota autóctona en suelos (o agua subterránea)
entregando los nutrientes necesarios para su desarrollo.
- Biorremediación intrínseca: biorremediación no asistida. Solamente se monitorea regularmente.

La biorremediación es regulada por parte de las agencias de protección del medio ambiente en
los distintos países. Estas agencias gubernamentales dictaminan qué tiene que ser limpiado, cómo
limpiarlo y qué métodos de limpieza deben ser utilizados. Además también se han desarrollado normas
y leyes sobre la generación y deposito de los contaminantes, con el objetivo de reducir los desechos,
evitar desastres y encontrar nuevas soluciones.
La regulación en la biorremediación de suelos implica la limitación de la metodología, ya que
presenta los estándares de limpieza. La EPA (Environmental Protection Agency) de EEUU posee normas
que indican cuales compuestos químicos son considerados contaminantes (con sus distintos parámetros
de toxicidad), la concentración final en el suelo posterior a la biodegradación del contaminante (sin la
necesidad que todo el contaminante sea mineralizado) y si el producto o equipo de biorremediación
puede ser utilizado para lograr los objetivos específicos al momento de tratar y administrar los residuos
(Boopathy, 2000).

12
 5. Biodegradación de Hidrocarburos

El petróleo es una mezcla compleja que contiene una gran cantidad de diferentes compuestos
químicos, pero principalmente hidrocarburos. La composición de estos hidrocarburos puede ser
separada en distintas fracciones: n-alcanos, aromáticos, resinas y asfáltenos (Rahman et al., 2003). La
investigación se centrará en compuestos n-alcanos y en los hidrocarburos aromáticos policíclicos, o PAH
por sus siglas en inglés (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons).
Los hidrocarburos alifáticos son compuestos orgánicos que están constituidos solamente por
carbono e hidrógeno. Cuando presentan una estructura abierta se pueden clasificar dependiendo del
número de enlaces carbono-carbono (alcanos, alquenos, alquinos). Cuando los enlaces carbono-carbono
de los hidrocarburos alifáticos son simples se les denomina alcanos (enlace simple). Los alquenos
presentan uno o varios dobles enlaces carbono-carbono, mientras que los alquinos tienen al menos un
enlace triple entre dos átomos de carbono.
Los alcanos (Tabla 5.1) son conocidos también como hidrocarburos saturados y no presentan
grupos funcionales. Dependiendo de su procedencia, su extensión puede variar, logrando encontrar al
más simple de todos (metano con una sola molecula de carbono CH4) hasta hidrocarburos lineales de 40
carbonos. Una de sus características principales es tu alta insolubilidad en solventes polares como el
agua.
Tabla 5.1. Alcanos. La relación C/H se explica a
través de CnHn+2 (donde n es el número de
moléculas de carbono)
Nombre Alcano Formula Química
Metano CH4
Etano C2H6
Propano C3H8
Butano C4H10
Pentano C5H12
Hexano C6H14
Heptano C7H16
Octano C8H18
Nonano C9H20
Decano C10H22
Undecano C11H24
Dodecano C12H26
Tetradecano C14H30
Hexadecano C16H34
Octadecano C18H38
Eicosano C2oH42

13
 En la biorremediación de suelos existen microorganismos que son especializados en la
biodegradación de n-alcanos. En suelos contaminados con petróleo, se pueden encontrar
microorganismos que utilizan a los alcanos como fuente de carbono y energía (Sáez-Navarrete, 2008).
A medida el número de carbono de los n-alcanos va aumentando se obtienen menores
porcentajes de degradación. Después de 56 días, consorcios microbianos lograron la biodegradación
completa (100% degradación) de n-alcanos en un rango de nC8 - nC11, seguidos por nC12 – nC21, nC22
– nC31 y nC328 – nC40 con porcentajes de biodegradación, 83–98%, 80–85% and 57–73%
respectivamente (Rahman et al., 2003).
Los PAH tienen la característica de ser considerados altamente tóxicos y recalcitrantes
(Cerniglia, 1992; Mancera-López et al., 2008). De hecho, su concentración en diversas matrices en
diversas fases se encuentra regulada en varios países del globo.
Se han realizado intensas investigaciones para lograr entender las vías de biodegradación de los
distintos PAH (Figura 5.1Figura ). Los microorganismos que logran degradar PAH poseen mecanismos
metabólicos enzimáticos específicos que permiten su degradación e incluso su mineralización (Cerniglia,
1992). A pesar de los esfuerzos realizados, aún existen rutas degradativas y mecanismos de degradación
de PAH desconocidos (Bhandari et al., 2007).

Figura 5.1. Los hongos logran la biodegradación de los PAH a través de un mecanismo metabólico que combina una serie de
enzimas de alto poder degradativo (Cerniglia, 1992). Se puede apreciar el mecanismo degradativo a partir de enzimas
lignolíticas en el sector central de la figura.

14
 La EPA clasificó los dieciséis PAH de mayor importancia (Tabla 5.2) debido a su peligro al medio
ambiente y su alto poder recalcitrante. En los seres humanos, exposiciones prolongadas a diversas
concentraciones de PAHs pueden producir efectos mutagénicos y cancerígenos, por lo que se hace
necesario removerlos de los sitios contaminados de mayor riesgo para las personas y el medioambiente
(Mancera-López et al., 2008).
Los 16 EPA - PAH pueden ser agrupados de distintas maneras. Una de las formas más simples es
través del número de anillos que la componen -2, 3, 4, 5 y 6 anillos. Así se pueden subdividir en 3 grupos
para un mejor estudio (Antizar-Ladislao et al., 2006):

⋅ PAH de 2 y 3 anillos (Figura 5.2): naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, antraceno,

fenantreno (PAH pequeños).
⋅ PAH de 4 anillos: fluoranteno, pireno, benzo [a] antraceno, criseno (PAH medios).
⋅ PAH de 5 y 6 anillos: benzo [b] fluoranteno, benzo [k] fluoranteno, el benzo [a] pireno, dibenzo
[a, h] antraceno, indeno-[1, 2, 3-c, d] pireno, benzo [g, h, i] perileno (PAH grandes).

Tabla 5.2. 16 USA - EPA PAH (Antizar-Ladislao et al., 2005).

PAH Número de Anillos Bencénicos
Naphthalene 2
Naphthalene-d10 2
1-Fluoronaphthalene 2
2-Fluorobiphenyl 2
Acenaphthylene 2
Acenaphthene 2
Acenaphthene-d10 2
Fluorene 2
Phenanthrene 3
Anthracene 3
Fluoranthene 3
Pyrene 4
Benzo[a]anthracene 4
Chrysene 4
Chrysene-d12 4
Benzo[b]fluoranthene 4
Benzo[k]fluoranthene 4
Benzo[a]pyrene 5
Indeno[1,2,3-c,d]pyrene 5
Dibenzo[a, h]anthracene 5
Benzo[g, h, i]perylene 5

15
 Distintos estudios han podido apreciar que existe una alta biodegradación de PAH con un
número bajo de anillos (Antizar-Ladislao et al., 2005) y estructura molecular simple (Mancera-López et
al., 2008). Mientras más anillos tengan el PAH, más será su masa molecular y poseerán estructuras más
complejas. Debido a esto, los microorganismos presentarán cada vez mayores dificultades para la
degradación a medida que el número de anillos aumenta (Mancera-López et al., 2008).

Figura 5.2. Fenantreno, PAH de 3 anillos bencénicos. Su formula molecular es C14H10

También existen PAHs de difícil degradación altamente recalcitrantes, como es el caso de los
compuestos criseno, benzo[k] fluoranteno y benzo[a]pireno (Figura 5.3).
Se han investigado diferentes estrategias para encontrar las condiciones idóneas para la
eliminación de estos compuestos recalcitrantes. Muchas de las investigaciones se han enfocado en
aumentar la biodisponibilidad de estos compuestos, ya sea a través del aumento de temperatura, el uso
de surfactantes y/o microorganismos especializados en la degradación de hidrocarburos aromáticos
(Antizar-Ladislao et al., 2006).

Figura 5.3. Benzo[a]pireno un PAH altamente recalcitrante con 5 anillos de benceno.

El uso de hongos de pudrición blanca en la presente investigación conlleva a la utilización de

microorganismos con una alta tolerancia a compuestos orgánicos recalcitrantes. Además brinda la
oportunidad de investigar su posible utilización para la biorremediación de suelos contaminados con n-
alcanos y PAH. Los hongos de pudrición blanca presenten enzimas poco específicas que pueden atacar
n-alcanos y aromáticos. Para entender la tolerancia de Penicillium purpurogenum ante n-alcanos se
utilizó n-dodecano; en el caso de PAH fue antraceno.

