TEMA 8: REPLICACIÓN, REPARACIÓN Y RECOMBINACIÓN DEL DNA
-DEFINICIONES
● DNA: Depositario de la información genética
● “METABOLISMO DEL DNA”
○ Síntesis rápida y exacta del DNA -> replicación
○ Estabilidad genética -> reparación
○ Supervivencia a largo plazo -> variaciones genéticas -> recombinación genética y mutaciones
-REPLICACIÓN DEL DNA
● CARACTERÍSTICAS
○ La replicación consiste en la separación de la hebra de ADN en otras 2, de las que una de ellas será la nueva y otra
la vieja
○ Los mecanismos utilizados por las enzimas durante la replicacion son idénticos en todos los organismos
○ La replicacion del DNA es semiconservadora <- IMP EXÁMEN
◆ Replicación semiconservativa. En este modelo, las dos cadenas de ADN se desenrollan y cada una sirve como
molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto resulta en dos moléculas de ADN, cada una
con una cadena original y una nueva
○ Para averiguarlo, Matthew Meselson y Franklin Stahl llevaron a cabo un experimento: :
◆ 1. Cultivo de bacterias en nitrógeno pesado (N-15):Las bacterias E. coli fueron cultivadas en un medio que
contenía el isótopo pesado de nitrógeno (^15N) durante varias generaciones. El ADN de estas bacterias incorporó
el nitrógeno pesado, haciendo que su densidad fuera mayor.
◆ 2. Cambio a nitrógeno ligero (N-14):Después de varias generaciones, las bacterias fueron transferidas a un
medio que contenía el isótopo ligero de nitrógeno (^14N). A medida que las bacterias se replicaban, el nuevo ADN
incorporaba el nitrógeno ligero.
◆ 3. Centrifugación en gradiente de densidad:El ADN fue extraído de las bacterias en diferentes momentos y se
sometió a centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio (CsCl). Esta técnica permitió separar las moléculas
de ADN según su densidad.
◆ 4. Resultados y análisis:
◇ Generación 0 (antes del cambio a ^14N):El ADN tenía una densidad correspondiente a ^15N, apareciendo
en una banda en la parte más densa del gradiente.
◇ Generación 1 (después de una ronda de replicación en ^14N):El ADN formaba una banda intermedia entre
^15N y ^14N, indicando que las nuevas moléculas de ADN consistían en una hebra pesada (^15N) y una
hebra ligera (^14N). Esto apoyaba la hipótesis semiconservativa.
◇ Generación 2 (después de dos rondas de replicación en ^14N):Se observaron dos bandas, una en la
posición intermedia (ADN híbrido) y otra en la posición correspondiente a ADN completamente ligero (^14N).
Esto con rmó que cada molécula de ADN consistía en una hebra parental y una hebra nueva, veri cando la
replicación semiconservativa.
◇ Este experimento demostró que, durante la replicación del ADN, cada una de las dos hebras parentales sirve
como plantilla para la síntesis de una nueva hebra complementaria.
fi
○ La replicación del ADN es bidireccional. Se van a formar lo que se conoce como horquillas de replicación: donde
se sitúan las enzimas que van a separar las dos hebras de ADN. La replicación se diferencia en procariotas y
eucariotas en cuanto que en procariotas solo tiene un único origen de replicación, mientras que en eucariotas consta
de muchos orígenes.
○ Cabe destacar también que la replicación del ADN es semisicontinua:
◆ Al haber dos hebras, una se sintetiza de forma continua y la otra de forma discontinua.
● La síntesis de DNA transcurre siempre en dirección 5’-3’ y la cadena molde se lee siempre de 3’ a 5’. La otra hebra se
sintetiza como Fragmentos de Okazaki (cadenas cortas de DNA recién sintetizadas en la hebra discontinua)
○ Hebra conductora: sintetizada de forma continua en la dirección del movimiento de la horquilla.
○ Hebra rezagada: sintetizada de forma discontinua en dirección opuesta a la dirección de movimiento de la horquilla.
