UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

ACADEMIA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA APLICADA

Documento modificado, actualizado y revisado por:

M. en C. Leny Judith Álvarez Araujo

M. en I. Edith Enríquez Gallosa
Docentes y Técnicos Académicos de la Academia de Bioquímica

1
Vo.Bo.:
M. en C. Julio Cesar Del Hierro
Coordinador de la Academia de Bioquímica

Autorizado por:
Ph.D. Antonio de La Mora Covarrubias
Jefe del Departamento de Ciencias Químico Biológicas

Cd. Juárez Chihuahaua

Revisión 2016
Revisión Enero del 2015
Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica General 1997
Instituto de Ciencias Biomédicas
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

Semestre regular Enero – Mayo 20XX

Semestre regular Agosto – Noviembre 20XX
Curso de Verano Junio – Julio 20XX

2
NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________

MATRICULA ____________________

HORARIO DE TEORIA ____________________

HORARIO DE LABORATORIO_______________

GRUPO DE LABORATORIO _________________

NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________

III
 PROLOGO

El siguiente manual ha sido modificado de acuerdo a las necesidades de la nueva Curricula 2014 de la
carrera de Medicina, por lo que se espera que el alumno aproveche en su totalidad la información aquí
presentada.

El curso de Bioquímica General se imparte en el Instituto de Ciencias Biomédicas como parte del programa
integral del Departamento de Ciencias Químico Biológicas y se requiere del curso de Fisicoquímica como
materia antecedente.

En este curso se presenta una completa orientación hacia el área Médica en donde se correlacionan
aspectos del metabolismo integral con las funciones específicas de los órganos y sistemas con un carácter
muy fundamental teniendo en cuenta que dichas funciones se tratarán con mayor detalle en las nosologías
y las clínicas respectivas.

IV
 CONTENIDO

PRÁCTICA # 1 BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE MATERIAL DE LABORATORIO…….........................10

PRÁCTICA # 2 DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN…………............................................17

PRÁCTICA # 3 CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO SÉRICO..............................................................23

PRÁCTICA # 4 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE DNA EN LEUCOCITOS...................................17

PRÁCTICA # 5 SEPARACIÓN DE DNA POR ELECTROFORESIS…......................................................32

PRÁCTICA # 6 EFECTO MUTAGÉNICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA……..………………………..........37

PRÁCTICA # 7 DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS…………………………….……..……………………..42

PRÁCTICA # 8 DIGESTIÓN DE PROTEÍNAS GÁSTRICAS……………………………………………….…51

PRÁCTICA # 9 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LIPASA.………….………………........................55

PRÁCTICA # 10 EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE CROMATOGRÁFICA DE FOSFOLÍPIDOS……

PRÁCTICA # 11 DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS SÉRICAS

PRÁCTICA # 12 CUANTIFICACIÓN DE BILIRRUBINAS SÉRICAS

PRÁCTICA # 13 INDUCCIÓN Y REPRESIÓN HORMONAL

V
 PRESENTACIÓN

Uno de los aspectos fundamentales de la enseñanza de materias correspondientes al área de las Ciencias
Básicas, es que el estudiante debe de comprender los elementos teóricos revisados. Con el fin de reafirmar
dichos conocimientos es necesario que los practique en el Laboratorio y como consecuencia reciba los
refuerzos apropiados y al final de dicho curso este compenetrado con la materia analizada.

En la Academia de Bioquímica siempre ha existido el interés de que los alumnos que cursen dichas
materias tengan la capacidad de comprender los fenómenos moleculares tanto a nivel celular como del
organismo.

El individuo que se dedique a la investigación y/o a la enseñanza de la Bioquímica, debe de estar

convencido de que el ensayo de formas más eficientes de involucrar al alumno en el estudio de ésta
interesante área, es la única manera de evolucionar positivamente en la investigación y en la excelencia
académica.

Este manual de prácticas es el resultado del esfuerzo común de la Academia de Bioquímica, con el único
fin de fomentar la interrelación de los conocimientos teóricos con la actividad práctica, de una manera más
organizada, en aras de un mayor aprovechamiento de la enseñanza Bioquímica. En base a este
pensamiento, nos comprometimos a elaborar el "Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica
general" el cual esperamos sea útil durante los cursos de Bioquímica.

En este Manual se pretende dar al alumno una información básica, que lo motive a desarrollar un diseño
experimental predeterminado y a deducir por medio del análisis objetivo de los resultados, las posibles
implicaciones que se tengan para demostrar un hecho que fue discutido previamente en la clase teórica.

Agradecemos la cooperación y el apoyo recibido por parte de las autoridades Universitarias para lograr la
publicación de este Manual.

Atentamente Comisión Elaboradora

Academia de Bioquímica

M.C. Héctor Reyes Leal Biol. Héctor Esparza Valencia

Q.F.B. Gilberto Reyes Leal Biol. Daniel Chávez Licón

Q.F.B. Graciela Manjarrez G. Q.B.P Jorge Baylón Monárrez

Q.B.P. J. Ángel Araujo Dr. David Reyes Ruvalcaba.

Q.B.P. Oscar Barrozo

VI
 REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA
1. - Al inscribirse en la materia queda automáticamente inscrito en un grupo de Laboratorio. El maestro
no está facultado para realizar cambios de grupo y/o permutas.
2. - La asistencia a los laboratorios es obligatoria y deberán presentarse con un retardo no mayor de 10
min. de la hora de entrada.
3. - Para tener derecho a calificación final del laboratorio se requiere un 80 % de asistencias.
4. - Toda falta a la práctica equivale a cero en su reporte.
5. - Es obligatorio presentarse con bata blanca de manga larga a las sesiones de laboratorio.
6. - Durante las sesiones de laboratorio queda estrictamente prohibido fumar e ingerir alimentos.
7.- La calificación final de laboratorio corresponde al promedio obtenido en las prácticas, exámenes y
trabajo en el laboratorio.
8.- Los reportes de la semana se entregarán obligatoriamente en el horario establecido por el maestro.
La aceptación extemporánea de reportes queda a consideración del docente.
9.- Los reportes ya calificados, se devolverán a la semana siguiente.
10.- El material que sea dañado por el alumno, deberá reponerse antes de finalizar el curso acompañado
con la factura de compra. De no ser así no se condicionará la calificación del alumno.
11.- Si parte del material es dañado o se pierde y se desconoce al responsable, el material será repuesto
por el grupo asistente a la práctica.
12.- Se realizarán los exámenes de laboratorio pertinentes en las fechas indicadas en la calendarización
de la academia.
13.- Es obligación del alumno entregar el material limpio cada vez que termine su práctica.
14.- Se recomienda mantener limpia su mesa de trabajo y guardar el mayor orden posible.
15.- El alumno se deberá comprometer a regresar el material en las mismas condiciones en que lo
recibieron.
16.- Los reportes o bitácora se calificarán en base a los acuerdos de la academia, teniendo mayor peso
los siguientes apartados:
A) Resultados
B) Discusión
C) Conclusiones
D) Cuestionario
E) Bibliografía
El maestro detallará la forma de reportar dentro del encuadre, el día de la recepción del grupo.
Incluyendo el trabajo experimental y la discusión y participación en la práctica.
18.- Es obligación del alumno investigar sobre el tema de la práctica previa realización de ésta, en caso
de presentarse sin haber estudiado se considerará como falta de interés, afectando la calificación de la
participación de la misma.
19.- De igual manera, para aquél alumno que no se prepare para la discusión de las prácticas, se verá
afectado en la parte de su calificación de correspondiente a la misma.