16
 6. Micorremediación

El uso de biorremediación con hongos (micorremediación), sobre el uso de bacterias, ofrece una
más fácil degradación de compuestos orgánicos pesados y recalcitrantes (Bhandari et al., 2007), gracias
a su gran poder enzimático extracelular no específico, que ataca fuertemente a un gran espectro de
contaminantes orgánicos (Canet et al., 2001). Además, los hongos muestran una mayor resistencia a la
toxicidad del medio a elevadas concentraciones de contaminantes (Bhandari et al., 2007). Sin embargo,
también existen inconvenientes en la utilización de hongos en biorremediación. La producción de lodos
y micelas, el requerimiento de nutrientes, post-tratamiento de los suelos tratados a pH ácido y su
posible esterilización, pueden hacer que la micorremediación pueda ser más costosa que las tecnologías
basadas en bacterias (Ellouze et al., 2008).
Para una exitosa degradación de compuestos orgánicos empleando hongos, se requieren
condiciones de proceso particulares, que permitan el adecuado desarrollo de los hongos degradadores y
la metabolización de los contaminantes presentes. Temperatura, características y concentración de los
contaminantes, humedad, tipo de suelo, edad de la contaminación, entre otros, son factores clave para
un tratamiento exitoso.
Un factor que también se debe tomar en cuenta, son los microorganismos autóctonos del suelo
contaminado. En algunos casos puede existir competencia (Bhandari et al., 2007; Rigas et al., 2007),
logrando mejores tasas de biodegradación sin la presencia de hongos (Canet et al., 2001). En otros casos
el uso de hongos y bacterias puede producir efectos simbióticos mejorando el resultado de la
biorremediación, como es el caso de la biodegradación de diesel por consorcios de bacterias y hongos
(Mancera-López et al., 2008).
La competencia con bacterias del suelo y la toxicidad de los contaminantes impide el
crecimiento de los hongos en suelos contaminados (Meysami & Baheri, 2003). La principal razón es que
los hongos de pudrición blanca se multiplican a tasas menores que las bacterias (Gao et al., 2008). Como
resultado, los hongos de pudrición blanca dejan de desarrollarse, reduciendo su capacidad degradativa.
La degradación de compuestos orgánicos es generalmente el resultado de la acción de
comunidades de distintos microorganismos que realizan la catálisis (degradación) del contaminante
(Hughes et al., 2007; Mancera-López et al., 2008). Los consorcios logran la biodegradación de
contaminantes debido a procesos enzimáticos y no enzimáticos que llevan a cabo los distintos
microorganismos. Las investigaciones de consorcios biológicos se pueden enfocar a la búsqueda de
mayores tasas de degradación gracias a la utilización conjunta de bacterias y hongos. Además del

17
aumento de la velocidad de degradación, se busca incrementar la extensión del crecimiento de los
hongos y bacterias, además de su tolerancia a altos niveles de contaminantes (Canet et al., 2001).
Un paso importante para el éxito de la biorremediación empleando hongos es la colonización
del suelo contaminado. Por eso se debe comprender y cuantificar su crecimiento en ensayos piloto y de
laboratorio, de modo de reducir la imprecisión de cuantificaciones en ambientes marcadamente
heterogéneos (Rigas et al., 2007).
Estudios de biodegradación de alcanos y petróleo crudo como fuentes de carbono y energía de
hongos degradadores, han mostrado ser efectivos en la mineralización de estos compuestos (Elshafie et
al., 2007). Igual que las bacterias, los hongos presentan mayor dificultad para biodegradar
hidrocarburos aromáticos (Canet et al., 2001), frente a una mayor facilidad de asimilación y degradación
de hidrocarburos alifáticos (Chaillan et al., 2004). Estudios adicionales han mostrado que diversos
hidrocarburos aromáticos pueden inhibir el crecimiento microbiano más que los hidrocarburos alifáticos
(Hughes et al., 2007).
Algunos hongos pueden poseer diversas rutas degradativas para el metabolismo de compuestos
aromáticos. Otros, por su parte, pueden poseer rutas específicas para la degradación de compuestos
lineales. Se tiene que buscar, en base a la identificación de las enzimas que utilizan, las especies de
hongos más idóneos para la eliminación –parcial o total- del contaminante objetivo. Por tanto, la
composición y concentración del contaminante determinara la especie de hongo a utilizar en un
tratamiento determinado (Elshafie et al., 2007).
El uso de hongos de pudrición blanca ha demostrado gran eficiencia en la descontaminación de
compuestos xenobióticos. Se ha mostrado que ciertos hongos de pudrición blanca tienen una alta
habilidad de biodegradación de contaminantes orgánicos gracias a la utilización de sus enzimas
extracelulares (LiP, MnP, Lac). La producción de estas enzimas depende de la constitución genética del
hongo y de las condiciones ambientales (Bhandari et al., 2007). En el caso de los hongos de pudrición
blanca, referido a los PAH, se ha logrado la biodegradación de compuestos de un rango amplio de anillos
(de 2 a 7 anillos) (Silva et al., 2009).
La biorremediación con hongos está sujeta, como también aquella que emplea otros
microorganismos, a la temperatura del medio, la humedad del suelo y del ambiente, las condiciones y
pH del suelo, la disponibilidad del agua, el estado nutricional y los niveles de oxígeno. Por eso mismo la
variación del crecimiento de los hongos de pudrición blanca y la producción de enzimas extracelulares
para biodegradación de los contaminantes no siempre puede ser óptima debido a todas las variables

18
involucradas. También se debe tomar en cuenta que existen contaminantes que son muy resistentes a la
degradación por parte de los hongos de pudrición blanca.
Además existe otro problema para el uso de hongos. Es conocida la producción de metabolitos
ácidos, logrando el descenso del pH del medio donde se encuentran estos organismos. Esto produce la
reducción de la tasa de biodegradación (Ellouze et al., 2008).
También los hongos tienen la habilidad de producir diferentes vías metabólicas dependiendo del
medio (de cultivo) en el cual se encuentran. Por ello la presencia (o ausencia) de ciertos compuestos o
contaminantes puede crear distintas rutas de degradación.
Un punto importante a considerar es que las altas concentraciones de oxígeno aumentan la
degradación de la lignina a través de la producción de peróxido de hidrogeno como el oxidante
extracelular y la posterior acción de la actividad enzimática lignolítica (Sánchez, 2009). Por ello la
utilización de altas concentraciones de oxígeno en sitios de biorremediación por hongos podría ser una
opción para aumentar las tasas de degradación de contaminantes.
Cuando se degrada un contaminante se crean nuevos compuestos a partir de este. Estos
productos metabólicos, creados por la acción enzimática de los hongos, pueden ser considerados
contaminantes en algunos casos, logrando efectos inhibitorios para el crecimiento y multiplicación de
los hongos. La acumulación de estos inhibidores en condiciones naturales es disminuida por
microorganismos especializados para la degradación de estos compuestos, que los hongos no lograron
biodegradar (Awe et al., 2008). Esto hace que la biodegradación de compuestos orgánicos empleando
monoespecies de hongos presente limitaciones prácticas asociadas a la pérdida de simbiosis con otros
microorganismos presentes en suelos.
A pesar de los problemas ya identificados para el crecimiento sostenido de hongos en sistemas
de biorremediación, la no especificidad enzimática que presentan los hongos de pudrición blanca hace
que su aplicación tecnológica para biorremediar sitios contaminados, resulte muy atractiva. Debido a
esto, conocer en detalle sobre la micorremediación ocupando hongos de pudrición blanca es importante
para la investigación porque entregó las bases para el análisis de los resultados del crecimiento de
Penicillium purpurogenum ante los distintos contaminantes orgánicos.

19
 7. Agentes Fungicidas, Fungistáticos y Drogas Antifúngicas

A pesar de la gran resistencia de los hongos gracias a su habilidad de formar esporas altamente
resistentes a una gran diversidad de factores ambientales (frío, calor, falta de agua, radiación solar),
existen ciertos compuestos químicos que logran reducir y hasta eliminar su presencia bajo ciertas
condiciones. Estos compuestos son relevantes para la salud humana, constituyendo una medida de
control para evitar la propagación de distintos tipos de hongos que pudieran resulta patógeno.
Como los hongos son microorganismos eucariontes, gran parte de su metabolismo celular es
parecido a los animales y humanos. A pesar de esto, algunas drogas se han desarrollado para ser tóxicas
sólo para los hongos ya que atacan sólo estructuras o funciones metabólicas fúngicas.
El ergosterol está presente en las membranas de los hongos y reemplaza el colesterol; de esta
forma, se pueden encontrar dos grupos de antifúngicos que puedan funcionar ya que interactúan con el
ergosterol o inhiben su síntesis. El primer grupo corresponde a los polienos, que se unen al ergosterol
perturbando la función de la membrana, logrando su permeabilidad y muerte celular. El segundo grupo
serían los azoles y las alilaminas, que son agentes sintéticos que inhiben selectivamente la biosíntesis de
ergosterol, logrando el daño de la membrana y la alteración de los transportadores activos en ella
(Madigan et al., 2006).
La quitina (polímero de n-acetil glucosamina) se encuentra sólo en hongos e insectos; es por ello
que el uso de polioxinas interfiere con la formación de quitina, esencial para la pared celular de estos
microorganismos (Madigan et al., 1999).
Otros ejemplos de agentes antifúngicos se pueden ver en la Tabla 7.1.

Tabla 7.1. Sitios de acción de agentes químicos antifúngicos

(Madigan et al., 1999).
Agente Antifúngico Sitios de Acción
Griseofulvina Formación de microtúbulos.
Alilaminas Síntesis de ergosterol
Polioxinas Síntesis de pared celular
Polienos Funciones de membrana
5-Fluorocitosina Síntesis de ácidos nucleícos

Dentro de los compuestos que inhiben el desarrollo fúngico se encuentra el furfural, que es un
aldehído aromático. Dentro de sus utilizaciones industriales se ocupa como base química para
fungicidas. El furfural afecta el crecimiento de un gran espectro de microorganismos (Szengyel & Zacchi,

20
2000; Modig et al., 2002) atacando a especies como las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida
tropicalis (Banerjee, 1981).
En Candida tropicalis inhibe la síntesis de proteínas y de RNA, impidiendo su crecimiento. En el
caso de Saccharomyces cerevisiae el furfural inhibe la actividad enzimática de enzimas glucolíticos,
especialmente las deshidrogenasas (triosafosfato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa), inhibiendo
el crecimiento es esta levadura (Banerjee, 1981).
Para ampliar el conocimiento de inhibición de los microorganismos en la presente memoria se
registró el comportamiento de Penicillium purpurogenum ante distintas concentraciones de furfural,
con el propósito de evaluar su tolerancia y nivel de inhibición (crecimiento y enzimático) ante este
compuesto. Para investigaciones posteriores se recomienda investigar en profundidad la inhibición por
parte de furfural a las principales enzimas de Penicillium purpurogenum.

21
 8. Materiales y Métodos

Para el desarrollo de la presente memoria se consideró una serie de experiencias que lograron
una correcta investigación y obtención de los objetivos planteados. Inicialmente, se realizó una revisión
bibliográfica en bases de datos especializadas respecto a hongos de pudrición blanca ocupados en
biorremediación de suelos junto a sus características metabólicas y degradativas.
Posteriormente, se realizó una serie de experiencias que buscaban encontrar hongos de
pudrición blanca que se adaptaran a contaminantes orgánicos, presentando tolerancia a distintas
concentraciones. Los hongos que lograron los mejores crecimientos se identificaron genéticamente.
Los hongos identificados se cultivaron en medio agar con distintas concentraciones de
contaminantes orgánicos seleccionados, logrando observar su resistencia, características y crecimiento.