La hebra conductora lee de 3’ -> 5’ y sintetiza de 5’ -> 3’
La hebra rezagada como siempre se tiene que leer de 3’-> 5’ para luego sintetizarse al
contrario tiene que ir haciéndolo a trozos para poder leer de 3’->5’ y sintetizar de 5’-> 3’
( los trozos de lectura son los fragmentos de Okazaki)
-DNA POLIMERASA : REQUERIMIENTOS
● Polimeriza= hace crecer la hebra
● 1. Todas las DNA polimerasa requieren de un molde
● 2. Magnesio ( cofactor )
● 3. Cebador -> trozo de ácido nucleico RNA que le proporciones a la enzima un extremo para ir uniendo todos los
nucleótidos, le proporciona el extremo 3’ -OH.
● CEBADORES DE RNA:
○ Proporciona un extremo 3’ -OH libre inicialmente para la síntesis de DNA . Esti es gracias al RNA polimerasa o
primasa que puede sintetizar de 0 .
○ Los cebadores están formados por unos 10-60 nucleótidos ( según especie) , y complementarios a la hebra de DNA
molde.
○ Cuando se empieza la síntesis se dice que hay un DNA naciente unido covalente mente a un fragmento corto de
RNA
○ El DNA replicado maduro no contiene ningún fragmento de RNA ya que estos se eliminan
○ RNApolimerasa: empieza sintetizando cebador de ARN, este se va y comienda a sintetizarse ADN. Cuando sintetiza
un trozo (el cebador o primer) tenemos ya el extremo 3’-OH. El ADN naciente está unido a un fragmento pequeño de
ARN, mientras que el ADN maduro, no va a contener ningún fragmento de ARN.
-DNA POLIMERASA
● Actividad polimerasa: coloca desoxirribonucleósidos trifosfato en el extremo 3’ de la hebra que está creciendo→ataque
nucleofílico y liberación de PPi. Hebra molde (3’-5’) → síntesis hacia abajo.
● El 3’-OH está preparado para que le añadan nucleótido. El Oxig. Tiene 2e-, los cuales vana atacar al P alfa (el que está
más cerca de la pentosa). Se formará un enlace covalente entre el O y el P, al mismo tiempo que se forma, también se va
rompiendo.
● La ADNpolimerasa se une a la hebra molde. Esta podría colocar el nucleótido y liberarse al medio para sí descansar (así
sucesivamente). Sin embargo, lo que hace es leer continuamente nucleótidos sin descansar y luego ir al medio
(descansa) y volver. → procesividad.
● Procesividad: nº de nucleótidos adicionados antes de la disociación de la polimerasa. Cuantos más nucleótidos coloca,
más procesiva es la enzima.
● Velocidad de la replicación: limitada por la disociación y reasociación de la enzima (relacionado con la prcesividad).
TIPOS DE DNApolimerasa (en procariotas hay 3 distintos):
● DNA poliemrasa 1: descubierta por A. Kornberg. Tiene actividad de síntesis de DNA. Además, tiene 2 actividades
hidrolíticas, cuya función es la ruptura de un enlace fosfodiéster (en el extremo). Se encarga de la eliminación de los
cebadores.
○ Exonucleasa 3’-5’ ( corrección de pruebas ): corrige los errores de la enzima (esta coloca un nucleótido que no es el
que toca). .
○ Actividad exonucleasa 3’-5’: (Traslado de mella): reparación del DNA y eliminación de cebadores. Lo que hace es
colocar los nucleótidos que son ADN. 1ºse elimina un cebador, luego se traslada la mella por la DNA polimerasa y
nalmente se liga mediante la ligasa.
● DNA polimerasa 2: actúa en la reparación del DNA. No actúa en la replicación
● DNA polimerasa 3: mucho más compleja que la 1, se encarga de la síntesis de DNA.
○ Es una holoenzima de la ADN Pol III.
○ Es la DNA replicasa de E. coli.
○ 10 subunidades diferentes (diferentes funciones) y las actividades de polimerización y de corrección de pruebas
localizadas en subunidades diferentes.
○ No actividad exonucleasa 5’-3’( no puede eliminar los cebadores ).
○ Mayor procesividad que la DNA polimersasa I. Dos subunidades β (abrazaderas β ) alrededor del DNA (más se
aprecia la síntesis) ( anillos por donde pasa la hebra molde) .
fi
-OTRAS ENZIMAS Y PROTEÍNAS DE LA REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS
● Sistema DNA replicasa o replisoma: Conjunto de proteínas de la replicación que, junto con la DNA pol III, permiten la
replicación del DNA.