VII
 INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL

Con la idea de que el alumno pueda manejar de manera más eficiente este Manual se hacen las
siguientes recomendaciones:
1.- Al principio del Manual se incluye un índice de las prácticas a realizar, que permite su rápida
localización.
2.- La secuencia de prácticas, está en función de los programas de teoría y cabe aclarar que en la primera
sesión se les indicará cuales prácticas se van a realizar durante el semestre.
3.- Todas las prácticas están subdivididas en dos partes:
a) Incluye la descripción metodológica de la práctica, que a su vez se subdivide en:
- Título de la práctica
- Objetivo de la práctica
- Prerrequisitos
- Introducción
- Material y Métodos
b) Contiene los elementos correspondientes al reporte de la práctica y se subdivide en:
- Resultados
- Discusión
- Conclusiones
- Cuestionario
- Bibliografía consultada
4.- A continuación se mencionan algunos aspectos significativos de cada uno de estos elementos:
a) Título de la práctica.- Indica el nombre de la práctica y la de manera específica de lo
que se va a realizar durante la sesión.
b) Objetivo de la práctica.- Señala lo que se espera que el alumno logre al término de esta.
c) Prerrequisitos.- Comprende una serie de puntos, que el alumno debe de conocer su
significado con anterioridad a la explicación de la práctica, para lo cual se recomienda
consultar la bibliografía recomendada al final de este Manual.
d) Introducción.- Información básica y muy breve, referente a la práctica a realizar.
e) Métodos y Materiales.- Es la descripción del desarrollo de la práctica, señalando el
equipo, cristalería y soluciones a utilizar en la práctica.
Es importante que el alumno entienda la secuencia del desarrollo antes de iniciar el
experimento, por lo cual es necesario que se lea antes de la sesión de explicación de la
práctica, para que pueda consultar sus dudas con el Docente.
f) Resultados.- En esta sección se anotan los datos obtenidos durante la sesión de la
práctica, de acuerdo a las indicaciones tanto del Manual como del Profesor.

VIII
h) Discusión.- Es una de las partes principales de todo experimento, ya que consiste en
realizar un análisis comparativo de los resultados esperados con respecto a los obtenidos,
llevando a cabo la argumentación necesaria de dichos resultados.
i) Conclusiones.- En base a los resultados obtenidos y a la discusión desarrollada,
concluir cuales son los puntos principales y que consecuencias a futuro plantean esta
práctica.
j) Bibliografía consultada.- En este punto se deben incluir las referencias bibliográficas
de los libros o artículos consultados, de acuerdo a los siguientes lineamientos:

En el caso de revistas:
Nombre(s) del autor(es), (año), Título del artículo Nombre de la Revista,
Volumen, Páginas consultadas

En el caso de libros:
Nombre(s) del autores), (año), Nombre del capítulo. Nombre del libro.
Editorial. Edición. País. Páginas consultadas.

IX
 PRÁCTICA # 1

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO
Determinar la importancia de la aplicación de la normatividad sobre la seguridad, en niveles de riesgo
en cualquier laboratorio para evitar accidentes.

PRERREQUISITOS

1. Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.

2. Diferencia entre ley y costumbre.
3. Organismos que rigen las normatividades.
4. Normas involucradas en la seguridad en los laboratorios.

INTRODUCCIÓN
➢ Bioseguridad es una palabra compuesta por bio (del latín que significa vida) y seguridad
(del latín securitas que significa ausencia de riesgo).
El riesgo es la vulnerabilidad ante un daño para personas, cosas y/o el medio ambiente. Existe una
variedad de riesgos en los que se encuentran los riesgos físicos, químicos, biológicos, ambientales,
laborales, financieros, políticos.
Sin embargo en el trabajo de un laboratorio, el nivel de bioseguridad depende del grupo de riesgo.
De acuerdo al manual de la Organización Mundial de Salud (2005), hace referencia al grupo de
riesgo con el nivel de bioseguridad y el tipo de laboratorio en que se trabaje, incluyendo como una
consecuencia las prácticas de laboratorio y el equipo de seguridad a utilizar, como se establece en
la tabla 1.
Tabla. Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo
(OMS, 2005)
Grupo de Nivel de Tipo de Prácticas de laboratorio Equipo de
riesgo bioseguridad laboratorio seguridad
1 Básico Enseñanaza TMA Ninguno; trabajo en
Nivel 1 básica, mesa de
investigación laboratorio al
descubierto
2 Básico Servicios de TMA y ropa protectora; Trabajo en mesa al
Nivel 2 atención señal de riesgo descubierto y CSB
primaria; biológico para posibles
diagnóstico, aerosoles
investigación
3 Contención Diagnóstico Prácticas de nivel 2 más CSB además de
Nivel 3 especial, ropa especial, acceso otros medios de
investigación controlado y flujo contención primaria
direccional del aire para todas las
actividades
4 Contención Unidades Prácticas de nivel 3 más CSB de clase iii o
máxima patógenos cámara de entrada con trajes presurizados
Nivel 4 peligrosos cierre hermético, salida junto con CSB de
con ducha y eliminación clase ii, autoclave
especial de residuos de doble puerta (a
través de la pared),
aire filtrado
TMA: técnicas microbiológicas apropiadas. CSB: cámara de seguridad biológica.
En el manejo de sustancias químicas reactivas también se encuentran presentes los riesgos, es por
eso que de acuerdo a la Secretaria de Trabajo y Prevención Social en su Norma 018-STPS-2000 y

10
al programa de Comunicación de Riesgos de la OSHA (Occupational Safety and Health
Administration), ha sido implementado el uso de las hojas de uso seguro de los materiales o material
safety data sheet (MSDS por sus siglas en ingles), mismas que están al alcance de todo el personal
usuario. Cada sustancia que se maneje en los laboratorios deberá estar debidamente etiquetada.
El Sistema de Comunicación de Riesgos (Right To Know) muy utilizado en los E.U.A. nos refiere de
manera explícita de los riesgos y daños a los cuales estamos expuestos por el manejo de una
sustancia y que equipo de protección personal se debe de utilizar. Aquí en México la Secretaria de
Trabajo y Previsión Social también se preocupa por los riesgos ocupacionales de los diferentes
centros de trabajo junto con la Secretaria de Salud, por lo que también existen señalizaciones para
determinar las áreas de trabajo, puertas de acceso, y salidas, áreas despejadas, código de tuberías
para sustancias que corran en ellas, etc. Es por eso que es muy importante tomar en cuenta las
barreras y el tipo de ellas.
Sin embargo en 1992 como un mandato internacional provisto por la Conferencia de las Naciones
Unidas sobre Desarrollo y Medio Ambiente (UNCED siglas en inglés), refiere en la agenda 21 párrafo
19,27: “Un Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación de Riesgos y Etiquetas Compatible,
incluyendo hojas de datos de uso seguro y simbología fácilmente entendible, debe estar disponible,
de ser factible, para el año 2000”
Por lo que en México se ha trabajado y actualizado la norma oficial mexicana NOM-018-STPS-2000,
Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas
peligrosas en los centros de trabajo a NOM-018-STPS-2015, Sistema Armonizado para la
Identificación y Comunicación de Peligros y Riesgos por Sustancias Químicas Peligrosas en los
Centros de Trabajo en base a la norma mexicana NMX-R-019-SCFI-2011 Sistema Armonizado de
Clasificación y Comunicación de Peligros de los Productos Químicos. Sistema Globalmente
Armonizado (GHS).
México tiene un periodo de tiempo para el proceso de adaptación a la actualización de la NOM-018-
STPS-2015 y vence hasta el 31 de diciembre del 2017, en la cual se verán modificados la
identificación (pictogramas) y comunicación (niveles) de los riesgos por sustancias químicas
peligrosas. (actualización 1 de diciembre del 2016, EEG)

También es importante hacer hincapié en el manejo apropiado de los desechos de las sustancias
químicas, tejidos, agares y material peligroso biológico infeccioso (RPBI), que se manejan en los
laboratorios los cuales son vigilados por la SEMARNAT y el departamento de ECOLOGIA ( a niveles
municipales, estatales y federales), ya que estos son dispuestos al medio ambiente, llámese agua
(a los drenajes que a pesar de llegar a una planta de tratamiento de agua residuales en algunas
ocasiones, estas siguen su curso a canales de irrigación y/o acequias para riego de cultivos y por
ende al subsuelo), cielo abierto (por la emisión de los gases y que contaminan el aire que respiramos)
o tierra (con la disposición de los residuos sólidos que impactan a el medio alterando los ciclos
naturales biológicos), por lo que contamos con la NOM-002-ECOL-1996 que establece los límites
máximos permisibles de contaminantes en las descargas residuales a los sistemas de alcantarillado
urbano o municipal.
Los residuos RPBI, son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de
humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioteros,
centros de enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, son considerados los
siguientes como se muestra en la tabla 2.