8.1 Experiencia A. Crecimiento hongos contenidos en turba vegetal magallánica sin presencia de
contaminantes orgánicos (11/12/2009).

Para este experimento se utilizó turba vegetal de la región de Magallanes marca Peat Moss
(turba fina). Para el crecimiento de los hongos se utilizó medio de cultivo PDA (potato dextrose agar);
200 gr/L papas peladas y molidas, 20 gr/L dextrosa, 15 gr/L agar).

1. Los hongos proceden de una turba utilizada previamente en la biorremediación de sitios

contaminados con petróleo en Tierra del Fuego, Chile. Se cree que la turba tiene esporas
conservadas de hongos degradadores de moléculas orgánicas complejas. Para su cultivo inicial
se colocaron 0.35 g de turba en placas de Petri en solución de agua con dextrosa.
2. Las placas se cultivaron por 15 días, lográndose la formación de hongos de pudrición blanca. Los
cultivos se mantuvieron a una temperatura de 28±2°C, en un ambiente obscuro y a humedad
constante (37±2%).
3. Luego se preparó solución de PDA calentándola en autoclave por 45 minutos, a una temperatura
de 120±2°C.
4. Posterior al autoclave, cuando la solución de PDA bajó de los 50°C se añadió 1 g/L cloranfenicol
(otra opción es estreptomicina o penicilina) para evitar el crecimiento de otros

22
 microorganismos, ya que actúa como antibiótico. Además, se agregó ácido láctico para llevar el
pH hasta 4.9.1
5. La solución obtenida se vació en placas de Petri y se esperó hasta que gelificaron.
6. Se subcultivaron los distintos hongos a temperatura ambiente, o sea 28±2°C (otra opción es
utilizar incubadora entre 25-30°C). Las muestras iniciales de hongos obtenidas a partir de las
muestras de turba vegetal Magallánica se conservaron en refrigerador (4ºC). Las colonias se
purificaron mediante 3 subcultivos sucesivos en el mismo medio.
7. Las placas con las colonias puras fueron incubadas a 28±2°C hasta que se observó esporulación
en la mayoría de la placa.
8. Paralelamente se siguieron dos placas controles expuestas brevemente (3 minutos) al ambiente
del laboratorio para establecer posibles contaminaciones con hongos ambientales.
9. Todas las muestras se hidrataron frecuentemente rociando agua. Pasado los 19 días (30
Diciembre 2009), se observó crecimiento en todos los cultivos con PDA.

8.2 Experiencia B. Cultivo de hongos tolerantes a contaminantes (06/01/2010).

1. Se utilizó turba vegetal de la región de Magallanes marca Peat Moss (turba fina).
2. Se preparó un medio para hongos que estén adaptados a hidrocarburos (medio HAF:
hydrocarbon-adapted fungi). Cada placa de Petri fue inoculada con 0.35 g de turba. El medio HAF

de crecimiento contenía: 0.1 gramos/L cloranfenicol, 250 mg/L cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de
fosfato de sodio (fosfato monosódico - NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio (NH4NO3). Antes que
el medio sea agregado a las placas de Petri, 0.1 g/L de n-dodecano, 1 g/L de antraceno y 10 g/L
de furfural fueron añadidos a tres lotes diferentes. Luego, en cada placa de Petri se agregaron
20 ml de cada mezcla. Los cultivos se mantuvieron a 28±2°C. Se observó crecimiento de hongos
en los distintos contaminantes.
3. Se esperó por 15 días (21 de Enero de 2010) para realizar los subcultivos y sacar muestras
fotográficas. Se roció constantemente agua para mantener la hidratación de las muestras de
hongos.

1
Para evitar el crecimiento bacteriano se acidifica el medio. Se adiciona 1 mL de acido láctico al 10% por cada 100
mL del medio; la solución no debe ser calentada después de la adición del medio, ya que hidroliza el agar
perdiendo su propiedad gelificante.

23
 4. Con las muestras de crecimiento al 21 de Enero de 2010 se realizaron subcultivos. El medio de
subcultivo contenía: 250 mg/L cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de sodio (fosfato
monosódico - NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio (NH4NO3), y 15 g/L agar. El medio de subcultivo
y los contaminantes seleccionados se mezclaron hasta formar una emulsión (21 de Enero de
2010). La elección de las concentraciones de los distintos contaminantes orgánicos de los
subcultivos radica en el mejor crecimiento de los hongos en el paso posterior. Antes que el
medio sea puesto en las placas de Petri, 10 g/L n-dodecano, 0.1 g/L antraceno y 1 g/L furfural
fueron añadidos a los distintos medios para formar una emulsión (21 de Enero de 2010). Cada
placa de Petri utilizada fue llenada con 10 ml de mezcla (emulsión). Las colonias de hongos
obtenidas se subcultivaron en el mismo medio hasta obtener colonias –en apariencia- puras.
5. Las placas fueron incubadas hasta que se observó esporulación en la mayoría de la placa
(18 de Marzo de 2010). Las placas fueron incubadas a 28±2°C para luego ser utilizadas en etapas
posteriores de caracterización genética.

8.3 Experiencia C. Cultivo de hongos en medio concentrado de n-dodecano 30 g/L (21/01/2010).

Sabiendo que en el medio de subcultivo con 10 g/L (Experiencia B) de n-dodecano las esporas de
la turba logrando existe un buen crecimiento, se realizaron 2 experiencias con una concentración mayor
del contaminante (30 g/L n-dodecano). Se utilizó turba vegetal de la región de Magallanes tipo Peat
Moss (turba fina).

1. Turba (0.35 gramos) fue agregada a las placas de Petri para luego adicionar 10 mL del medio
HAF (250 mg/L cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de sodio (fosfato monosódico -
NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio (NH4NO3), 15 g/L agar. En este caso se utilizó una
concentración de 30 g/L de n-dodecano. Los cultivos se realizaron en duplicado (Placas D1 y D2).
2. Se realizaron subcultivo de los hongos de las placas que contienen 10 g/L de n-dodecano
(Experiencia B) con 10 mL de medio HAF (250 mg/L cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de
sodio (fosfato monosódico - NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio (NH4NO3), 15 g/L agar y una
concentración de 30 g/L de n-dodecano. El cultivo se realizó por duplicado (Placas D3 y D4).
3. Las colonias de hongos obtenidas se subcultivaron en el mismo medio hasta obtener colonias
puras.

24
 4. Las placas fueron incubadas hasta que se observó esporulación en la mayoría de la placa (18 de
Marzo de 2010). La temperatura de cultivo se mantuvo a 28±2°C. Se tomaron registros
fotográficos.

8.4 Experiencia D. Caracterización genética de los cultivos de hongos contenidos en la turba

Magallánica (26/03/2010).

1. Se seleccionaron los cultivos que crecieron en presencia de n-dodecano (Experiencia B y C), ya

que presentaron menores tiempos de crecimiento y mejor desarrollo, en comparación con los
cultivos que contenían antraceno y furfural.
2. Es importante recordar que cada una de las placas, en esta experiencia o en las otras, donde se
evidenció crecimiento de hongos, fueron conservadas en frío, por lo que ninguna muestra fue
desechada, posibilitando estudios posteriores.
3. El medio de subcultivo contenía: 250 mg/L cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de sodio
(fosfato monosódico - NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio (NH4NO3), 15 g/L agar, 0.1 g/L de
cloranfenicol (medio crecimiento radial - MCR). Antes que el medio fuera vertido en las placas
de Petri, 10 g/L n-dodecano, 1 g/L furfural y 0.1 g/L antraceno fueron añadidos a los distintos
medios para formar una emulsión. Se añadieron 20 mL a cada placa de Petri. Las placas fueron
incubadas hasta el día 6 de abril de 2010.
4. Posteriormente se realizó una caracterización genética (Facultad de Ciencias Biológicas, PUC,
Departamento Genética Molecular y Microbiología, Laboratorio de Bioquímica) utilizando la
secuenciación de nucleótidos del rRNA 18S (Ma et al., 2005). Para ello se escogieron las
muestras de hongos que presentaron el mejor crecimiento y/o tolerancia a los contaminantes
orgánicos empleados. En este caso, nuevamente los hongos que crecieron en n-dodecano
fueron los utilizados. Se construyó el árbol filogenético de las muestras seleccionadas.

8.5 Experiencia E. Crecimiento radial. Características macroscópicas y microscópicas (10/06/2010).

De los tres hongos identificados genéticamente se seleccionó el hongo Penicillium

purpurogenum. Se utilizaron múltiples placas con medio con diversas concentraciones de orgánicos
contaminantes (n-dodecano, antraceno y furfural). La máxima extensión de las placas de Petri es de 9.7
cm.

25
 1. Se prepararon medios HAF para hongos adaptados a los hidrocarburos contaminantes
utilizados. Antes que el MCR fuera vertido en las placas de Petri, 10 g/L, 20 g/L, 40 g/L de n-
dodecano, 0.1 g/L, 1 g/L, 2 g/L de antraceno y 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L de furfural fueron añadidos al
medio base. A cada placa se vertieron 20 mL de medio. Los cultivos se mantuvieron a 25±1°C.
Los experimentos fueron realizados en triplicado.
2. Para el control positivo se realizó una solución con 20 g/L de glucosa, 250 mg/L cloruro de
potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de sodio (fosfato monosódico - NaH2PO4), 1 g/L nitrato de amonio
(NH4NO3) y 15 g/L agar. A cada placa utilizada se añadieron 20 mL. Los cultivos se mantuvieron a
25±1°C. Los experimentos fueron realizados en triplicado.
3. El control negativo fue preparado empleando 15 g/L de agar. A cada placa utilizada se añadieron
20 mL. Los cultivos se mantuvieron a 25±1°C. Los experimentos fueron realizados en triplicado.
Durante los subcultivos se registró diariamente el crecimiento radial del hongo Penicillium
purpurogenum en las placas. La experiencia finalizó el 18 de Junio de 2010.
4. Se realizó una observación de la morfología macroscópica y microscópica del hongo Penicillium
purpurogenum del control positivo. La observación macroscópica consistió en la observación
directa del patrón de crecimiento. Para la observación microscópica se llevó a cabo una tinción
al fresco de una muestra del hongo; la observación microscópica se realizó empleando una
magnificación de 40X.

