Diversos protocolos técnicos
● Descomplementación del suero animal para cultivos celulares
Antes de añadir el suero animal a un medio de cultivo celular hay que inactivar todas las
proteínas del complemento, es decir, hay que descomplementarlo. Para ello:
1. Se descongela una botella de suero en un baño a 37 °C y a continuación se sube la
temperatura hasta 56 °C.
2. El suero se mantiene a 56 °C durante 45 minutos.
3. Transcurrido este tiempo, se saca del baño, se deja enfriar, se alicuota (15-50 ml) y
se guarda congelado a -20 °C.
Para complementar un medio de cultivo celular se usa una alícuota recién descongelada.
● Disgregación celular con tripsina
Un protocolo genérico de disgregación celular con tripsina sigue estos pasos:
1. Colocar el tejido que se va a disgregar en una placa de Petri con PBS frío y picar lo
más posible con hojas de bisturí.
2. Pasar el tejido picado a un tubo de 15 ml y añadir 3 ml de una solución de tripsina
al 0,25% con EDTA 1 mM.
3. Incubar a 37°C durante 30-60 minutos, dependiendo del grosor de los fragmentos
de tejido.
4. Añadir 7 ml de medio MEM con 10% de suero fetal y antibióticos.
5. Pipetear enérgicamente con pipeta pasteur 20-30 veces.
6. Dejar reposar para que se forme un pellet.
7. Eliminar el sobrenadante.
8. Añadir 10 ml de medio y resuspender el pellet suavemente por inversión.
9. Centrifugar a 900 rpm y descartar el sobrenadante.
10. Resuspender las células en medio de cultivo nuevo.
* Los pasos 2 a 7 se pueden repetir si la digestión del tejido no ha sido completa.
** Todo el material y las soluciones empleadas deben ser estériles.
● Tripsinización de una monocapa de células y subcultivo
Un protocolo genérico para despegar una monocapa de células, consiste en:
1. Retirar todo el medio de cultivo.
2. Lavar la monocapa con una solución PBS + 0,004% de EDTA.
3. Incubar la monocapa con una solución de tripsina 0,05% / EDTA 0,016%
4. Añadir un volumen 4-5 veces mayor que el de la solución de tripsina de medio de
cultivo nuevo completo (con suero). El suero contiene un inhibidor de tripsina, con lo
que se detiene la tripsinización.
5. Pipetear varias veces el medio de cultivo por toda la placa con fuerza suficiente
para terminar de despegar y separar las células. Al final se debe obtener una
suspensión celular sin agregados.
6. Lavar las células en suspensión con medio de cultivo nuevo.
7. Hacer un recuento de viables.
8. Calcular el factor de dilución necesario para subcultivar en recipientes nuevos.
9. Preparar tantos recipientes estériles como sea necesario con la cantidad de medio
nuevo adecuada al factor de dilución calculado.
10. Repartir las células lavadas en los recipientes nuevos en la proporción adecuada.
11. Llevar los subcultivos al incubador.