11
Tabla 2. Características físicas y biológicas de los residuos infecto-contagiosos
TIPO DE RESIDUO EDO. FÍSICO ENVASADO COLOR
Sangre Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Cultivos y cepas de agentes
Sólidos Bolsa de polietileno Rojo
infecciosos
Patológicos Sólidos Bolsa de polietileno Amarillo
Líquidos Recipientes herméticos Amarillo
Residuos no anatómicos Sólidos Bolsa de polietileno Rojo
Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Recipientes rígidos
Objetos punzocortantes Sólidos Rojo
poliprolileno

MATERIAL

Normatividad y sus actualizaciones, definiciones y conceptos de acuerdo al tema

METODO

Investigación del marco teórico sobre el cual se sustenta la minimización de los riesgos para la
realización del trabajo seguro en cualquier laboratorio

RESULTADOS

Conceptos
Normas (nomenclatura completa, nombre de la misma y propósito de la
misma)
Organismos reguladores

DISCUSIÓN

Ventajas y desventajas de la normatividad existente

CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Organización Mundial de la Salud, 2005, Principios Generales, Manual de Bioseguridad en el

Laboratorio, OMS. 3ra. ed., E.U.A., Pág. 2

Diario Oficial de la Federación. 2002. NOM-018-STPS-2002.

12
 PRÁCTICA # 2

DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN POR LA TÉCNICA DE LA DIFENILAMINA EN

BASE A SU CONTENIDO EN DESOXIRRIBOSA.

(revisión)
OBJETIVO GENERAL

Cuantificar ADN por el contenido de desoxirribosa por medio de la técnica de difenilamina.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Elaborar e interpretar una curva de calibración

Determinar y cuantificar la concentración de desoxirribosa presente de una solución tipo por medio
de la técnica
Comparar las concentraciones de la pentosa de la solución tipo, con la del problema de ADN

PRERREQUISITOS

1. Componentes de la molécula de ADN.

2. Diferencias entre nucleótidos y nucleósidos.
3. Diferencias entre ADN, ARN y proteínas.

INTRODUCCIÓN

En 1953 Watson y Crick realizaron un estudio de argumentación estereoquímica a la estructura

molecular del Ácido Desoxirribonucleico (ADN), ya que la información arrojada en un estudio de
datos de rayos X previamente publicado, les parecía insuficiente. Manifestando que este ácido
nucleico (ADN) estaba organizado como una doble hélice, en el cual giraba hacia la derecha sobre
su mismo eje, debido a la diada perpendicular al eje. La estructura de las cadenas consistía en
grupos fosfodiester unidos a los residuos de la β – D deoxyribofuranosa con los vínculos 3´, y 5´, que
definen también la orientación de una tira dada de la molécula de ADN y puesto que las dos tiras
corren en dirección opuesta, se dice que son antiparalelas, y la diada que mantiene unida a las dos
cadenas como elemento fundamental (figura 1), es la secuencia de bases purínicas y pirimidínicas.
(Watson and Crick, 1953)

Figura 1. Modelo de la estructura del ADN (Watson y Crick, 1953)

La estructura del ADN se va hidrolizando (rompiendo) de nucleótido de purina y nucleótido de

pirimidina a nucleósido de purina y nucleósido de pirimidina más fosfatos libres, luego se hidrolizan

13
los nucleósidos de purina a bases púricas y pentosas libres, las pirimidinas se quedan como están.
La difenilamina reacciona con 2 pentosas libres (deoxiribosas). En solución ácida, la cadena lineal
de una deoxipentosa se convierte en la forma ω-hidroxilevulinoaldehído altamente reactiva y que
reacciona con la difenilamina (figura 2) para dar un complejo azul (figura 3) con una absorción
definida máxima a 595 nm. En el ADN únicamente reacciona la desoxirribosa del nucleótido de
purina, así que el valor obtenido representa la mitad del total de deoxirribosa presente. (Clark and
Switzer, 1977)

Figura 2. Mecanismo de reacción del ensayo de difenilamina de Dische (Modificada de Patterson y

Mura, 2013).

Figura 3. Aplicación del ensayo colorimétrico de Dische (Patterson y Mura, 2013).

MATERIAL POR EQUIPO

Gradilla
8 tubos de ensaye
Vaso de precipitado
Pinzas para tubo de ensaye

MATERIAL POR MESA

Cuatro pipetas de 2 mL
Dos pipetas de 5 mL
Dos propipetas azules
Dos propipetas verdes
Pizeta

REACTIVOS POR MESA

Solución tipo Desoxirribosa 1 mg/mL
TCA 10%
Difenilamina

POR GRUPO
Caja de celdas de 2 mL

PROCEDIMIENTO
Preparar una curva de calibración de la solución tipo de deoxiribosa de acuerdo la tabla 1

14
 Tabla 1 Curva Tipo de desoxirribosa
Tubo Sol. tipo TCA Difenilamina Ejemplo [ADN]
1 mg/ml 10% mg/ml
Testigo --- 2.0 3.0 0.0
1 0.1 1.9 3.0 0.0125
2 0.2 1.8 3.0 0.0250
3 0.4 1.6 3.0 0.0500
4 0.6 1.4 3.0 0.0750
5 0.8 1.2 3.0 0.1000
6 1.0 1.0 3.0 0.1250
Problema X * 3.0 Y

La cantidad del problema (X) deberá tener de entre 0.1 a 1.0 ml, mientras que de TCA deberá de
tener de entre 1.9 a 1.0 ml, para que con los 3 ml de difenilamina tenga el tubo problema una cantidad
total de 5 ml

Para determinar la concentración de desoxirribosa para cada tubo, se deberá utilizar la siguiente
fórmula:

C1V1=C2V2
Ejemplo para el tubo 1
(1 mg/ml) (0.1 ml) = C2 (5 ml)

C2 = (1 mg/ml) (0.1 ml) / (5 ml)

C2 = 0.02 mg/ml

Colocar los tubos en baño a ebullición, estos se sacan cuando exista el cambio de color.
Enfriar a chorro de agua corriente y leer 595 nm de longitud de onda.

Nota: la absorbancia del problema se interpola en la curva de calibración

RESULTADOS

1.- Elaborar la curva tipo para la desoxirribosa en excel obteniendo la ecuación de la recta y la R2
para determinar la exactitud y confiabilidad estadística.