8.6 Experiencia F. Inoculo (10/06/2010).

Paralelamente a la experiencia E, uno de los subcultivos de Penicillium purpurogenum fue

utilizado para la elaboración de un inoculo. Para ello:

1. Se realizaron por triplicado una serie de subcultivos de Penicillium purpurogenum en una placa
de Petri rica en glucosa, con el objetivo de fomentar un rápido crecimiento y formación de
esporas. Los cultivos se mantuvieron a 25±1°C.
2. Después de 5 días se recolectaron las esporas producidas.
3. Se preparó una solución acuosa con las esporas recolectadas. La solución contenía además 250
mg/L de cloruro de potasio (KCl), 1 g/L de fosfato de sodio (fosfato monosódico - NaH2PO4), 1
g/L nitrato de amonio (NH4NO3), y 10 g/L de n-dodecano.

26
 4. La solución se agitó constantemente durante 30 días, empleando un agitador magnético. La
solución con esporas se mantuvo a una temperatura ambiente de 25±1°C El recipiente se
mantuvo sellado en todo momento para evitar su contaminación con otros microorganismos
ambientales.
5. Después de un mes aproximadamente (9 de julio de 2010) se dio por finalizada la preparación
del inóculo para ser utilizado sobre suelo contaminado con hidrocarburos.

8.7 Experiencia G. Cultivo sobre tierra contaminada con petróleo diesel (09/07/2010):

El objetivo de esta experiencia fue apreciar la resistencia del hongo caracterizado dentro de
condiciones de tierra contaminada tomada de sitios actualmente contaminados de las fosas de ENAP en
Tierra del Fuego.

1. De las fosas de ENAP en Tierra del Fuego se extrajeron muestra de suelo contaminados con
petróleo crudo.
2. El inóculo de esporas producido en la Experiencia F fue esparcido sobre una serie de muestras
de tierra contaminada con petróleo diesel. Para la proliferación del hongo sobre la tierra
contaminada se utilizaron recipientes con un área horizontal que permita una apreciación
cualitativa del crecimiento. También se utilizaron placas de Petri, con muestra de tierra
contaminada, inoculada por aspersión. Se registró el crecimiento de forma periódica (2 veces al
día).
3. Los cultivos de los hongos en la tierra contaminada se mantuvieron a una temperatura de
25±1°C.
4. Las muestras se hidrataron constantemente, para facilitar el crecimiento de los hongos en la
tierra contaminada.
5. Se apreció el crecimiento horizontal y en profundidad. Se tomaron registros fotográficos. La
experiencia finalizó el 2 de Agosto de 2010.

27
 9. Resultados

9.1 Experiencia A.

Al agregar 0.35 gramos de turba a una solución de agua con dextrosa, se apreció el crecimiento
de distintos hongos en las diferentes placas de Petri ensayadas (Anexo A). Posteriormente se preparó
una solución de PDA, donde se subcultivaron los distintos hongos. Pasado el tiempo de crecimiento
establecido (19 días), se logró apreciar el crecimiento de hongos de una forma más clara (Anexo A).
Apreciando las características macroscópicas de los hongos (en la turba y posterior subcultivo),
se observó un crecimiento inicial de hifas de color blanco, para finalizar con la producción de esporas
verdes. Generalmente este comportamiento se atribuye al género fúngico Penicillium.

9.2 Experiencia B.

El crecimiento de los hongos en el medio con turba (Anexo B) se registró en forma cualitativa a
través de la presencia (crecimiento) en las distintas placas:

1º Resultado Crecimiento (21 de Enero de 2010):

Placas 01, 02, 03: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 04, 05, 06: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 1.0 g/L No Crecimiento
Placas 07, 08, 09: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 10 g/L Crecimiento Leve (B)2
Placas 10, 11, 12: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 13, 14, 15: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 1.0 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 16, 17, 18: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 10 g/L No Crecimiento
Placas 19, 20, 21: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 0.1 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 22, 23, 24: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 1.0 g/L No Crecimiento
Placas 25, 26, 27: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 10 g/L No Crecimiento

2º Resultado Crecimiento (28 de Enero de 2010):

Placas 01, 02, 03: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 04, 05, 06: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 1.0 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 07, 08, 09: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 10 g/L Crecimiento Leve (V)3
Placas 10, 11, 12: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 13, 14, 15: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 1.0 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 16, 17, 18: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 10 g/L No Crecimiento
Placas 19, 20, 21: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 0.1 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 22, 23, 24: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 1.0 g/L No Crecimiento
Placas 25, 26, 27: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 10 g/L No Crecimiento

2
(B) Crecimiento de hifas de color blanco en sectores de la placa.
3
(V) Producción de esporas (color verde) por parte de los hongos

28
3º Resultado Crecimiento (17 de Marzo de 2010)

Placas 01, 02, 03: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 04, 05, 06: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 1.0 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 07, 08, 09: Solución HAF + 0.35 g Turba + n-dodecano 10 g/L Crecimiento Leve (V, B)
Placas 10, 11, 12: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 0.1 g/L No Crecimiento
Placas 13, 14, 15: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 1.0 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 16, 17, 18: Solución HAF + 0.35 g Turba + Furfural 10 g/L Crecimiento Leve (B)
Placas 19, 20, 21: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 0.1 g/L Crecimiento (B)
Placas 22, 23, 24: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 1.0 g/L No Crecimiento
Placas 25, 26, 27: Solución HAF + 0.35 g Turba + Antraceno 10 g/L Crecimiento Leve (B)

El mejor crecimiento de los distintos hongos de las muestras con turba corresponden a las
concentraciones de contaminantes orgánicos de 10 g/L n-dodecano, 0.1 g/L antraceno y 1 g/L furfural.
Bajo estas concentraciones se realizaron los subcultivos correspondientes. Como se mencionó
anteriormente, la selección de las concentraciones de los distintos contaminantes orgánicos de los
subcultivos radicó en el mejor crecimiento de los hongos en el paso anterior.
El crecimiento de los subcultivos se llevó a cabo con normalidad logrando un desarrollo
apreciable en todas las placas suplementadas con contaminantes (Anexo B), pero con distintos niveles
de desarrollo. Dentro del crecimiento de los distintos contaminantes, se eligió para su próxima
caracterización genética los hongos que crecieron en el medio con n-dodecano, principalmente porque
en este caso se logró el mejor crecimiento de hifas y esporas en el menor periodo de tiempo. Estos
subcultivos en n-dodecano fueron posteriormente utilizados para su caracterización genética.
Por las características macroscópicas (Anexo B), nuevamente se cree que los hongos presentes
en las placas con turba y de subcultivo correspondes al género Penicillium.

9.3 Experiencia C.

El mejor crecimiento de los hongos se observó en las muestras con n-dodecano (Experiencia B),
por lo que se realizó una prueba a una mayor concentración que las utilizadas en las experiencias
anteriores.
El objetivo de la Experiencia C fue aumentar el rango de concentración del contaminante que
mostró mejores resultados de crecimiento. Se logró el crecimiento de hongos en los subcultivos, como
también en las placas con turba y n-dodecano (Anexo C).

29
 9.4 Experiencia D.

La caracterización genética permitió identificar tres especies de hongos de pudrición blanca del
genero Penicillium: Penicillium varibiale, Penicillium rugulosum y Penicillium purpurogenum (Figura
9.4.1Figura 9.4.1).

Figura 9.4.1. Árbol filogenético de los hongos que crecieron en agar con 10 g/L n-dodecano. La
caracterización genética logró identificar 3 hongos del genero Penicillium; el desarrollo del árbol
logra diferenciar tres hongos: P. varibiale, P. rugulosum y P. purpurogenum.

9.5 Experiencia E.

En las primeras horas, posterior al subcultivo, se apreció un crecimiento leve de hifas (de color
blanco) en las placas del control positivo, n-dodecano y antraceno. Las hifas de estos cultivos no se
podían apreciar muy nítidamente, pero al segundo día ya era más fácil observar el crecimiento del
hongo Penicillium purpurogenum. En el caso de las placas del control negativo el crecimiento fue

30
realmente bajo (sólo para una muestra de tres) y para todas las concentraciones de furfural el
crecimiento del hongo fue nulo.
Al tercer día se observó un crecimiento leve de todas las muestras del control negativo y para la
concentración de 5 g/L de furfural. Para las demás concentraciones de furfural no se observó
crecimiento alguno. En el caso del control positivo, n-dodecano y antraceno se observó un crecimiento
ya intensificado y un notorio esparcimiento por la placa.
Para el quinto día comenzó la formación de esporas (color verde) para todas las muestras del
control positivo, n-dodecano y antraceno. Por otra parte, se mantuvo un crecimiento leve por parte del
cultivo en los 5 g/L de furfural y en el control negativo. En las otras concentraciones de furfural no se
apreció crecimiento.
Sólo al sexto día se observó la formación de esporas en el control negativo, mientras que los
hongos que crecían en el control positivo, n-dodecano y antraceno mostraron esporas en toda su área
de crecimiento (ver Anexo D para un registro fotográfico completo).
Se presentan a continuación las tasas de crecimiento del hongo ante distintas concentraciones
de los contaminantes seleccionados. Las experiencias se realizaron por triplicado para cada una de las
experiencias. También se presentan las desviaciones estándar para cada punto.

14

12

10

8
mm/horas

Control Positivo

6 Control Negativo

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.1. Crecimiento radial de Penicillium purpurogenum para los controles positivos y negativos. Las velocidades de
crecimiento del hongo en el control positivo son siempre superiores a las de control negativo. La presencia de glucosa en el
control positivo logró mayores velocidades de crecimiento.