- Helicasa: separa las hebras de DNA dúplex. Utiliza la energía del ATP.
- Topoisomerasas: alivian la tensión topológica. Utilizan la energía del ATP. Actúan al otro lado
de la horquilla de replicación.
- Proteínas jadoras de DNA (SSB): impiden que las hebras separadas de DNA molde vuelvan a
hibridarse antes de la replicación.
- DNA ligasa: sella los enlaces fosfodiéster.
-MECANISMO DE LA REPLIACIÓN EN PROCARIOTAS
1. INICIO
● Origen de replicación ori C (245 pb) (un solo origen de replicación). No todos los pares de bases son importantes, solo
dos trocitos:
● 3 secuencias de 13 pares (en tándem), con secuencias conservadas en los orígenes de replicación bacterianos. Siempre
empiezan por las bases GATC; además, es una secuencia rica enA-T.
● Repartido por el ori C. 5 secuencias de 9 pares cada una. Lo que ocurre:
○ La proteína Dna A: reconoce la secuencia origen y mediante la hidrólisis del ATP se coloca (el ADN) justo enrollada
sobre ellas mismas. DNA superenrollado negativamente.
○ Aparece una Dna B (una helicasa) y Dna C, en las apreturas, se unen a la Dna A para abrir la doble hélice.
○ DNA girasa alivia la tensión topológica, junto con las topoisomerasas.
○ Replicación muy regulada: El inicio es la única fase regulable y marca cuantas veces se tiene que producir la
replicación.
○ La porción desenrollada se estabiliza por las SSB.
2. ELONGACIÓN
fi
3. TERMINACIÓN
● Eliminación de los cebadores, reemplazamiento por DNA y sellado de la mella.
○ DNA polimerasa 1: elimina los cebadores de RNA y los substituye por DNA nuevo hasta que el DNA recién
sintetizado el problema es que no puede unirlos y son las ligadas las encargadas de unir los trozos de DNA.
● Región de unas 350 kb con varios sitios de terminación de 20 pb: TerA, TerD y TerE (para la izquierda), TerC, TerB, TerF
y TerG ( para la derecha )
● Sitios de terminación polares
● Presencia de la proteína Tus ( sustancia de utilización del terminar ): gran proporción de aminoácidos básicos
Sentido contrario agujas Sentido agujas del reloj
V
D
Secuencia de terminación ( 20 pares de
bases ) indican a la polimerasa que tiene que
m
terminar -> en estas 20 bases hay proteínas
que indican que tiene que parar
Trampa para orquilla que va en
sentido a las agujas del reloj D
Trampa para la orquilla que va en sentido contrario a
las agujas del reloj
Los sitios de terminación don polares es decir tienen dirección. Hay unos
específicos para cada orquídea es decir sentido agujas y contrario al reloj
● los cromosomas circulares ( en PROCARIOTAS ) ligados están catenados
● No es unión covalente
● La separación requiere una topoisomerata tipo II
-REPLICACIÓN DEL DNA EUCARIÓTICO
● La velocidad de replicación es más lenta que en las procariotas, porque los ADN son más largos y con más
componentes, aprox. 50 nucleótidos/s.
● Cabe destacar que hay múltiples orígenes de replicación (uno cada 30 - 300 kb kilobases); cada origen de replicación
representa una unidad de replicación o replicón. Este replicón engloba la mitad de una replicación, el origen y la mitad de
la otra (como un espacio entre las horquillas).
● La replicación no se origina simultáneamente en todos los orígenes; sólo grupos de 20 a 80 replicones adyacentes.
● Los fragmentos de Okazaki son más cortos que en procariotas, entre 150 y 200 nucleótidos (100-2000 para procariotas).
● Los eucariotas tienen cinco DNA polimerasas: α, β, δ, ε, γ.
ADN polimerasas:IMPORTANTE
- DNA polimerasa α : síntesis de los cebadores, posee actividad primasa y polimerasa, -carece de actividad exonucleasa 3’
→ 5’ (“corrección de pruebas”).
- DNA polimerasa δ : asociada a PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular), realiza la síntesis de ambas hebras,
posee actividad exonucleasa 3’ → 5’.
- DNA polimerasa ε : reparación del DNA, eliminación de los cebadores.