2.- En base a la interpolación de la muestra problema en la curva tipo de deoxiribosa, la

concentración de ADN de la muestra problema es de

DISCUSION

CONCLUSION

15
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

F.D. Watson and F.H.Crick, Nature, April 25, Vol. 171, p737-738, 1953

Clark, J. M. Jr., and Switzer, R.L., 1977, Experimental Biochemistry, W. H. Freeman Company,
Second Edition. E.U.A. p213

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in
Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

CUESTIONARIO

1.-Cual es la absorción de luz máxima y mínima de los ácidos nucleicos.

2.- Describa una técnica para identificar ARN.
3.-Describa las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos.

16
 PRÁCTICA # 3

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO SÉRICO

OBJETIVO GENERAL
Determinar la concentración de ácido úrico sérico por medio de la reacción del ácido fosfotúngstico.

OBJETIVO ESPECÍFICO
Comparar los resultados para descartar hiperuricemia y gota.

PRERREQUISITOS
1. Describir el metabolismo de los nucleótidos púricos
2. Describir el catabolismo de las bases purínicas
3. Enumerar las características metabólicas de la Gota.
4. Qué es el monourato de sodio y como se forma

INTRODUCCIÓN
La síntesis de nucleótidos es un proceso celular dinámico y continuo. Se requiere de estos para
llevar a cabo diversas actividades metabólicas en el organismo, esto último sin tomar en cuenta su
función primaria que es la de ser monómeros estructurales de los ácidos nucleicos.
La regulación de esta vía es compleja debido a que utiliza mecanismos de retroalimentación
negativa, regulación alostérica, así como procesos de recuperación de metabolitos, [síntesis del
monofosfato de inosina (IMP) a partir de intermedios anfibólicos “Síntesis de Novo”, fosforribosilación
de purinas, y fosforilación de nucleósidos de purina]. (Rodwell, V.W., PhD, 2003)
Con frecuencia se presentan desajustes en esta regulación, siendo un ejemplo clásico la
sobreproducción de ácido úrico como parte de una descompensación del catabolismo de los
nucleótidos purínicos. En la mayoría de los organismos este defecto no es perceptible, ya que al ser
el ácido úrico un producto de excreción, es eliminado en la orina.
Sin embargo, en pacientes con insuficiencia renal, la excreción del ácido úrico tiende a ser más lenta
y por lo tanto su concentración en sangre aumenta en forma considerable, generando un defecto
conocido hiperuricemia. En algunos pacientes la hiperuricemia es tal, que genera depósitos de
monourato sódico en los tejidos de las articulaciones de las extremidades inferiores. Estos depósitos
tienden a formar cristales que a menudo lesionan los tejidos provocando dolores muy intensos que
son característicos de la enfermedad llamada gota. Existiendo otras enfermedades genéticas del
metabolismo de las purinas como el síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia de la adenosina
desaminasa y deficiencia de la purina nucleósido fosforilasa. (Rodwell, V.W., PhD, 2003)

Para determinar la concentración de ácido úrico en sangre se utiliza el método del ácido
fosfotúngstico (constituido por ácido fosfórico y tungstato de sodio “que es el que precipita las
proteínas” con un conservador de sulfato de litio) (Folin and Macallun, 1912), que hace reaccionar al
ácido úrico con el ácido fosfotúngstico en un medio alcalino para formar alantoína y azul de
tungsteno, éste último genera un color muy estable que se mide en espectrofotómetro a una longitud
de onda de 640 nm.

17
MATERIAL POR EQUIPO
1 Gradilla
6 Tubos de ensaye
MATERIAL POR MESA
6 Pipetas de 1 ml
2 pipetas de 5 ml
2 Propipetas verdes
2 propipetas azules
Celdas para espectrofotómetro
REACTIVOS POR MESA
Solución preparada de ácido fosfotúngstico
Solución patrón de ácido úrico
Agua destilada
Solución de carbonato de sodio al 3.5%
POR GRUPO
Caja de celdas de 2mL

PROCEDIMIENTO

Preparar según la siguiente tabla:

TUBO BLANCO PATRÓN PROBLEMA

Ácido fosfotúngstico 1 mL 1 mL 1 mL
Agua destilada 0.3 mL ------------ ---------------
Suero control ------------ 0.3 mL ---------------
Suero no hemolizado ------------- ------------ 0.3 mL

Mezclar bien cada tubo y centrifugar los tubos problema y patrón a 2000 rpm por 5 minutos y
recuperar el sobrenadante.

En seguida preparar otra serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO BLANCO PATRÓN PROBLEMA

Carbonato de sodio al 3.5 % 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL
Sobrenadante tubo blanco 0.5 mL ------------ ---------------
Sobrenadante tubo patrón ------------ 0.5 mL ---------------
Sobrenadante tubo problema ------------- ------------ 0.5 mL

Mezclar bien cada tubo y dejar reposar durante 20 minutos.

Leer la absorbancia del problema y del patrón ajustando el fotocolorímetro a cero con el blanco a
una longitud de onda de 640 nm.

RESULTADOS
Valores de referencia
Hombres: 3.5 – 7.5 mg/dl
Mujeres: 2.5 – 6.5 mg/

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN

18
CUESTIONARIO

1.-Esquematice las bases púricas y pirimídicas:

2.-Describa cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las purinas.
3.-Mencione cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las pirimidinas.
4.- Esquematice la degradación de las bases púricas hasta 2CO2 + 4NH4+
5.- Defina:
a) Uremia:
b) Uricemia:
c) Uricaciduria:

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Rodwell, V. W. PhD, Chap. 34. Metabolism of Purine & Pyrimidine Nucleotide, Harper´s Ilustrated
Biochemistry,Twenty Six Edition, 2003, pag 292-302

Folin, O. and Macalum, A.B. Jr., A New Method For The (Colorimetric) Determination Of Uric Acid In
Urine. J. Biol.Chem.1912, 13:363-369

19
 PRÁCTICA # 4

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE DNA DE LEUCOCITOS

OBJETIVO GENERAL

Obtener DNA cromosómico de células blancas

OBJETIVO ESPECÍFICO

Determinar y cuantificar DNA obtenido por medio de la cuantificación del mismo con la técnica de
difenilamina ya aprendida

PRERREQUISITOS

1. Conocer la estructura de nucleósidos y nucleótidos.

2. Indicar las principales diferencias entre ADN y ARN.
3. Identificar los efectos fisicoquímicos de los detergentes y quelantes.
4. ¿Cuál es la fuente del ADN en la sangre?
5. Importancia de las endonucleasas de restricción.
6. ¿A qué se le llama solución fisiológica y cuál es su función?
7. Función de los leucocitos

INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son las moléculas que portan la información genética y regulan las funciones
celulares por lo cual es importante conocer sus características físicas, químicas y biológicas. Uno de
los principales descubrimientos que han llevado al desarrollo de la Ingeniería Genética son las
enzimas de restricción las cuales se caracterizan por cortar al ADN en secuencias específicas. Los
leucocitos son células nucleadas las cuales se encargan del trabajo inmunológico, estas pueden ser
separadas por una sustancia quelante como lo es el EDTA, la cual separa los factores de coagulación
y deja al descubierto a las células blancas para poder extraerlas del líquido plásmatico. Los
detergentes son sustancias necesarias para poder romper la tensión superficial de los lípidos
integrantes de las diferentes membranas, sin embargo la estructura de ADN es muy sensible a
cualquier tipo de cambio es por eso que se debe utilizar una solución que ayude a mantener estable
esa estructura, como puede ser la presencia de solución salina o similar.