31
 14

12

10
mm/horas

Control Positivo
8
Control Negativo
6 Furfural 1 g/L
Furfural 5 g/L
4 Furfural 10 g/L

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.2. Crecimiento radial para distintas concentraciones de furfural en comparación a los controles positivos y
negativos. Cuando las concentraciones de furfural eran de 1 y 10 g/L el hongo Penicillium purpurogenum no presentó
crecimiento.

14

12

10
mm/horas

8 Control Positivo

6 Control Negativo

4 Dodecano 10 g/L

0
0 20 40 60 80 100
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.3. Crecimiento radial en 10 g/L n-dodecano en comparación a los controles positivos y negativos. Las velocidad
de crecimiento de los hongos en el medio con 10 g/L n-dodecano alcanza valores levemente inferiores a los del control
positivo al tercer día.

32
 16

14

12
mm/horas

10
Control Positivo
8

6 Control Negativo

4 Dodecano 20 g/L

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.4. Crecimiento radial en 20 g/L n-dodecano en comparación a los controles positivos y negativos. Al tercer día la
velocidad de crecimiento del hongo alcanza valores superiores al control negativo.

16

14

12
mm/horas

10
Control Positivo
8

6 Control Negativo

4 Dodecano 40 g/L

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.5. Crecimiento radial en 40 g/L n-dodecano en comparación a los controles positivos y negativos. El hongo
presentó en todas las concentraciones de n-dodecano velocidades de crecimiento muy superiores al control negativo,
logrando superar en algunos puntos al control positivo.

33
 14

12

10
mm/horas

8 Control Positivo

6 Control Negativo

4 Antraceno 0.1
g/L
2

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.6. Crecimiento radial en 0.1 g/L antraceno en comparación a los controles positivos y negativos. La velocidad de
crecimiento de los hongos en el medio con 0.1 g/L antraceno se mantuvieron entre el control positivo y control negativo.

14

12

10
mm/horas

8
Control Positivo
6
Control Negativo
4 Antraceno 1 g/L

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.1. Crecimiento radial en 1 g/L antraceno en comparación a los controles positivos y negativos. Al tercer día la
velocidad de crecimiento del hongo en el medio con 1 g/L de antraceno presenta un valor mayor que con 0.1 g/L de
antraceno

34
 14

12

10
mm/horas

8
Control Positivo
6
Control Negativo
4
Atraceno 2 g/L

0
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
Gráfico 9.5.2. Crecimiento Radial en 2 g/L antraceno en comparación a los controles positivos y negativos.
n De las tres
concentraciones de antraceno en MCR, P. purpurogenum presentó las mayores velocidad de crecimiento con la
concentración de 2 g/L de antraceno.

A las 62 horas de crecimiento cada una de llas

as experiencias se encontraba en su máximo
crecimiento radial o en un periodo de estabilización de crecimiento (pendiente cercana a cero).
cero) Para
poder apreciar las diferencias entre las distintas concentraciones
concentraciones y contaminantes se graficó el
crecimiento radial del hongo Penicillium purpurogenum a las 62 horas de iniciada la experiencia. La idea
es poder mostrar el comportamiento en un punto del tiempo donde se puedan ver diferencias del
comportamiento del crecimiento ante distintas condiciones.

16
14
12
1Control Positivo
10
mm/hr

2Control Negativo
8
6 4Furfural
4
6n-dodecano
2
10
Antraceno
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Gráfico 9.5.9.. Crecimiento radial del hongo P. purpurogenum a 62 horas ante distintos contaminantes variando sus
concentraciones. (1) Control positivo, (2) Control negativo, (3) 1 g/L furfural, (4) 5 g/L furfural, (5) 10 g/L furfural, (6) 10 g/L n-
dodecano, (7) 20 g/L n-dodecano,
odecano, (8) 40 g/L n-dodecano,
odecano, (9) 0.1 g/L Antraceno, (10) 1 g/L Antraceno, (11) 2 g/L Antraceno.

35
 En el caso de las características macroscópicas, se pudo apreciar desde la parte superior de las
placas el crecimiento de un “césped” de color de hifa blanco. Pasado el tiempo se formaron esporas de
color verde, con una textura superficial aterciopelada. Las Figura 9.5.1 y Figura 9.5.2 muestran las
características microscópicas observadas para Penicillium purpurogenum.

Conidios
Métula
Fiálide

Figura 9.5.1. Se aprecia las estructuras de la métula, fiálides y conidios.

Hifa

Conidióforo

Figura 9.5.2. Es posible observar las estructuras de hifas y conidióforo.

36
 9.6 Experiencia F.

El inóculo presentó el crecimiento de una capa de Penicillium purpurogenum en la parte

superior de la solución a pesar de la constante acción del agitador magnético. También se pudo apreciar
que la capa superior insoluble de n-dodecano fue desapareciendo mientras se formaban esporas verdes.
Además se observó un marcado aumento de la turbidez producto del aumento de la biomasa fúngica
(Anexo E). A medida que pasan los días la solución se volvió más densa y de un color más obscuro
(considerando que inicialmente era de color verde.

9.7 Experiencia G.

Se formaron colonias del hongo Penicillium purpurogenum; en un principio sólo crecen

pequeñas formaciones de hifas, muy difíciles de percibir a simple vista; pero pasado el tiempo se logró
observar un crecimiento radial como también una penetración de aproximadamente 0.5 cm desde la
superficie de la tierras contaminada en las placas de Petri utilizadas (Anexo F).

37
10 Análisis y Discusión

9.1 Experiencia A.

Para la biorremediación es importante conocer las características del suelo (ambientales), del
contaminante y los organismos vivos (plantas, bacterias, hongos, etc.) presentes en el sitio y el potencial
metabólico para la degradación del compuesto de interés (Volke et al. 2005). Debido a esto, la presencia
de una capa de hongos de pudrición blanca en la parte superior de pilas de biorremediación en Tierra
del Fuego hacía sospechar la presencia de esporas de especies ya sea tolerantes a los contaminantes o
que pueden utilizar el contaminante como fuente de carbono y energía; especies que debían estar
presentes en la turba vegetal utilizada como agente abultante.
La turba es un agente abultante ligero que entrega un considerable espacio libre cuando se
mezcla con suelos contaminados (Meysami & Baheri, 2003). La turba es formada por la fosilización
parcial de materia orgánica de plantas en marismas, conteniendo generalmente lignina y celulosa,
logrando una materia compleja (Sáez-Navarrete et al., 2008).
La otra opción, era que la germinación de hongos proviniera directamente del medio ambiente,
pero la gran cantidad de crecimiento sobre las pilas hacía sospechar que el medio abultante (turba) era
la que poseía esporas, que ante la presencia de humedad, temperatura adecuada y una fuente de
nutrientes, podía establecerse y crecer.
La presencia de hongos en las pilas de biorremediación mostraba un nivel de tolerancia a los
tóxicos presentes en el suelo, lo que no implicaba necesariamente que estos microorganismos se
nutrieran de los contaminantes orgánicos presentes. Existía la duda respecto de de dónde los hongos
obtenían los nutrientes (¿contaminantes orgánicos, material orgánico normal del suelo y la turba, o de
ambos?).
Para el cultivo inicial (ocupando la solución de dextrosa) y los posteriores subcultivos (ocupando
PDA) se emplearon soluciones donde el contenido de carbono y nutrientes es de fácil acceso para los
hongos, de modo de facilitar y acelerar el crecimiento. La presencia de hongos en las placas al agregar
solución de dextrosa, indicó la presencia de esporas en la turba, pero no presenta evidencias que
permitan inferir que puedan crecer en un medio con contaminantes orgánicos.
Para asegurar sólo el crecimiento de los hongos y no de otros microorganismos, como bacterias
degradadoras, las soluciones y el medio agar fueron producidas a pH ácido utilizando ácido láctico.
Además, el uso del antibiótico cloranfenicol aseguraba la erradicación de bacterias, logrando el
crecimiento exclusivo de hongos.

38
 El uso de ácido láctico en la solución de PDA buscaba obtener un pH ácido, mejorando el
crecimiento de los hongos en los distintos subcultivos. Cada microorganismo tiene un rango de pH
óptimo para su crecimiento y proliferación. Este valor de pH está muy bien definido gracias a una gran
cantidad de investigaciones realizadas. En la mayoría de los ambientes naturales el pH es 5.9 y la
mayoría de los microorganismos (como la mayoría de las bacterias) han logrado evolucionar para que
este sea su pH óptimo de crecimiento. El caso de los hongos es distinto ya que crecen óptimamente a pH
5 e incluso a pHs inferiores (Madigan et al., 1999).
Aunque el crecimiento de los hongos se realizó a un pH ácido (Gao et al., 2008), se debe
mencionar que independiente de las condiciones externas, el pH interno (intracelular) de todos los
microorganismos se mantiene en la neutralidad variando a lo más entre 1 y 1.5 unidades de pH
(Madigan et al., 1999). Esta neutralidad intracelular impide la destrucción de macromoléculas de interés
y organelos celulares necesarios para la vida de todo organismo.
Al observar crecimiento de hongos de pudrición blanca sobre la turba, es importante mencionar
que la biodegradación de la lignina es parte fundamental para su humificación y la liberación de
nutrientes y otros compuestos orgánicos para otros microorganismos (López et al., 2006). La habilidad
de degradar lignina de los hongos de pudrición blanca es un mecanismo complicado (Gao et al., 2008),
pero es una habilidad que ha sido altamente estudiada para la biorremediación de suelos contaminados
con hidrocarburos complejos (Bhandari et al., 2007).
De esta forma, al agregar una fuente de carbono de fácil acceso, más las condiciones
ambientales (humedad, temperatura, pH óptimo), se logró que a partir de la turba (que contenía
esporas) se pudiera obtener crecimiento exclusivo de hongos y realizar posteriores subcultivos.

