FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CONTROL DE MEDICAMENTOS
PRÁCTICA - MÉTODO ANALÍTICO
HPLC
Determinar el contenido de paracetamol en comprimidos por HPLC
INFORME DE MÉTODO ANALÍTICO
Determinación de contenido por HPLC
INTEGRANTES CI
1. Alcívar Ramos Leonardo Gabriel 1315306595
2. Cedeño Cedeño Emily Norelia 0951699529
[Link] Zambrano José Lizardo 1315435691
4. Mera Valdivieso Josselyn Ivonne 1312455023
5. Proaño Menéndez Justine Salomé 1350234249
Lugar: Laboratorio de Investigación Tiempo estimado: 4 horas
INTRODUCCIÓN
En el ámbito de la química analítica, la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, por sus siglas
en inglés High Performance Liquid Chromatography) es una técnica avanzada, empleada para
descifrar la compleja composición de mezclas diversas. Su versatilidad y adaptabilidad la han
impulsado a la vanguardia de las investigaciones científicas, permitiendo a los científicos separar,
identificar y cuantificar diversas especies químicas. con notable precisión (1). El fundamento teórico
de la HPLC radica en la cromatografía, que consiste en la distribución diferencial de los compuestos
entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida o recubierta, lo que permite la separación
basada en las interacciones químicas y físicas entre los analitos y estas fases. La fase móvil empuja
la muestra a través de una columna donde ocurre la separación según la afinidad de cada componente
por la fase estacionaria, dando lugar a diferentes tiempos de retención que facilitan la identificación
y cuantificación posterior (1).
Un sistema típico de HPLC está constituido por varios componentes: el depósito de disolvente que
contiene la fase móvil, la bomba que fuerza su paso constantemente a través del sistema, el inyector
que introduce la muestra (manual o automático), la columna que contiene la fase estacionaria donde
se produce la separación, el detector que identifica y cuantifica los analitos al salir de la columna y
el sistema de adquisición de datos que procesa y registra la información cromatográfica (2).
A continuación, se presenta un esquema detallado sobre los componentes de un equipo HPLC:
Figura 1. Esquema operacional de un HPLC
Cabe destacar que existen sistemas HPLC con inyección manual (el analista inyecta la muestra de
modo directo usando una jeringa en un puerto de inyección) y sistemas automáticos o autosamplers,
donde un dispositivo se encarga de tomar y administrar las muestras programadamente. Los sistemas
automáticos ofrecen mayor reproducibilidad, menor riesgo de error humano y mayor capacidad de
procesamiento de muestras, siendo preferidos en laboratorios de alto rendimiento. En la actualidad,
hay sistemas híbridos que integran el HPLC con equipos de disolución, permitiendo el análisis
automatizado y en línea del principio activo liberado desde una forma farmacéutica durante ensayos
de disolución. Estos avances pueden ser totalmente automáticos u operar de modo semi-
automatizado, optimizando así el flujo de trabajo, la trazabilidad y la precisión de los resultados en
el control de calidad de lotes farmacéuticos (2).
Por otro lado, las extraordinarias capacidades de separación que ofrece el HPLC, junto con su
compatibilidad con una amplia gama de compuestos, han consolidado su valor en campos variados
como la farmacología, la química ambiental y la industria alimentaria, entre otros (3).
Entre sus ventajas se incluye (3):
● Ofrece un método rápido, automatizado y de alta precisión para reconocer ciertos
componentes químicos en una muestra.
● La cromatografía líquida de alta resolución ofrece un análisis cuantitativo rápido y preciso.
● En algunos métodos se puede aplicar un sistema de disolvente en gradiente.
● Es altamente reproducible.
● HPLC se puede actualizar a espectroscopia de masas (MS).
● HPLC es muy rápido, eficiente y ofrece alta resolución en comparación con otras técnicas
cromatográficas, como TLC, cromatografía en columna y cromatografía en papel.
● Maneja todas las áreas de análisis para aumentar la productividad.
Sin embargo, para garantizar la durabilidad y eficiencia del sistema, la filtración de muestras y de la
fase móvil es una práctica económica y simple que amplía la vida útil de los consumibles en un
sistema de HPLC, reduce el desgaste del sistema y preserva su integridad. Al revisar las
consecuencias de las prácticas de filtración inadecuadas, los analistas pueden familiarizarse con las
señales de advertencia tempranas relacionadas con problemas de filtración, y evitar gastos y tiempo
de inactividad asociados a reparaciones de mantenimiento prolongadas y los costes de los reemplazos
(4).
