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TP Laboratorio 2

El documento describe un procedimiento para la determinación de glucosa utilizando un método enzimático que involucra glucosa oxidasa y peroxidasa. Se detalla la preparación del reactivo de trabajo y el protocolo del ensayo, incluyendo el uso de tubos Falcon y un espectrofotómetro. Se proporcionan valores de referencia para la concentración de glucosa en suero y orina.

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El documento describe un procedimiento para la determinación de glucosa utilizando un método enzimático que involucra glucosa oxidasa y peroxidasa. Se detalla la preparación del reactivo de trabajo y el protocolo del ensayo, incluyendo el uso de tubos Falcon y un espectrofotómetro. Se proporcionan valores de referencia para la concentración de glucosa en suero y orina.

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BIOQUÍMICA ESTOMATOLÓGICA

Trabajo Práctico N°2

Determinación de Glucosa
Método enzimático
Método:

Glucosa + O2 + H20 ácido glucónico + H2O2 (catalizador = glucosa oxidasa -


GOD)
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada (catalizador = peroxidasa -POD)

Se utilizará un kit para determinación de glucosa (GLICEMIA ENZIMATICA)


 Reactivo 4-AF: solución de 4 aminofenazona, 25mM.
 Reactivo Fenol: fenol, 55Mm.
 Reactivo GOD/POD: solución de glucosa oxidasa (GOD) y peroxidasa (POD)
 Muestra Standard, de concentración conocida de glucosa, 100 mg/dl.

PROCEDIMIENTO
PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO

1) Tome una probeta de 500 ml.


2) Agregue 250 ml de H2O bidestilada.
3) Agregue 25 ml de reactivo 4-AF.
4) Agregue 25 ml de reactivo Fenol.
5) Complete con H2O bidestilada hasta la marca de 500 ml.
6) Agregue 1.5 ml de reactivo GOD/POD.
7) Tape y mezcle por inversión suavemente, sin agitar.
8) Guarde en frasco color caramelo. Identifique con un rótulo indicando fecha, y la
leyenda “REACTIVO DE TRABAJO (GLUCEMIA) LISTO PARA ENSAYO”.
Conservado a 4ºC, es estable hasta 1 mes.

PROTOCOLO DEL ENSAYO

1- Utilice 4 tubos Falcon de 15 ml, rotulándolos como: (1) BLANCO, (2) STANDARD,
(3) SUERO PROBLEMA, (4) ORINA PROBLEMA.

2- Agregue reactivos según el siguiente esquema.


Antes de agregar la muestra, agite brevemente el tubo conteniendo suero y/o orina, en
vórtex.
(1) Blanco (2) Standard (3) Suero (4) Orina
Problema Problema
Buffer de 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
trabajo
H20 20 ul
Stándard 20 ul
Suero 20 ul
problema
Orina 20 ul
problema

3- Agite cada tubo brevemente en vórtex.

4- Incube por 10 minutos, en baño a 37ºC.

5- Prenda el espectrofotómetro.

6- Seleccione 505 nm de longitud de onda.

7- Lea absorbancia de tubo BLANCO y presione el botón B.

8- Lea las muestras Standard y problemas.


9- Calculo de resultados:

Absorbancia de Standard---------------- Concentración de Standard (100 mg/dl)


Absorbancia de SUERO Problema------ x = Concentración Sangre Problema (mg/dl)

Valores de referencia:
Suero= 70 a 110 mg/dl
Orina = no detectable

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