9.2 Experiencia B.

Para el crecimiento, identificación y posteriores estudios biocinéticos de microorganismos que

degradan exclusivamente hidrocarburos, se utilizó medio de cultivo selectivo HAF (hydrocarbon-
adapted fungi).
Es necesario que los hongos logren adaptarse a las condiciones necesarias para poder degradar
más eficientemente los contaminantes orgánicos (Mancera-López et al., 2008). La utilización de este
medio junto a la turba implica favorecer el crecimiento de hongos que puedan tolerar la toxicidad del
contaminante a cierta concentración predeterminada en base a las características del compuesto

39
orgánico modelo a utilizar; de tal forma cada hongo que logre crecer de su espora,
espora pueda adaptarse y
tolerar mejor el contaminante
taminante a medida que pase de una generación a otra.
Las esporas presentes en la turba pudieron germinar a pesar de la presencia de los
contaminantes orgánicos utilizados.
utilizados. Es importante mantener una temperatura adecuada y constante en
toda la experiencia. Laa utilización de cloranfenicol (eliminando bacterias) y la hidratación constante de
las muestras lograron mejorar las condiciones de cultivos de hongos procedentes de la turba vegetal
empleada.
Brevemente se describirán los contaminantes orgánicos utilizados
izados en el medio HAF.
HAF El n-
dodecano (Figura 10.2.1) es un hidrocarburo que por su estructura lineal puede suponerse
suponer de fácil
ruptura mediada por enzimas extracelulares de los hongos. Su longitud
ongitud podría provocar un cierto grado
de impedimento estérico, aunque
nque este efecto requiere su comparación con compuestos lineales
alifáticos de menor peso molecular.

Figura 10.2.1
2.1 Estructura lineal del n-dodecano,
dodecano, perteneciente a los alcanos. Su formula química es C12H26.

El furfural (Figura
Figura 10.2.1
10.2.1) es un compuesto aromático aldehído base para pesticidas. Además, el
furfural inhibe algunas enzimas de levaduras (Modig et al., 2002),, un tipo de hongo unicelular.

Figura 10.2.2. Furfural es un compuesto con anillo y formula química C5H4O2

El antraceno es un hidrocarburo
hidrocarb aromático policíclicos considerado como uno de los 16 PAH de
mayor importancia por su peligro al medio ambiente (Mancera-López et al.,, 2008).
2008) El uso de hongos de
pudrición blanca es una oportunidad para remover este compuesto recalcitrante de sitios
contaminados.

Figura 10.2.3.. Antraceno es un contaminante de 3 anillos altamente recalcitrante.

40
 A la turba en las placas de Petri se les añadió antraceno, n-dodecano y furfural en distintas
concentraciones (0.1 g/L, 1.0 g/L y 10 g/L). Estos valores tienen como propósito encontrar
concentraciones adecuadas que no afecten la germinación y crecimiento de los hongos. Asegurando
buenas condiciones de crecimiento, los hongos que logren desarrollarse podrán ser caracterizados
genéticamente de manera apropiada.
Los mayores desarrollos en placas se observaron a concentraciones de 10 g/L n-dodecano, 1 g/l
furfural y 0.1 g/L antraceno. Las primeras esporas que germinaron fueron las de la placa de Petri con una
concentración de 10 g/L n-dodecano, desarrollando de forma clara hifas en distintas partes de la turba.
Transcurrido el tiempo, también se apreció el desarrollo de esporas (de color verde). Empleando
concentraciones 1 g/L furfural y 0.1 g/L antraceno se pudo apreciar un desarrollo más lento y
sectorizado en el crecimiento de las hifas. Además no se aprecia a simple vista la formación de esporas.
Estudios han demostrado que ciertos hongos filamentosos tienen la capacidad de mineralizar o
biodegradar ciertos PAH a ciertas concentraciones (Bhandari et al., 2007). El crecimiento de hongos en
0.1 g/L de antraceno indica una selección forzada de cepas de hongos con un grado de tolerancia a
antraceno.
A concentraciones de10 g/L n-dodecano, 1 g/l furfural y 0.1 g/L antraceno se presentaron las
mejores germinaciones y crecimientos de los hongos en la turba. A partir de ellos se realizaron
subcultivos en medio agar. Nuevamente el medio utilizado fue HAF, pero en esta ocasión la única fuente
de carbono empleada correspondió a los contaminantes orgánicos seleccionados. Se buscó que los
hongos que lograran desarrollarse pudieran tolerar, adaptarse y utilizar los contaminantes
seleccionados como su única fuente de carbono. Además, se pudo apreciar de mejor forma las
características macroscópicas al momento del crecimiento en las distintas placas de Petri utilizadas.
Para asegurar la biodegradación y una buena producción de biomasa es importante tener un
buen balance de nutrientes ya que son esenciales para la actividad enzimática de todo microorganismo
(Godoy-Faúndez et al., 2008). Para cumplir este propósito el medio HAF tenía que asegurar los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los hongos (cloruro de potasio, fosfato de sodio, nitrato de
amonio). Para la obtención de carbono y energía era necesario que las enzimas extracelulares de los
hongos lograran degradar los contaminantes orgánicos.
El crecimiento de los hongos en los subcultivos variaba dependiendo del contaminante y su
concentración. De todos los subcultivos, los realizados con una concentración de 10 g/L n-dodecano
fueron los que mostraron el mejor desarrollo de hifas, como también formación de esporas en un

41
periodo de tiempo más corto. De estas placas de Petri con n-dodecano se extrajeron las muestras de
hongos para su caracterización genética.
La utilización de diferentes contaminantes y concentraciones, más una serie de subcultivos tuvo
como fin poder obtener especies de hongos que lograran adquirir y tolerar a lo menos un contaminante
orgánico, para luego realizar su caracterización genética. En este punto de la investigación no se buscaba
establecer si los hongos biodegradaban a los contaminantes orgánicos seleccionados, sino más bien
caracterizarlos para poder realizar pruebas biocinéticas en cultivos puros.

9.3 Experiencia C.

En la experiencia B se apreció que ante una concentración de 10 g/L n-dodecano existía una
buena germinación y posterior crecimiento de las esporas de los hongos. Por ese motivo se realizaron
experiencias con una concentración mayor (30 g/L n-dodecano).
Gracias a esta experiencia se logró aumentar el rango de concentración de n-dodecano para el
crecimiento de hongos, como también la germinación de esporas presentes en la turba. Los resultados
fueron los esperados, obteniendo menos tiempo de crecimiento para hifas y una producción mayor de
esporas (Anexo C).
Utilizando distintas concentraciones de n-dodecano (0.1 g/L, 1 g/L, 10 g/L y 30 g/L) se puede
apreciar cualitativamente una mejora en la propagación, crecimiento de hifas y producción de esporas
en el medio agar a medida que las concentraciones van aumentando. En primera instancia, se puede
decir que los hongos presentes en la turba tienen una alta tolerancia a las distintas concentraciones de
n-dodecano y a medida que va aumentando la concentración, estos se desarrollan de mejor manera. Sin
embargo parece razonable considerar que debe existir una concentración que resulte ser toxica para
estos microorganismos.
Esta supuesta baja toxicidad del n-dodecano puede implicar que los hongos lo utilicen como
fuente de carbono y energía. La habilidad de los hongos para degradar lignina y una gran variedad de
compuestos orgánicos (colorantes (Gao et al., 2008), residuos de municiones, pesticidas,
organoclorados, bifenilos policlorados (PCB), PAH, colorantes sintéticos, conservantes de madera
(Bhandari et al., 2007)) se explica por su actividad enzimática extracelular poco especifica (López et al.,
2006). El gran poder enzimático extracelular de los hongos permitiría degradar n-dodecano hasta

42
compuestos más pequeños, mejorando la capacidad adsorbativa de estos microorganismos en el
momento de adquirir los nutrientes necesarios para su crecimiento.
Mantener una temperatura adecuada también es importante para evitar volatilización de
compuestos orgánicos y al mismo tiempo asegurar el crecimiento y actividad enzimática de los
microorganismos. Esto asegura que los hidrocarburos sean degradados y no se volatilicen (Godoy-
Faúndez et al., 2008).

9.4 Experiencia D.

Nuevamente se realizó un subcultivo, empleando los hongos de las experiencias (B y C) que

crecieron en n-dodecano, ya que presentaron el mejor desarrollo en el menor tiempo. Los subcultivos se
realizaron nuevamente en los distintos contaminantes orgánicos (antraceno, n-dodecano y furfural).
Para la caracterización genética se utilizaron los hongos que se desarrollaron en el medio con n-
dodecano, pues presentaron un mayor desarrollo.
Los hongos que lograron desarrollarse a partir de la turba inicial y los posteriores subcultivos
fueron del género Penicillium del reino Fungi. Es importante destacar los hongos Penicillium son un
género bastante extenso y se pueden encontrar en todas partes ya que son los hongos con mayor
presencia en suelos. Al ser hongos de pudrición blanca crecen generalmente sobre materia orgánica de
rápida degradación, aunque también tienen una poderosa batería de enzimas que degradan
hemicelulosa y lignina. La caracterización genética identificó tres especies distintas de hongos de
pudrición blanca: Penicillium varibiale, Penicillium rugulosum y Penicillium purpurogenum.
El descubrimiento de especies biodegradadoras de contaminantes orgánicos es de gran interés
en la biorremediación, porque implica la posibilidad de acelerar la remediación de suelos de zonas
contaminadas con altas concentraciones de hidrocarburos (Mancera-López et al., 2008).
Los géneros Penicillium y Aspergillus son los tipos de hongos más numerosos y con alta
eficiencia en la remoción de hidrocarburos (Mancera-López et al., 2008). Es importante recordar que los
hongos son organismos adsorbativos y el aceptor terminal de electrones que utilizan es el oxígeno, lo
que permitiría la oxidación de los distintos contaminantes orgánicos por parte de los hongos de
pudrición blanca. Además las enzimas extracelulares de los hongos pueden modificar su medio
ambiente, que generalmente es inaccesible al crecimiento de hifas, mejorando la eficiencia en la
biodegradación (Bhandari et al., 2007).

43
 Se seleccionó exclusivamente un hongo de los tres identificados (Penicillium purpurogenum), ya
que presentó mejor crecimiento y además existían estudios de biorremediación de suelos con
contaminantes no orgánicos. Penicillium purpurogenum es un hongo aeróbico y filamentoso de
pudrición blanca presente en los suelos.
Muchos métodos han sido estudiados para la biorremediación de metales ocupando hongos,
lamentablemente se han realizado muchas investigaciones, pero con pocas aplicaciones en campo
(Bhandari et al., 2007). Investigaciones con Penicillium purpurogenum han logrado la remoción de
cadmio, plomo, mercurio, arsénico (Say et al., 2003) y cromo (Say et al., 2004) debido al mecanismo de
biosorción de los iones de metales pesados por parte del hongo.