MATERIAL POR EQUIPO

Gradilla con 5 tubos de ensaye
Tubos Eppendorf
Un tubo tapa morada con EDTA, soporte, aguja, torundas y alcohol
Dos goteros de plástico
Matraz Erlenmeyer de 125 ml
MATERIAL POR MESA
Una micropipeta de 10 a 200 ųl y puntas amarillas
Cuatro pipetas de 10 ml
Dos propipetas verdes
Piseta
REACTIVOS POR MESA
NaOH 0.2 N –SDS al 1%
Tritón x-100 al 1%
NaCl 0.1 M
Alcohol etílico al 96%
Agua destilada estéril
POR GRUPO
Celdas para espectrofotómetro de difenilamida

20
PROCEDIMIENTO

1. Tomar una muestra de 3 a 5 ml de sangre en un tubo Vacutainer con EDTA.

2. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para separar el plasma de los elementos formes de la sangre.
3. Separar con una pipeta Pasteur o con un gotero plástico graduado la capa blanca (leucocitos)
entre el plasma y los eritrocitos. Llevar las células blancas a otro tubo de ensaye y
4. Agregar 10 ml de agua destilada estéril. Tapar el tubo e invertir varias veces.
5. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.
6. Al sedimento (pequeño botón blanco) se le agregan 10 ml de Tritón X-10 al 1%. Tapar el tubo y
agitar suavemente de manera constante durante unos minutos hasta resuspender perfectamente el
sedimento.
7. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm
8. Agregar 10 ml de de SDS al 1% (agitar suavemente, tener cuidado de que quede bien
resuspendido).
9. Vaciar en un matraz y agitar suavemente durante unos minutos más.
10. Agregar 5 ml de NaCl 0.1 M, agitar y dejar reposar unos minutos
11. Agregar 5 ml de etanol frío. Agitar muy suavemente y observar cómo se precipitan los filamentos
que contienen el DNA
12. Colectar los filamentos con una varilla de vidrio muy delgada o por medio de reconcentración en
un tubo Ependorff conteniendo 0.2 ml de agua destilada estéril
13. Una parte del ADN aislados
14. Se guarda en el refrigerador a –20ºC hasta correr la electroforesis
15. La otra aparte de la muestra se trabaja en cuantificación por medio de la técnica de la difenilamina

RESULTADOS

En esta sesión se obtuvo una muestra que se correrá en la electroforesis, sin embargo la otra
muestra se cuantifico y se obtuvo una cantidad de

DISCUSION

Centrar la discusión explicando la función de cada uno de los reactivos utilizados.

CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA

CUESTIONARIO

1.- Mencione 5 características que permitan identificar al ADN

2.- Mencione 3 diferencias del ADN con respecto a las proteínas y 3 diferencias con ARN.

21
 PRÁCTICA # 5

SEPARACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

OBJETIVO

El alumno conocerá la técnica de electroforesis como una herramienta para la separación e

identificación de ADN.

PREREQUISITOS

1. Definir electroforesis.

2. Cuál es el fundamento de la electroforesis del ADN en geles de agarosa.

3. Cuáles son las diferencias entre la electroforesis y la cromatografía en capa fina.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica que ha revolucionado los trabajos de investigación sobre los ácidos
nucleicos, ya que permite analizar fragmentos de ADN o en su caso obtener la secuencia total del
ADN. Se basa en la separación de compuestos debido a su carga y en este caso debido al peso
molecular de los fragmentos de ADN ya que como se sabe el ADN tiene carga negativa debido a los
grupos fosfato. Esta técnica permite identificar fracciones de ADN y a su vez aislar dichos fragmentos
para su estudio posterior. En esta sesión se va a analizar el ADN de la muestra (si trabajo extracción
de un plásmido es igual), que se extrajo en la sesión anterior para identificar su peso molecular y las
características de la extracción.

La electroforesis de DNA es una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las

técnicas del DNA. La idea de fue desarrollada por Vin Thorne, a mediados de los años 60 quién
estaba interesado en caracterizar las distintas formas de DNA que se obtenían de partículas
purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de
fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes
moléculas de ADN. Sometidos a un campo eléctrico, la carga neta negativa del DNA y el RNA hará
que se muevan en dirección al ánodo. Si se fuerza a los ácidos nucleicos a moverse a través de un
gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará que las
moléculas de mayor tamaño migren con más lentitud, mientras las de menor tamaño avanzan más
en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de su tamaño (Fierro).

MATERIAL POR EQUIPO

Tubos Eppendorf

MATERIAL POR MESA

Micropipeta de 10 a 200μl y puntas amarillas
Cámara para electroforesis

REACITVOS POR MESA

Gel de agarosa de alta resolución
Amortiguador Tris boratos 1 x
Agua destilada estéril
Buffer de carga 20 x
Solución amortiguadora TE

22
PROCEDIMIENTO

1. Re suspender la muestra de ADN en 10 ul de amortiguador TE.

2. Dejar la solución en re suspensión y proceder a preparar el gel de agarosa.

3. Pesar 0.6 g de agarosa y disolver en 60 ml de amortiguador de tris-boratos 1X.

4. Calentar hasta disolver y enfriar al chorro de agua hasta que alcance una temperatura de un
poco mayor que la corporal.

5. Vaciar en la cámara de electroforesis y dejar que solidifique.

6. Eliminar los peines y añadir 60 ml de amortiguador tris-boratos 1X.

7. En el tubo Eppendorf con 10 ul del ADN recién disuelto añadir 10 ul de agua y 2 ul de

amortiguador de carga 20 X.

8. Mezclar y centrifugar 2 segundos en la microcentrífuga.

9. Tomar los 22 ul y colocarlo en uno de los pozos del gel de agarosa.

10. Una vez que se hayan colocado todas las muestras añadir 2 ul de amortiguador de carga en
los pozos vacíos.

11. Tapar la cámara y colocar los cables para realizar la electroforesis a 90 mA durante 1 hora.

NOTA: Este paso es de cuidado por lo cual se recomienda que lo realice el profesor de laboratorio
para evitar accidentes.

12. Una vez desconectada la fuente de poder añadir 3 gotas de bromuro de Etidio sobre el gel
mezclar y reposar 10 minutos

13. Enjuagar varias veces con agua destilada.

14. Desprender el gel y observarlo a través del transiluminador de luz ultravioleta

NOTA: El transiluminador emite luz ultravioleta la cual es peligrosa para el ser humano
especialmente para los ojos, por lo tanto solo observar el gel utilizando una pantalla de acrílico.

RESULTADOS

Esquematize los resultados obtenidos por todos los equipos del laboratorio.

DISCUSION

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CONCLUSION

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23
CUESTIONARIO

1.- Indique cuales son los efectos de la luz ultravioleta sobre los ácidos nucleicos.

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2.- Explique cuál es la función del bromuro de Etidio.

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3.- El amortiguador de carga contiene sacarosa al 25 % indique cuál es su función.

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4.- Explique el fundamento de la separación electroforética del ADN

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5.- Mencione otro procedimiento de separación de ADN

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_______________________________________________________________________________

6.- Que enfoque en el campo médico tiene este tipo de experimento

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7.- Defina terapia génica.

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BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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24
 PRÁCTICA # 6

EFECTO MUTAGÉNICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA

OBJETIVO

Observar, mediante el conteo de la biomasa de una cepa de Escherichia coli susceptible a la luz
ultravioleta, los efectos mutagénicos y la posible capacidad de reparación del ADN que presenta
esta bacteria.