- DNA polimerasa γ: replicación del genoma mitocondrial. Otros complejos proteicos:
RPA (proteína de replicación A): proteína eucariótica de unión al DNA
- DNA polimerasa β: reparación del DNA. de cadena sencilla.
RFC (factor C de replicación): Desplaza a la DNA polimerasa α y atrae
a PCNA.
TELÓMETOS Y TELOMERASAS.
● Los Telómeros: son los extremos de los cromosomas eucarióticos lineales
● Formados por ADN alternamente repetitivo, bloques de 1–12 kb, con unidades de 6–8 pb de la forma: (x e y entre 1 y 4),
repetidas en tándem centenares o miles de veces (DNA repetitivo no codi cante) y con extremos cohesivos (se queda
un trozo sin su complementario).
● La hebra TG es más larga que la complementaria.
● Secuencias ricas en G en el extremo 3’.
● Aparecen lazos T para estabilizar el telómero.
Extremo cohesivo :
• enzimas de restricción -> cortan el DNA por una secuencia
palindrómica , corta entre las 2 G
• Extremo romos : corta la secuencia palindrómica entre C-G
Poco estable , telomero extremo cohesivo
s
D
Se mete el trozo poco estable entre
31
5-3 las dos hebras
● La eliminación del RNA cebador del extremo 5 ́ de una molécula lineal dejaría un hueco que no puede llenar la acción de
la DNA polimerasa debido a la ausencia de un DNA cebador que extender. ¿ que origina ?
● La longitud del telómero se acortaría con el no de ciclos celulares. L
● Reloj biológico que mide el proceso de envejecimiento celular.
● CARACTERÍSTICAS :
○ Telomerasa = ribonucleoproteína ( DNA + proteína ) -> sintetiza el telomero
○ Las telomerasas son las enzimas encargadas de la replicación de los telómeros
○ Son ribonucleoproteínas con secuencias ricas en C y complementarias a la secuencia telomérica del extremo 3’
○ Añaden segmentos de Tx Gy al extremo 3’ de la hebra que se copia, complementarios a la secuencia interna CyAx
de la telomerasa
○ La extensión del 3’ permite que se sintetice un cebador que, a su vez, dejar que la DNA polimerasa sintetizara
completamente la secuencia complementaria del telomero, sin acortamiento
◆ Su acción -> longevidad de las células ( ventaja )
◆ Su activación -> aparición del cáncer ( desventaja)
Desplazamiento, se desplaza la distancia S
que ha sintetizado
-TRANSCRIPCIÓN INVERSA: SÍNTESIS DE DNA DEPENDIENTE DE RNA
● Transcripción inversa -> DNA polimerasa dependiente de RNA. Sintetiza DNA a partir de RNA . NO CORRIGUE SUS
ERRORES ( no posee exonucleasas 3’->5’)
● Retrovirus -> virus de RNA que infectan animales y contienen transcriptasas inversas
● Genoma vírico + enzimas + tRNA penetran en célula hospedadora durante la infección
● todo lo que el virus necesita lo encuentra en la hospedadora
● Coge la enzima y toma de molde el RNA del virus , sintetiza la 1º hebra de DNA
● La misma enzima degrada la molécula de RNA
● Coge como molde la 1º hebra y sintetiza la genómica de DNA
○ Contiene la información genética del virus
● Utiliza el RNA de transferencia como cebador
-DEBES SABER
¿Por qué se producen lesiones en el DNA? Causas posibles.
- ¿Qué son mutaciones puntuales? -> son cambios en solo una base nitrogenada
- Diferencias entre transiciones y transversiones.
- Mutaciones de cambio de sentido, sin sentido, inserciones, deleciones y mutaciones silenciosas.
- Principales causas químicas de las mutaciones y sus consecuencias.
Las principales causas químicas de las mutaciones incluyen:
1. Agentes alquilantes: Añaden grupos alquilo a las bases del ADN, causando errores durante la replicación.
2. Análogos de bases: Sustituyen las bases normales del ADN, provocando emparejamientos incorrectos durante la
replicación.
3. Intercalantes: Se insertan entre las bases del ADN, causando inserciones o deleciones de bases durante la replicación.
4. Agentes desaminantes: Eliminan grupos amino de las bases, alterando su emparejamiento.
Consecuencias: Estas mutaciones pueden causar errores en la secuencia de proteínas, pérdida de función génica,
cáncer y otras enfermedades genéticas.