9.5 Experiencia E.

La utilización de n-dodecano, antraceno y furfural brindó la oportunidad de realizar estudios del

crecimiento de Penicillium purpurogenum en presencia de distintos contaminantes orgánicos.
Paralelamente se realizó una búsqueda bibliográfica en bases de datos especializados respecto al hongo
caracterizado y gracias a la existencia de una gran gama de hongos de pudrición blanca, se pudo
encontrar características que contribuyeron a sus funciones metabólicas y degradativas.
La utilización del medio HAF con los distintos contaminantes orgánicos (antraceno, n-dodecano
y furfural) buscaba que el hongo Penicillium purpurogenum pudiera nutrirse solamente de estos. Este
medio está diseñado de tal forma que la única fuente de carbono de los hongos u otros
microorganismos son los hidrocarburos. Al mismo tiempo se estudió la tolerancia de los hongos a
distintas concentraciones. La búsqueda de hongos de pudrición blanca en la turba magallánica implicaba
la verificación de la existencia de microorganismos con potencialidad de degradación de hidrocarburos
contaminantes.

El uso de glucosa en el control positivo tuvo por objeto procurar un crecimiento irrestricto del
hongo. Las características de la glucosa como fuente de carbono implican una rápida degradación y
absorción por parte de cualquier hongo. El control negativo consideró ausencia de cualquier fuente de
carbono y energía para que algún hongo pueda desarrollarse. De esta forma existe una buena
comparación al momento de observar el grado de tolerancia que tiene Penicillium purpurogenum ante
cualquier contaminante frente a la glucosa o a la falta de condiciones óptimas de crecimiento.

44
 Del Grafico 9.5.1 se aprecia que desde el inicio, el crecimiento del hongo del control positivo es
muy superior al control negativo. A pesar de mostrar crecimiento en el control negativo, se tiene que
mencionar que la presencia de hifas era de muy baja intensidad (Anexo D). Existía crecimiento, pero la
disposición y crecimiento de las hifas no mostraban un verdadero desarrollo del hongo a través de la
placa. También se tiene que considerar que en el caso del control positivo existió un crecimiento
vertical, ausente en el control negativo, ya que el poder de penetración vertical en el agar era nulo,
logrando un crecimiento exclusivamente horizontal por parte del hongo Penicillium purpurogenum.
La formación de esporas también conllevó a una diferenciación en el crecimiento de ambos
controles. En el control negativo el surgimiento de esporas fue extremadamente leve, mientras que en
el control positivo se desarrollaron sobre toda el área de las placas (Anexo D).

El desarrollo de P. purpurogenum en furfural (Gráfico 9.5.2¡Error! No se encuentra el origen de

la referencia.) mostró las peores velocidades de crecimiento. A pesar de existir un crecimiento a 5 g/L
de furfural, las otras dos concentraciones no permitieron desarrollo del hongo ni de esporas. El
desarrollo de hifas fue leve para el hongo que creció a 5 g/L furfural y no hubo producción de esporas
(Anexo D).
Estos resultados muestran muy poca tolerancia por parte de P. purpurogenum a las distintas
concentraciones de furfural. Al ser el furfural un precursor de pesticidas, la toxicidad para este hongo
resultó ser muy alta aún a bajas concentraciones. Muchos géneros de hongos de suelos (Penicillium y
Fusarium) degradan una gran variedad de pesticidas (Bhandari et al., 2007), pero este no es el caso para
P. purpurogenum. En la experiencia B se pudo apreciar el desarrollo de otros hongos, con mayor
tolerancia al contaminante; P. purpurogenum no tendría potencial para tolerar y/o biodegradar
(biorremediación) furfural, independiente de las concentraciones del contaminante orgánico empleado.
El furfural ha sido considerado tóxico para diferentes tipos de organismos, como levaduras,
bacterias (Modig et al., 2002) y hongos filamentosos (Szengyel & Zacchi, 2000). En el caso de levaduras,
el furfural inhibe la actividad de enzimas, por lo que existe la posibilidad que también pueda afectar
algunas enzimas esenciales de P. purpurogenum.
La actividad biodegradativa de los hongos de pudrición blanca va relacionada a las condiciones
ambientales y su propio código genético para la síntesis de las enzimas lignolíticas. Algunos hongos ante
ciertas condiciones pierden la actividad de LiP, Lac o MnP (Bhandari et al., 2007). Existe la posibilidad
que P. purpurogenum no lograra la síntesis de estas enzimas en la presencia de furfural, impidiendo su
degradación y/o tolerancia aun en bajas concentraciones.

45
 Como era de esperar, el desarrollo y producción de esporas del hongo P. purpurogenum en las
distintas concentraciones de n-dodecano (Gráfico 9.5.3, Gráfico 9.5.4 y Gráfico 9.5.5) fueron muy
superiores a las observadas en el control negativo. El periodo lag se extendió por aproximadamente un
día donde se observó cierta inhibición o acostumbramiento. Ya al segundo día se observaron altas tasas
de crecimiento. Se debe destacar que para las concentraciones de 20 g/L y 40 g/L de n-dodecano a las
62 horas poseían valores superiores al control positivo.
El crecimiento de P. purpurogenum en las muestras de n-dodecano va directamente relacionada
al buen poder enzimático de los hongos de pudrición blanca, logrando degradar n-dodecano hasta
compuestos más pequeños que sean adsorbidos dentro del microorganismo. Este hongo tiene la
posibilidad de degradar de forma óptima y poder adjuntar los compuestos para obtener el carbono y
energía necesarios para su desarrollo y proliferación a través del agar de las placas. Además también
existe un buen desarrollo de esporas (Anexo D), pero inferior a las obtenidas en el control positivo.

En el caso del contaminante policíclicos (antraceno), el hongo P. purpurogenum presentó un

buen crecimiento, aunque en general no mejor que las de n-dodecano o de su control positivo, pero con
mejores resultados que su control negativo (Gráfico 9.5.6, Gráfico 9.5.7 y Gráfico 9.5.8). La producción
de esporas se presentó de forma adecuada, pero en menor cantidad que el control positivo (Anexo D).
Del mismo modo que en las muestras de n-dodecano, los hongos que crecieron en antraceno mostraron
el primer día muestras de inhibición, sin embargo, ya al segundo día mostraron un aumento en su
velocidad de crecimiento.
En las tres concentraciones de antraceno el hongo mostró velocidades de crecimiento que
logran exponer una tolerancia a este contaminante. Existen evidencias de hongos Penicillium que logran
la biodegradación de PAH (Bhandari et al., 2007). Los hongos de pudrición blanca tienen un conjunto de
enzimas que logran abrir compuestos aromáticos (Mancera-López et al., 2008), lo que permitiría
hipotéticamente a P. purpurogenum poder tolerar al contaminante antraceno, logrando descomponerlo
a compuestos menos tóxicos o ocuparlos directamente como fuente de carbono y energía.
Cierta tolerancia observada en los experimentos realizados con antraceno pudieran indicar que
la batería enzimática de P. purpurogenum tienen la capacidad de degradar al contaminante orgánico,
pero no puedan degradar sus productos de degradación.
Comparando n-dodecano y antraceno, existen velocidades de crecimiento mayor en las
experiencias utilizadas con el compuesto lineal, posiblemente por una facilidad de degradación por

46
parte de las enzimas. Los subproductos de la degradación de n-dodecano también se biodegradarían con
mayor facilidad, en comparación a los subproductos de la degradación de antraceno. Esto conllevaría a
menores velocidades de crecimiento para los hongos que crecieron en antraceno.
P. purpurogenum tendría el potencial de ser ocupado para la degradación de antraceno, pero es
importante mayores investigaciones para buscar un rango de concentraciones de toxicidad y la
posibilidad real para su implementación en biorremediación ante sitios o experimentos con antraceno y
derivados.

Para apreciar las diferencias entre los distintos contaminantes y concentraciones en un periodo
de tiempo, el análisis del Gráfico 9.5.9 muestra el crecimiento radial del hongo a las 62 horas. El
desarrollo del hongo para el n-dodecano y antraceno muestran velocidades de crecimiento que
aumentan a medida que el tiempo transcurre, para llegar a un máximo o a una estabilización en sus
valores (aproximadamente a las 62 horas); posterior a este tiempo, los datos decaen.
Para el caso del furfural existe un nulo crecimiento para dos de las tres concentraciones y
presentando valores menores al control negativo. El contaminante furfural, aun en pequeñas
cantidades, muestra su toxicidad para el crecimiento de P. purpurogenum a las 62 horas; por otra parte,
el desarrollo del hongo en las distintas concentraciones de n-dodecano presentan altas velocidades de
crecimiento (dos de las tres concentraciones de n-dodecano superan los valores presentes en el control
positivo) siendo el mejor comportamiento de los tres contaminantes orgánicos utilizados. Para el
antraceno se muestra valores de crecimiento que varían entre sí, pero que se mantienen entre los
valores del control positivo y control negativo.

También se realizó un estudio de la morfología macroscópica y microscópica de este hongo con

el fin de poder diferenciar los elementos estructurales más importantes; en el caso del estudio
microscópico (Figura 9.5.1 y Figura 9.5.2), se logró observar la métula, fiálides, conidios y conidióforo,
correspondientes a las estructuras especializadas del género Penicillium. El crecimiento de los hongos se
relaciona a una diferenciación celular dentro de una macro estructura multicelular, logrando una
diferenciación en las funciones que realizan distintas secciones del cuerpo de un hongo filamentoso.
Al realizar una comparación macroscópica entre Penicillium purpurogenum con los hongos de la
primera experiencia se pueden apreciar diferencias, permitiendo dar una primera identificación más
fácil sin la necesidad de tinciones y tener una idea inicial del genero. Los hongos del género Penicillium
se diferencian por el crecimiento de esporas que adquieren el color verde (Anexo D). Para mayor detalle

47
de la especie, es necesario entrar a la estructura de forma detallada o estudios de secuenciación del
código genético de las distintas muestras de hongos.