La filtración de muestras y disolventes evita que los accesorios de los inyectores de bajo volumen se
bloqueen, rayen y goteen. El bloqueo del circuito o de la línea de residuos provoca una contrapresión
alta y dificulta el llenado del circuito (4).
Las partículas no disueltas de una muestra, incluso a bajas concentraciones, pueden obstruir la
columna de HPLC, induciendo una elevada contrapresión del equipo y una reducción de la vida útil
de la columna, así como datos de poca calidad. Así pues, la eliminación de estas partículas de las
muestras mediante filtración podría evitar estos problemas y al mismo tiempo ayudaría a
proporcionar mejores datos cromatográficos (5).
La aparición de tiempos de retención anormales en HPLC puede indicar varios problemas en el
sistema de separación. Entre las posibles causas se encuentran (6):
● Los cambios en el flujo y proporciones del disolvente, pueden ser un problema con la bomba
o un cambio químico en el sistema de separación.
● El equilibrio incompleto de la fase estacionaria puede requerir un tiempo adicional para
restablecer las condiciones iniciales antes de la inyección.
● Las variaciones en el pH de la fase móvil, ya que a pequeñas variaciones pueden cambiar la
relación de las formas del analito y afectar el tiempo de retención.
● La presión debe ser constante y no debe variar más de 1 bar para asegurar la estabilidad del
sistema.
Mientras que los picos adicionales en HPLC, también conocidos como picos fantasmas, suelen
indicar problemas en el análisis. Estos picos pueden ser causados por contaminación en la fase móvil,
arrastre del sistema o problemas con el detector. Los picos fantasmas pueden enmascarar picos reales
y provocar malas interpretaciones. Estas prácticas reflejan la importancia de un mantenimiento
meticuloso para preservar la calidad analítica y la durabilidad del equipo.(7).
En caso de obtener resultados no esperados se podrían aplicar las siguientes consideraciones (8):
● Asegurarse de que la muestra esté correctamente calibrada y que los parámetros del
instrumento sean correctos.
● Revisar el cumplimiento del método adecuadamente y que los parámetros del instrumento
sean correctos.
● Verificar que no hayan cambios recientes que puedan afectar el rendimiento del sistema.
● Lavar cuidadosamente la columna y equilibrarla antes de un análisis.
● Filtrar la fase móvil para descartar la presencia de impurezas y burbujas.
● Prepara adecuadamente el tampón: Asegúrate de que el tampón esté preparado correctamente
y que no haya fugas.
● Purgar adecuadamente el sistema.
● Ajustar el caudal de la fase móvil para asegurar una buena separación de los analitos.
● Verificar la respuesta del detector y que no haya interferencias.
● Reemplazar la frita de la columna para evitar que la presión aumente. Solo en caso de
obstrucción.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA
Objetivo General
Cuantificar el contenido de paracetamol en comprimidos de 500 mg utilizando el método de HPLC
conforme a la monografía USP, para verificar su conformidad con los estándares de calidad.
Objetivos específicos
1. Conocer los principios básicos del método de HPLC y su aplicación en el control de calidad
de medicamentos.
2. Preparar correctamente soluciones patrón y de muestra comercial de paracetamol para
análisis por HPLC.
3. Ejecutar el ensayo de contenido según las condiciones cromatográficas de la USP y analizar
los resultados obtenidos en términos de cumplimiento con los requisitos oficiales.
MATERIALES
REACTIVOS O
EQUIPOS MATERIALES
SUSTANCIAS A EMPLEAR
● Balanza ● Mortero y pistilo ● Comprimidos de
● HPLC con detector UV ● Piseta paracetamol 500 mg
● Columna cromatográfica ● Vasos de precipitado ● Patrón de paracetamol USP
C18 (150 mm x 4.6 mm, 5 ● Embudo estriado ● Acetonitrilo grado HPLC
micrómetros) ● Vidrio reloj ● Agua purificada
● Filtros de membrana 0.45 ● Ácido acético glacial
micrómetros ● Solución buffer de fosfato
● Viales y jeringas para HPLC
● Matraz aforado de 100 ml y
1000 ml
● Micropipetas y puntillas
● Cuchara de muestreo de
acero inoxidable
METODOLOGÍA
Para cuantificar el contenido de paracetamol en tabletas, se siguió un método analítico basado en
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), basada en el método USP para “paracetamol tabletas”
y adaptado a las condiciones presentes en el laboratorio.
Preparación de la solución patrón
Para la preparación de la solución madre, se pesaron 10 mg del reactivo patrón de paracetamol y se
disolvieron en 100 mL de solución, enrasando posteriormente. Esta solución madre fue utilizada para
realizar alícuotas sucesivas y así obtener puntos de concentración más bajos, partiendo de una
concentración inicial de 100 ppm.