PRERREQUISITOS

1. Replicación del ADN

2. Tipos de errores de copia posibles durante la replicación

3. Mecanismos de Reparación del ADN

4. Tipos de Mutaciones

INTRODUCCIÓN

Todos los organismos vivos contienen ADN. Este tiene la función primordial de regular la actividad
metabólica y funcional de cada organismo. Para que esto suceda, es necesario que la célula
garantice la sucesión de su ADN en las células hijas al momento de dividirse. Para esto, cuenta con
sistemas que permiten que el ADN se auto replique justo antes de la división. Sin embargo, esta auto
replicación está muy lejos de ser segura, debido a que existen una serie de elementos que tienden
a modificar la secuencia de nucleótidos normal del ADN. A estos elementos se les llama agentes
mutagénicos, ya que su efecto principal es provocar errores de copia en el ADN durante la
replicación. Si estos errores no son oportunamente reparados, van a provocar modificaciones en la
secuencia del ADN que serán incluidos en las posteriores replicaciones. Si estas modificaciones se
expresan genotípica y fenotípicamente, entonces el error de copia se convierte en una mutación que
puede en un momento dado modificar a tal grado la información genética que hace imposible la
actividad biológica de la célula y sobreviene la muerte.

Uno de los agentes mutagénicos más agresivo es la radiación ultravioleta cuyo efecto sobre el ADN
es promover la formación de dímeros de timina. Estos dímeros son reparables por medio de la
enzima fotoreactivante, la cual es una enzima muy activa en presencia de fotones luminosos. La
ausencia de luz impide por lo tanto la reparación de este tipo de mutaciones.

MATERIAL POR EQUIPO

Gradilla con 5 tubos de ensaye
Cajas de Petri con agar nutritivo
Asa bacteriológica
Papel aluminio
MATERIAL POR MESA
Pizeta
REACTIVOS POR MESA
Cepa de Echerichia coli

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PROCEDIMIENTO

1. Se siembra una cepa de E. coli en el matraz Erlenmeyer con los 50 ml. de caldo nutritivo,
colocándolo en la estufa de incubación a 37ºC durante 24 horas.

2. Se mide la densidad óptica del cultivo antes y después de las 24 horas de incubación colocando
el medio líquido en el colorímetro y midiendo la absorbancia a 550 nm.

3. Tomando como referencia que la densidad óptica para esta bacteria es de 1 x 108 bacterias por
ml. se realiza el cálculo para hacer diluciones hasta obtener 300 bacterias del cultivo líquido en una
décima de ml.

4. Se siembra una décima de ml en cada caja de Petri previamente provista de medio de agar
nutritivo (distribuir equitativamente).

5. Enumerar las cajas del uno al cuatro con marcador de tinta indeleble y se aplica el siguiente
tratamiento de luz ultravioleta:

a) caja # 1 se utiliza como testigo.

b) caja # 2 se somete a 15 segundos de radiación ultravioleta y se envuelve inmediatamente en

papel estaño para evitar contacto con la luz de día.

c) caja # 3 se somete a 15 segundos de radiación ultravioleta y se expone a la luz durante 10

minutos.

d) caja # 4 se somete a 30 segundos de radiación ultravioleta y se envuelve inmediatamente en

papel estaño para evitar contacto con la luz de día.

e) caja # 5 se somete a 30 segundos de radiación ultravioleta y se expone a la luz durante 10

minutos.

f) caja # 6 se somete a 60 segundos de radiación ultravioleta y se envuelve inmediatamente en

papel estaño para evitar contacto con la luz de día.

e) caja # 7 se somete a 60 segundos de radiación ultravioleta y se expone a la luz durante 10

minutos.

6. Una vez llevado a cabo este tratamiento, se incuban las cajas Petri durante 24 a 48 horas y se
cuentan las colonias.

RESULTADOS

Caja 1 2 3 4 5 6 7
Cuenta viable
Porcentaje de sobrevivencia
Efecto mutagénico

DISCUSIÓN

Enfoque su discusión en base al análisis de los resultados comparando el % de sobrevivencia con

respecto al % de mutantes por placa

CONCLUSIÓN

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CUESTIONARIO

1.- Explique con fórmulas químicas cual es el principal efecto de la luz ultravioleta sobre el ADN:

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_______________________________________________________________________________
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2.- Indique cuales son los principales daños que se pueden presentar en un humano cuando se
expone por períodos prolongados a radiaciones ultravioleta:

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3.- Cual es la función químicamente hablando de la capa de ozono en la atmósfera para

protegernos de las radiaciones ultravioleta emitidas por el sol:

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4.- Explique cuál es la razón de que la luz ultravioleta sea capaz de causar mutaciones en los
organismos:

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5.- Explique cómo funcionan los mecanismos de reparación de mutaciones (2 tipos):

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6.- Complementarios.

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BIBLIOGRAFÍA

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 PRÁCTICA # 7

DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO

Determinar el proceso de digestión de los carbohidratos mediante la absorción de los mismos con
el Test de O´Sullivan (determinación de Diabetes Gestacional) y la prueba Postprandrial
(determinación de Diabetes por alimentación), por el método enzimático espectrofotocolorimétrico
para determinar el buen funcionamiento de los Islotes de Langerhans en el Páncreas, descartando
la patología de la Diabetes Mellitus

PRERREQUISITOS

1._ Clasificación o tipos de Diabetes

2._ Que es el ayuno y cómo influye en el metabolismo

3._ Clasificación de ayuno

4._ Importancia médica de la prueba postprandrial

5._ Importancia médica del Test de O¨Sullivan

6._ Que es la curva de tolerancia a la glucosa

7._ Que es la hemoglobina glucosilada

INTRODUCCIÓN

La Diabetes Mellitus es un conjunto de trastornos metabólicos que se caracteriza por un aumento de

niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia). Es causada por varios factores, siendo el más
relevante la baja producción de insulina, la cual es secretada por las células β de los islotes de
Langerhans en el páncreas, y que regula la entrada de glucosa a la célula. Otro es el inadecuado
uso de esta hormona debido al exceso y/o deficiencia de ingesta alimentaria; y la resistencia a la
insulina, que en realidad es la producción insuficiente o daño de los receptores que se encargan de
dar entrada a la glucosa a las células y que es común en las personas con sobrepeso. Sin embargo
se habla de factores genéticos como otro punto importante en el desarrollo de la patología Diabetes

La diabetes se puede clasificar en diabetes tipo I o insulino dependiente, diabetes tipo II o resistente
a la insulina y diabetes gestacional, que se desarrolla solo mientras existe embarazo afectando así
al metabolismo de la madre, esta patología puede determinarse por la cuantificación de glucosa
sérica mediante análisis diferentes dependiendo del paciente: Test de O´Sullivan, prueba
posprandrial o curva de tolerancia a la glucosa.

MATERAL POR EQUIPO

Una gradilla
Cuatro tubos de ensaye
Pizeta con agua destilada
Un vaso de precipitado de 200 mL
Dos muestras sanguíneas

MATERAL POR MESA

Cuatro pipetas de 1.0 mL
Tres propipetas de 1.0 mL
Una micropipeta 10 µL
Puntas para micropipeta

28
REACTIVOS POR MESA
Glucosa oxidasa
Solución estándar o suero control

POR GRUPO
Caja de celdas de 1 mL

PROCEDIMIENTO
La primera muestra de sangre (basal) se toma en ayunas, minutos después se ingiere una solución
de glucosa al 50 % de agua destilada. La otra muestra de sangre se toma al haber transcurrido dos
horas. Preparar una serie de tubos acorde a la siguiente tabla:

REACTIVOS TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

PROBLEMA 1 PROBLEMA 2
BLANCO ESTÁNDAR
(BASAL) (DOS HORAS)

Reactivo de Glucosa 1.0mL 1.0mL 1.0mL 1.0mL

Agua destilada 0.010mL (10 µL) ---- ---- ----

Solución estándar o Suero ----

---- 0.010mL (10 µL) ----
control

Suero problema (basal) ---- ----- 0.010mL (10 µL) ----

Suero problema (dos horas) ---- ----- ----- 0.010mL (10 µL)

Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente. Leer la
absorbancia del problema y el patrón ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda de
500nm.