9.6 Experiencia G.

La formación y distribución del crecimiento de los hongos fue lenta inicialmente. Pasado el
tiempo se logro la formación de colonias de Penicillium purpurogenum distribuidos en distintas partes
de los recipientes y placas de Petri (Anexo F). El crecimiento fue en la superficie de la tierra contaminada
y en algunos casos existió un poder de penetración de medio centímetro.
La promoción del crecimiento de los hongos y generación de su actividad enzimática en suelo
contaminado es más complicada en suelos sin tratamiento previo (Meysami & Baheri, 2003); para
mejorar su desempeño es necesario utilizar fertilizantes (especialmente fuentes de nitrógeno simples)
puede aumentar la biodegradación de contaminantes (Godoy-Faúndez et al., 2008), ya que el carbono lo
obtienen de los compuestos orgánicos y los nutrientes limitantes (nitrógeno) provienen de medios
externos.
La permeabilidad (facilidad o dificultad con la que un liquido puede fluir a través de un medio
permeable (Volke et al. 2005)) del suelo contaminado puede influir en el crecimiento de los hongos, ya
que una baja permeabilidad debería disminuir la efectividad de la biodegradación de los contaminantes.
Para mejorar la permeabilidad, logrando aumentar la colonización y biodegradación (en futuras
experiencias con Penicillium purpurogenum) es necesario utilizar agentes abultantes (Godoy-Faúndez et
al., 2008) como aserrín o turba vegetal, logrando mejor penetración en el crecimiento de los
microorganismos y actividad degradativa (Meysami & Baheri, 2003), ya que incrementa la aireación y
aumenta la retención de humedad del medio (Sáez-Navarrete et al., 2008). Generalmente, los medio
abultantes como turba o aserrín pueden ser adquiridos fácilmente y a un bajo costo (Sáez-Navarrete et
al., 2008), lo que es conveniente para pruebas experimentales.
El hongo demostró ser un organismo que tiene la potencialidad de tolerar las condiciones de
toxicidad en suelos contaminados reales. Es importante realizar más investigaciones para encontrar la
posibilidad de ocuparlo para experimentos en biorremediación de suelos, recordando que los hongos
tienen un gran potencial de la biodegradación de hidrocarburos debido a su poderosa actividad
enzimática lignolítica.

48
 Por otra parte el desarrollo del inoculo demostró ser efectivo para inocular muestras de tierra
contaminada, pero su uso excesivo no asegura su uso en aplicaciones a grandes escalas (Meysami &
Baheri, 2003); faltaría desarrollar la concentración óptima de los nutrientes ocupados, como las
condiciones ambientales -temperatura y humedad- (Godoy-Faúndez et al., 2008), tiempo, calidad y
cantidad del inoculo y cantidad material abultante. La misma turba utilizada en la búsqueda de hongos
de pudrición blanca podría ser utilizada como medio abultante.

49
11 Conclusiones

Los experimentos realizados lograron la identificación de tres hongos de pudrición blanca

presentes en la turba magallánica en forma de esporas. Para su identificación fueron utilizados
caracterización genética utilizando la secuenciación de nucleótidos del rRNA 18S, estudios micro y
macroscópicos.
De los tres hongos identificados, fue seleccionado Penicillium purpurogenum por mostrar en
experiencias anteriores una buena adaptabilidad, tolerancia y crecimiento en contaminantes orgánicos y
estudios de biorremediación de suelos para contaminantes no orgánicos. Es relevante mencionar que no
se han realizado estudios previos empleando Penicillium purpurogenum para la degradación de
contaminantes orgánicos, dando la posibilidad de emplear un microorganismo con una amplia
tolerancia a contaminantes (orgánicos y no orgánicos).
Los experimentos de crecimiento radial de Penicillium purpurogenum se realizaron para
empezar a entender el comportamiento biocinético y de tolerancia ante distintos contaminantes
orgánicos y sus distintas concentraciones. La identificación y posteriores estudios biocinéticos de
Penicillium purpurogenum lograron identificar un hongo con resistencia a dos de los tres contaminantes
orgánicos utilizados.
A las 62 horas las velocidades de crecimiento de los hongos en los medios con 10 g/L n-
dodecano, 0.1 g/L antraceno, 1.0 g/L antraceno 2 g/L antraceno son 3.97%, 18.65%, 12.30% y 0.79%
menores a las del control positivo respectivamente. Por el contrario, las velocidades de crecimiento de
los hongos en 20 g/L n-dodecano y 40 g/L n-dodecano son 15.48% y 4.37% mayores a las del control
positivo respectivamente.
De esta forma, este hongo de pudrición blanca mostró resistencia al orgánico complejo
antraceno y al alcano lineal n-dodecano; sin embargo no mostró resistencia al furfural (aún en bajas
concentraciones).
El desarrollo de un inoculo y su aplicación a un suelo contaminado del Sur de Chile permitió
observar el comportamiento del hongo Penicillium purpurogenum bajo condiciones de biorremediación
aeróbica. Basándose en estos ensayos preliminares es posible recomendar el uso de hongos de
pudrición blanca para la biorremediación de suelos adicionando algún material abultante para optimizar
la penetración del hongo, la retención de humedad y la oxigenación.
El potencial de Penicillium purpurogenum es muy relevante, ya que además de remover
contaminantes metálicos en investigaciones anteriores, también ha demostrado su tolerancia y la

50
posibilidad de biodegradar compuestos orgánicos. Este hongo da la posibilidad de ocuparlo en sitios con
múltiples contaminantes (metálicos, no orgánicos y orgánicos). Es necesario realizar más estudios
empleando compuestos orgánicos complejos de modo de establecer bases sólidas para el desarrollo de
una tecnología aplicable de micorremediación.

51
12 Referencias

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55
Anexo A. Imágenes del crecimiento de hongos de turba magallánica sin contaminante
orgánico.

Figura A.1. Crecimiento de hifas de color blanco

sobre la turba magallánica; la turba se mezcló
con una solución de dextrosa para obtener una
rápida germinación de esporas y crecimiento de
los hongos.

Figura A.2. De los hongos que crecieron en la

turba se realizó un subcultivo en un medio PDA.
Se aprecia el primer día de crecimiento.

Figura A.3. Al segundo día los hongos (en este

caso del género Penicillium) presentaron
colonización total de la placa con la formación de
esporas.

56
Figura A.4. Se presentan distintos subcultivos procedentes de los hongos que crecieron en la
turba; se puede apreciar que todos comparten características macroscópicas parecidas, pero no
idénticas; las características macroscópicas apuntan al género Penicillium.

57
Anexo B. Imágenes crecimiento de hongos tolerantes a contaminantes orgánicos.

Figura B.1. A la turba se le administró una solución con distintos contaminantes orgánicos (antraceno, n-dodecano y
furfural). Se logra apreciar el desarrollo de hifas de color blanco sobre la turba en los primeros días de crecimiento.
Posteriormente se desarrollaron las esporas (de color verde).

58
Figura B.2. Los hongos que se desarrollaron en la turba contaminada fueron subcultivos en
medio HAF. Se aprecia el desarrollo de hifas (color blanco) y la producción de esporas verdes
propias del genero Penicillium.

59
Anexo C. Imágenes crecimiento hongos en medio con 30 g/L de n-dodecano.

Figura C.1. Turba contaminada con n-dodecano.

Se aprecia el desarrollo de hifas de color blanco
en distintas parte de la placa.

Figura C.2. El subcultivo de los hongos en un medio con 30 g/L n-dodecano. Se aprecia la
formación de esporas de color verde.

60
Anexo D. Imágenes Penicillium purpurogenum en crecimiento radial

Figura D.1. Control negativo en el segundo día

del crecimiento radial. La formación de hifas es
apenas perceptible.

Figura D.2. Cultivos de Penicillium purpurogenum en las distintas concentraciones de n-

dodecano. En el segundo día de crecimiento se aprecia un buen desarrollo de las hifas.

Figura D.3. Control positivo al tercer día de crecimiento;

se aprecia la formación de esporas por parte de
Penicillium purpurogenum.

61
 Figura D.4. Cultivos con distintas concentraciones antraceno al tercer día de
crecimiento; se aprecia la formación de esporas verdes.

Figura D.5. Los cultivos con las distintas concentraciones de antraceno al cuarto día de la
experiencia de crecimiento radial. La presencia de esporas es mayor que el día anterior.

Figura D.6. Al cuarto día crecimiento en furfural el desarrollo del hongo es casi nulo.
No se aprecia la formación de hifas o de esporas en la mayoría de las placas.

62
 Figura D.7. Crecimiento del hongo de pudrición blanco en n-
dodecano al cuarto día; existe una buena producción de esporas
por parte del microorganismo.

Figura D.8. Las muestras que se encuentran en la parte superior de la imagen correspondes al control positivo (pleno
desarrollo de hifas y una gran producción de esporas); las muestras inferiores son los controles negativos con un bajo
desarrollo de hifas y producción de esporas.

63
Anexo E. Imágenes inóculo.

Figura E.1. Evolución inóculo a través del tiempo. La primera imagen corresponde al primer
día de agitación; a medida que pasaban los días la capa de n-dodecano en la parte superior
disminuía y la formación de biomasa aumentaba. El color verde inicial corresponde a las
esporas de la solución; a medida que pasaban los días se apreciaba crecimiento de los hongos
en la parte superior de la solución.

64
Anexo F. Imágenes crecimiento hongos en tierra contaminada con petróleo diesel.

Figura F.1. El inóculo es esparcido en toda la superficie de la tierra contaminada. Se aprecia el crecimiento
de hifas en distintos sectores de la bandeja.

Figura F.2 También se ocupan places de Petri para el crecimiento de Penicillium purpurogenum.

65
 Figura F.3. Detalle del Crecimiento de Penicillium purpurogenum en las distintas placas de Petri
con tierra contaminada. Además de hifas (color blanco) también se aprecia el desarrollo de
esporas (color verde).

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