La solución preparada se llevó a un baño ultrasónico durante dos minutos para asegurar su completa
disolución. Posteriormente, fue filtrada utilizando filtros de membrana de 0,45 µm con el fin de
garantizar que la muestra estuviera completamente libre de partículas. Cada concentración fue
filtrada con un filtro diferente para evitar la contaminación cruzada y minimizar errores.
La solución madre fue transferida a un vaso de precipitado. A partir de la concentración de 100 ppm,
se realizaron diluciones utilizando la fórmula de dilución C1 x V1 = C2 x V2, donde C1 fue 100 ppm
y C2 10 ppm, resultando un V1 de 1 mL. Este volumen fue tomado con micropipeta y enrasado con
agua para obtener la concentración deseada. De esta forma se prepararon las soluciones para una
curva de calibración que iba de 10 ppm a 50 ppm (Ver Anexo 1).
Preparación de la muestra comercial
Se pulverizó un comprimido de paracetamol de 500 mg (Ver Anexo 2) y se pesó una cantidad
correspondiente a la dosis nominal. Esta se disolvió en un volumen adecuado de agua para HPLC y
se sometió a baño ultrasónico durante 2 minutos. Posteriormente, se filtró mediante membrana de
0,45 µm y se diluyó en proporción 1:10 para su análisis cromatográfico.
Condiciones cromatográficas
● Fase móvil: mezcla de Acetonitrilo (20%) y Agua acidificada con ácido acético (80%)
● Flujo: 900 µL/min
● Volumen de inyección: 25 µL
● Longitud de onda: 254 nm
● Temperatura de columna: ambiente (~25–30 °C)
Dado que se trató de un solo compuesto, no fue necesario emplear un sistema de separación complejo
para la fase móvil, por lo que se utilizaron las líneas del sistema HPLC de la siguiente manera:
● Línea A: Agua ultrapura
● Línea B: Acetonitrilo (20%)
● Línea C: Agua acidificada con ácido acético (80%)
● Línea D: Agua acidificada con ácido fórmico
Inicialmente, se modificaron las condiciones desde una proporción de 60% acetonitrilo y 40% agua
acidificada con ácido acético, con un flujo ajustado a 400 µL/[Link] concentraciones se fueron
ajustando en una proporción de 20% en 20%, hasta que se llegará a los parámetros necesarios del
método. Una vez ajustada a una proporción, la fase móvil, de 20% acetonitrilo (línea B) y 80% agua
acidificada (línea C), se estableció un flujo de 900 µL/min. La longitud de onda establecida por el
método, para la medición del paracetamol, es de 254 nm.
Una vez acondicionada completamente la columna y alcanzadas las condiciones adecuadas del
sistema, se esperó un tiempo prudente mientras la bomba daba la orden de paso de la fase móvil a
través de la columna. Solo entonces se procederá a la inyección de las muestras. Una vez inyectadas
las soluciones estándar y la muestra, se obtuvieron los cromatogramas y se graficó en Excel la
relación concentración vs área bajo la curva, generando así la curva de calibración. La linealidad se
evaluó con base en las áreas integradas proporcionadas por el cromatógrafo.
Procedimiento de análisis
Cada muestra fue inyectada manualmente, desde la menor hasta la mayor concentración, para evitar
arrastres y errores. Antes de cada inyección, la muestra fue filtrada y cargada en una jeringa estéril
para ser introducida en el sistema. El detector UV registró los cromatogramas de cada muestra,
permitiendo observar el pico característico del acetaminofén. Se integró el área bajo cada curva y se
tabuló contra la concentración correspondiente. La relación concentración versus área se representó
gráficamente, verificando la linealidad de la curva mediante regresión lineal (Ver Anexo 3). Esta
curva se utilizó posteriormente para determinar la concentración de acetaminofén en la muestra
comercial una vez se haya obtenido su área con su debido cromatograma (Ver Anexo 4).
RESULTADOS
● Determinación de contenido de Acetaminofén estándar
10𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
𝑆𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒:
100 𝑚𝐿 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎
9 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑎 10𝑚𝐿: 0,1; 0,3; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10 𝑝𝑝𝑚.