CÁLCULOS

Absorbancia del problema

Glucosa mg/dL = X Concentración del estándar
Absorbancia del estándar

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RESULTADOS

DISCUSION

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CONCLUSION

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BIBLIOGRAFIA

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 PRÁCTICA # 8

DIGESTIÓN DE PROTEÍNAS GÁSTRICAS

OBJETIVO

Describir los procesos enzimáticos que con llevan a la digestión de las proteínas de la dieta que
entran en el tracto gastrointestinal.

PRERREQUISITOS

1. Definir los terminos proenzima, zimogeno, serin-proteasa, arilamidasa

2. Describir el proceso enzimatico-hormonal presente en el tracto intestinal.

3. Describir los procesos de absorción intestinal de proteínas.

INTRODUCCION

Uno de los procesos enzimáticos más interesantes es el que se desarrolla en el tracto

gastrointestinal, cuando es necesario digerir proteínas de la dieta. Estas proteínas son digeridas en
el tubo digestivo por enzimas proteolíticas y peptidasas que dejan libres sus aminoácidos
constituyentes. Algunas proteínas de cadena corta y péptidos se absorben directamente del
intestino, pero la mayor parte de los productos de su digestión circulan en forma de aminoácidos.
Con excepción de las peptidasas intestinales, todas las enzimas proteolíticas intestinales se activan
mediante la conversión de precursores inactivos de gran tamaño, llamados zimógenos, más
pequeñas enzimas activas. Uno de los primeros zimógenos que se activan es el pepsinógeno que
se produce por las células principales bajo el estímulo de la gastrina. Este pepsinógeno se
autocataliza a pH bajo dando porciones activas llamadas pepsinas que a su vez catalizan a otros
zimógenos.

Las enzimas proteolíticas se liberan al intestino como respuesta de la actividad hormonal de la

colestocinina-pancreozimina cuya función se da como respuesta de la llegada del quimo al intestino
delgado dando por resultado la liberación de quimotripsinógeno, tripsinógeno, proelastasa y
procarboxipetidasa que son activados principalmente por efecto de la tripsina y pepsina
principalmente. La absorción de proteínas se dará en función a la capacidad proteolítica intestinal y
regularmente esta no es muy activa por lo cual se absorben gran cantidad de péptidos pequeños
además de los aminoácidos. Sin embargo las células de la mucosa intestinal tienen capacidad
peptidolítica para degradar dichos péptidos antes de pasar al torrente circulatorio.

La intensión de este experimento es la de promover la hidrólisis de una proteína utilizando dos tipos
de enzimas intestinales como son la pepsina y la tripsina para poder comparar la capacidad
proteolítica de cada una de ellas analizando por cromatografía los productos de la digestión de la
proteína.

MATERIAL POR EQUIPO

Gradilla con 9 tubos de ensayo
Placa de cromatografía en capa fina
Capilares
Papel parafilm
MATERIAL POR MESA
Ocho pipetas de 1mL
Cuatro propipetas azules
Equipo para cromatografía en capa fina.

31
REACTIVOS POR MESA
Proteínas (albúmina, peptona y gelatina al 0.5 %)
Enzimas (Proteinasa K 0.005%, Pepsina 0.1%, Tripsina 0.1%)
HCl 0.1N
Bicarbonato de sodio 0.1M
Atomizador con Ninhidrina 0.1%
POR GRUPO
Cámara para cromatografía en capa fina con fase móvil

PROCEDIMIENTO

1. Preparar una solución de proteína (albumina, peptona o gelatina) al 2.0% en HCl 0.1 N (o por
separado) y etiquetarla como "Proteína".

2. Preparar una solución de pepsina al 0.1% en agua destilada.

3. Preparar una solución de tripsina al 0.1% en agua destilada.

4. Preparar una solución de proteinasa K al 0.005% en agua destilada

5. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubos
Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Albúmina 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Gelatina 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Peptona 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Pepsina 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Tripsina 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Proteinasa K 0.2mL 0.2mL 0.2mL
HCl 0.2mL 0.2mL 0.2mL
Bicarbonato
de Sodio 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL

6. Mezclar el contenido de cada tubo e incubar todos los tubos durante 24 horas a 37⁰C.

7. Enfriar al chorro de agua y proceder a colocar una muestra de cada tubo en la placa de silica gel
previamente activada.

8. Utilizando un solvente de butanol - ácido acético -agua (40-10-50) proceder a correr el

cromatograma por 1 hora.

9. Revelar el cromatograma con nihidrina al 2% en etanol de 96%.

10. Calcular los Rf para cada mancha que quede bien definida.

32
RESULTADOS

Rf de la albumina - pepsina

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Rf de la peptona – pepsina

________________________________________________________________

Rf de la gelatina – pepsina

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Rf de la albumina – tripsina

________________________________________________________________

Rf de la peptona – tripsina

________________________________________________________________

Rf de la gelatina – tripsina

________________________________________________________________

Rf de la albumina – proteinasa K

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Rf de la peptona – proteinasa K

________________________________________________________________

Rf de la gelatina – proteinasa K

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DISCUSIÓN

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CONCLUSIÓN

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CUESTIONARIO

1._ Cuál es el fundamento de la cromatografía.

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2._ Describa los tipos de análisis cromatográficos existentes.

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3._ Que es Rf y como se calcula.

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4._ Cuál es la fuente principal más frecuentemente utilizada en el diagnóstico clinico para la
tripsina.

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5._ En que parte del organismo se comienza la digestión de las proteínas.

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6._ Cuál es la función del HCl en el jugo gástrico y cuál es su pH.

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7._ De qué se compone el jugo gástrico y en qué porcentajes.

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8._ Cuál es la función de la pepsina en aparato digestivo

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9._ Diga cuál es la endopepsidasa específica para enlaces peptídicos de aminoácidos básicos.

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10._ Diferencia entre endopepsidasas y exopepsidasa

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11._ Describa con un esquema los puntos de rompimiento que se generan por medio de la tripsina.

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12._Mencione las diferencias funcionales entre la tripsina y la carboxipeptidasa.

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13._Mencione los posibles mecanismos de absorción de aminoácidos y péptidos a través de la

mucosa intestinal.

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14._Explique el comportamiento del equilibrio nitrogenado cuando hay una ingesta excesiva de
proteínas.

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BIBLIOGRAFIA

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35
 PRÁCTICA # 9

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA (DIGESTIÓN INTESTINAL DE GRASAS)

OBJETIVO

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de describir los mecanismos de absorción
intestinal de las grasas, así como, enumerar las diferentes características que complementan el
experimento.

PREREQUISITOS

1. Efecto de los ácidos biliares en la absorción de las grasas.

2. Definir emulsificación y saponificación.

3. Características, origen y función de las lipasas.

INTRODUCCIÓN

Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrólisis de enlaces éster que se encuentran en un gran
número de lípidos saponificables (figura 1).

Figura 1. Acción catalítica de las lipasas (Rivas-González, 2015)

Estas enzimas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y son especialmente importantes en

el tracto gastrointestinal, donde participan en la digestión y absorción de grasas.

Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben de actuar en la interfase lípido-
agua. Consecuentemente, los agentes emulsificantes tales como las sales biliares producen a
menudo una estimulación marcada de la hidrólisis enzimática de los lípidos, debido al incremento de
la interfase lípido-agua. En la leche homogenizada, los glóbulos de grasa están finamente divididos
y este material sirve como sustrato excelente para las lipasas.

En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente que se encuentra en el
páncreas.