- La tautomería transitoria forma pares de bases no estándar que afectan la doble hélice.
- Prueba de Ames: La prueba de Ames evalúa la capacidad mutagénica de compuestos químicos usando bacterias
*Salmonella typhimurium* que no pueden sintetizar histidina. Se expone a las bacterias al compuesto en estudio y se incuban
en placas de agar. Un aumento en las colonias revertantes, que han mutado para sintetizar histidina, indica mutagenicidad.
Es una herramienta clave para identi car posibles carcinógenos.
-REPARACIÓN DEL DNA
● Reparación de apareamientos incorrectos en E. coli
○ Dam metilasa ( metida las adeninas añade CH3): metila, en la hebra molde y durante la replicación, todas las
adeninas (en posición N6 ) de las secuencias 5’GATC3’.
○ Justo al terminar la replicación, la hebra recién sintetizada aún no está metilada y el sistema de reparación puede
corregir los errores. ( Distingue la hebra molde de la recién sintetizada gracias a la metilación)
○ Se pueden reparar errores a unas 1000 pb de distancia de la secuencia metilada. Si ambas hebras están metiladas
no se produce la reparación.
○ Si las 2 hebras están metiladas no se pueden reparar errores (posición de un nucleótido que no corresponde).
( Cuando se produce la replicación hay una enzima que esta activa a la vez como es la Dam metilasa)
○ Es un proceso muy costoso energéticamente en bacterias. En eucariotas hay proteínas análogas a MutL y MutS.
Alteraciones de los genes de estas proteínas en humanos pueden inducir a algún tipo de cáncer. El mecanismo en
eucariotas no es conocido, pero se sabe que el reconocimiento de las hebras no usa secuencias GATC.
fi
Reparación por escisión de base
● Citosina del DNA se desamina espontáneamente para formar uracilo -> desaminación mutagénica: G-C G-U G-C U-A
desaminación replicación.
● La reparación consiste en reconocer al uracilo como una base extraña del DNA. Se produce una mutación porque se
añade un producto químico.
● Como ha habido un intercambio y ahora tenemos U, la G servirá de molde y en la replicación se formará C, pero en la
otra hebra, al leer U, en la replicación se pone A.
● NOTA: todos los procesos de reparación son posibles porque la hebra molde está intacta.
● Hidrólisis del enlace N-glucosídico entre la base y la desoxirribosa: Uracilo ( base que reconoce ) DNA-glucosidasa
● Corte en el armazón fosfodiéster de la hebra, justo al lado de la base que falta: Endonucleasa AP.
● DNA polimerasa I corta un fragmento con la desoxirribosa fosfato residual e inserta el fragmento de nuevo incluyendo la
citosina (lee G en la hebra sin dañar).
● DNA ligasa cierra la hebra reparada.
Reparación por escisión de nucleótido:
Se trata de una reparación de los dímeros de pirimidina,
● Residuos de pirimidina contiguos en la misma hebra de DNA pueden unirse covalentemente dando lugar a DÍMEROS DE
PIRIMIDINA (habrá que repararlo).
● Se forman por exposición del DNA a la luz ultravioleta que lleva a que la replicación y expresión se bloquean hasta que
se suprime la lesión.
● En el caso de las procariotas, la lesión está en sentido 5’-3’. 1º llega una endonucleasa (escinucleasa), que rompe a 8
nucleótidos de distancia hacia la izq. y 4 hacia la derecha, por tanto, elimina en total 13 residuos (en el esquema el de
abajo es la cadena molde (3’-5’) y la de arriba va en 5’-3’ a partir del 3’- OH).
● La ADNpol 1, sintetiza leyendo la hebra molde y por último, la ligasa se encarga de unirlo todo.
● Por otro lado, en las células eucariotas, ocurre algo parecido con la diferencia de que se cortan en total 22 residuos,
gracias a la ADN helicasa.
Reparaciones directas:
1. Reparación por fotorreactivación o reparación inducida por luz: DNA fotoliasa (enzima fotorreactivadora) absorbe la luz
y cataliza la eliminación de las pirimidinas adyacentes.
2. Reparación de la O6 -metilguanina: Metiltransferasa (se debe porque la guanina se metilapor algún agente químico), lo
que hace es llevarse el residuo de metil.