𝐶2 ∗ 𝑉2
𝐶1 ∗ 𝑉2 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 → 𝑉1 =
𝐶1
0,1𝑝𝑝𝑚 ∗ 10𝑚𝐿
𝑀1 = = 0,01𝑚𝐿
100𝑝𝑝𝑚
Á𝑟𝑒𝑎 1 = 36489
𝑀2 = 0,03
Á𝑟𝑒𝑎 2 = 72761
𝑀3 = 0,05
Á𝑟𝑒𝑎 3 = 107148
𝑀4 = 0,1
Á𝑟𝑒𝑎 4 = 198808
𝑀5 = 0,2
Á𝑟𝑒𝑎 5 = 375197
𝑀6 = 0,4
Á𝑟𝑒𝑎 6 = 721622
𝑀7 = 0,6
Á𝑟𝑒𝑎 7 = 1063487
𝑀8 = 0,8
Á𝑟𝑒𝑎 8 = 1415432
𝑀9 = 1
Á𝑟𝑒𝑎 9 = 1751939
X (Área) Y (Concentración ppm)
36489 0,1
72761 0,3
107148 0,5
198808 1,0
375197 2,0
721622 4,0
1063487 6,0
1415432 8,0
1751939 10,0
R 0,9999
a 5,76461E-06
b -0,133941179
Figura 2. Curva de calibración de las muestras estándar
● Peso de la tableta comercial
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎 = 567 𝑚𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑢𝑛𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑜𝑗 = 6272 𝑚𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎 𝑡𝑟𝑖𝑡𝑢𝑟𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑢𝑛𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑜𝑗 = 6782 𝑚𝑔
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑒𝑚𝑝𝑙𝑒𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎 𝑡𝑟𝑖𝑡𝑢𝑟𝑎𝑑𝑎 = 6782 − 6272 = 510 𝑚𝑔
● Dilución de la muestra
1:10
● Datos del cromatograma de la muestra
𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 = 2,31 𝑚𝑖𝑛
𝑃𝑖𝑐𝑜 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 = 2,41 𝑚𝑖𝑛
𝐹𝑖𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 = 2,57 𝑚𝑖𝑛
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 130317
● Cálculo de concentración de la muestra
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑚𝑔
( ) ∗ 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 ( )
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑚𝐿
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 = 20719
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 130317
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 = 50𝑝𝑝𝑚
130317
( ) ∗ 50 𝑝𝑝𝑚 = 8,88𝑝𝑝𝑚
733601
8,88𝑝𝑝𝑚 ∗ 50𝑚𝐿 = 444𝑚𝑔
444𝑚𝑔 ∗ 100%
%𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = = 88,8%
500𝑚𝑔
Valor fuera del establecido en la USP (90-110%).
CONCLUSIÓN
Con el desarrollo de la práctica se logró comprender los fundamentos teóricos y operativos del
método HPLC, reconociendo su utilidad en el análisis cuantitativo de principios activos y
determinación de impurezas. Esta técnica demostró ser una herramienta eficaz en el control de
calidad de medicamentos, gracias a su alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad, factores
esenciales para garantizar la seguridad del medicamento.
La correcta preparación de las soluciones patrón y de muestra comercial es clave para la construcción
de una curva de calibración lineal y confiable, así como para la obtención de resultados
representativos en el análisis. A pesar de que, debido a las condiciones de tiempo en el laboratorio,
no se logró elaborar correctamente la preparación de una curva de calibrado lineal, este proceso
permitió consolidar habilidades prácticas fundamentales para la aplicación del método HPLC en
entornos de control de calidad.
La determinación del contenido de paracetamol en el comprimido comercial, utilizando el método
de HPLC conforme a la USP, arrojó una concentración final de 444 mg, considerando el factor de
dilución 1:10 aplicado durante el análisis. Este valor, al encontrarse fuera del rango permitido por
la USP para comprimidos de 500 mg (90–110% del contenido declarado), indica que el resultado
obtenido no cumple con los estándares de calidad establecidos.
La baja concentración detectada sugiere posibles errores durante el proceso de preparación de la
muestra, tales como un incorrecto pesaje del comprimido, pérdida de muestra durante la infiltración
o inyección de la muestra, debido a las condiciones presentadas del inyector. Por tanto, se
recomienda repetir el análisis, prestando especial atención a la etapa de preparación de la muestra y
verificación del volumen final, para asegurar la representatividad del comprimido analizado y la
confiabilidad del resultado obtenido.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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FPLC, UPLC, etc.)? [Internet]. 2023 [citado el 23 de julio de 2025]. Disponible en:
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23 de julio de 2025]. Disponible en: [Link]
HPLC-que-debes-conocer/
ANEXOS
Anexo 1. Muestra Estándar y Solución Madre de Acetaminofén
Anexo 2. Muestra Comercial de Acetaminofén en Comprimido (500 mg)
Anexo 3. Curva de Calibración de estándar de Acetaminofén
Anexo 4. Cromatograma de la muestra comercial