MATERIAL POR EQUIPO

Ocho matraces Erlenmeyer de 125 ml
Gradilla con ocho tubos de ensaye
Bureta para hidróxidos y soporte
Pipetas de 1, 5 y 10 ml

MATERIAL POR MESA

Dos pipetas de 10 ml
Cuatro pipetas de 5 ml
Cuatro propipetas verdes

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REACTIVOS POR MESA
Leche
Lipasa pancreática
Lipasa pancreática calentada (hervida por 5 minutos)
Bilis (desoxicolato de Sodio 1%)
KOH al 0.1 N
Fenolftaleína al 1% en solución alcohólica
Alcohol de 96º

PROCEDIMIENTO

Preparar una serie de 8 matraces Erlenmeyer de 125 ml de acuerdo a la siguiente tabla:

Matraz
Reactivos T1 1 2 3 4 5 6 T2
Leche 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL 5mL
Lipasa pancreática 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL
Lipasa pancreática
calentada 1.5mL 1.5mL
Bilis (desoxicolato de
Sodio) 1.5mL 1.5mL 1.5mL 1.5mL
Tiempo de incubación 45 15 30 45 15 30 45 45
37⁰C minutos minutos minutos minutos minutos minutos minutos minutos

Tabla 5 Actividad de la Lipasa Pancreática

Después de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubación, retirarlo del baño, adicionar 12.5
ml de alcohol 96º y 3 gotas de fenolftaleína (indicador) enseguida titular con KOH 0.1N.

Agitar el matraz durante la titulación tan rigurosamente como sea posible, ya que la proteína
precipitada puede enmascarar los ácidos grasos.

Titular cada matraz tan rápido como sea posible (contra un fondo blanco), el color se tornara rosa y
se debe mantener durante 1 minuto, debido a que la digestión por la lipasa continúa durante la
titulación.

RESULTADOS

Gasto de Diferencia
Matraz Relación
KOH de gasto
T1
1 1-T1
2 2-T1
3 3-T1
4 4-T2
5 5-T2
6 6-T2
T2

37
En una hoja de papel milimétrico anexa, graficar en el eje de las y (ordenadas) la diferencia de
gasto de KOH y en el eje de las x (abscisas) el tiempo de incubación.

DISCUSIÓN

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CONCLUSIÓN

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CUESTIONARIO

1.- Con que otro nombre se le conoce a la lipasa gástrica y diga cuál es su función durante el
proceso digestivo.

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2._ Diga cuales son las diferencias entre una lipasa y una esterasa.

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3._ Mencione tres enfermedades en las cuales participen los triacilgliceroles en el transporte y
almacenaje de lípidos.

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4._Que diferencia hay entre los triacilgliceroles y los fosfogliceroles, esfingomielina y

glucoesfingolípidos.

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_______________________________________________________________________________

5._ Indique las propiedades de las sales biliares.

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___________________

6._ Mencione 3 tipos de lipasa y cuáles son sus diferencias funcionales (referido a los productos
que se obtienen).

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38
7._ Diga cuál es el modo de activación de la lipasa pancreática y las condiciones óptimas para su
actividad.

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8._ Mencione 3 posibles causas de esteatorrea.

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9._ Cuál es la función del clofibrato en pacientes hipercolesterolémicos y por qué.

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___________________

10._ Cuál es la función del desoxicolato de Sodio sobre la estructura inicial lipídica.

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BIBLIOGRAFÍA

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39
 PRÁCTICA # 10

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE FOSFOLÍPIDOS

OBJETIVO

Extraer los fosfolípidos de las grasas neutras de una muestra cualquiera e identificarlos por medio
de una cromatografía de acuerdo a su composición en base a la fracción colina o amino que estos
tengan.

PRERREQUISITOS

1. ¿Qué es un fosfolípído?
2. Importancia bioquímica de los fosfolípidos
3. Importancia médica y nutriológica de los fosfolípidos
4. Diferencia entre soluciones polares y no polares
5. ¿Qué es la colina y cuál es su importancia biomédica?

INTRODUCCIÓN

Los lípidos están constituidos básicamente por tres elementos: Carbono (C), Hidrógeno (H) y
Oxígeno (O); en menor grado aparecen también en ellos Nitrógeno (N), Fósforo (P) y Azufre (S).
Una característica básica de los lípidos, y de la que derivan sus principales propiedades biológicas
es la hidrofobicidad.
La baja solubilidad de los lipídos se debe a que su estructura química es fundamentalmente
hidrocarbonada (alifática, alicíclica o aromática), con gran cantidad de enlaces C-H y C-C.
Los fosfolípidos son aquellos lípidos que están constituidos por ácido fosfórico derivado del
glicerofosfórico que están formados por una molécula de glicerol esterificada en las posiciones 1 y 2
por dos ácidos grasos, con la posición 3 esterificada por un ácido fosfórico que lleva unidas además
otras estructuras, dependiendo del fosfolípido de que se trate. De forma genérica se denominan
"lecitinas", aunque se considera que la lecitina propiamente dicha es la fosfatidilcolina. Los
fosfolípidos son los principales constituyentes lipídicos de las membranas biológicas, donde forman
estructuras en bicapa, con las zonas no polares orientadas hacia el interior. Consecuentemente, los
fosfolípidos se van a encontrar presentes en la mayoría de los alimentos complejos, en los que exista
material celular.

40
MATERIAL POR EQUIPO
Matraz Erlenmeyer de 1 litro (preferentemente)
Gradilla con 8 tubos de ensaye
Tres placas para cromatografía en capa fina
Capilares
Papel filtro
Vaso de precipitado de 200 mL
MATERIAL POR MESA
Probeta de 100 mL
Pizeta
REACTIVOS POR MESA
Cloroformo-metanol (2:1, v/v)
KCl 0.1 M
Reactivo de Molibdato
Reactivo de Bismuto
Ninhidrina
POR GRUPO
Cámara para cromatografía de lípidos con fase móvil

PROCEDIMIENTO
A. Preparación de la muestra
1. Obtener la yema de un huevo (puede ser cualquier muestra) y mezclar con 50 ml de cloroformo:
metanol (2:1, v/v), agitar durante 20 minutos chocando con las paredes del frasco y filtrar (este
tratamiento permite extraer los fosfolípidos de los lípidos neutros).
2. Agitar el filtrado claro con 20 ml de KCl 0.1 M y centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm
3. Desechar la fase acuosa (parte superior) y utilizar la fase orgánica para la cromatografía

B. Preparación de la placa y aplicación de la muestra

Identificar su placa con una marca con lápiz en la parte superior, hacer una muesca en cada lado de
la placa aproximadamente 1.5 cm de la parte inferior y calentar en el horno por unos minutos a 80ºC
para su activación (no es necesaria si es nueva la placa), enseguida aplicar una muestra colocando
primeo una gota, dejar secar al aire y volver a colocar una segunda gota sobre la primera, hacer lo
mismo con todas las muestras que someta a la cromatografía.

C. Desarrollo del cromatograma

1. Colocar las placas en la cámara de cromatografía
2. Sellar con grasa y dejar correr los cromatogramas hasta 1 cm antes de llegar a la parte superior
3. Sacar los cromatogramas con cuidado, colocándolos en el horno o a la estufa a 80ºC

D. Revelado de los cromatogramas

Placa #1 Impregnar con el reactivo de molibdato y esperar 10 minutos para la aparición del color
azul. Reacciona con todos los fosfolípidos
Placa #2 Revelar con el reactivo de Bismuto (recién preparado), el cual es específico para
fosfolípidos que contienen colina
Placa #3 Revelar con el reactivo de ninhidrina, el cual es específico para aminofosfolípidos. Una
vez rociada la laca con ninhidrina colocar la placa en la estufa a 80ºC por unos minutos

41
RESULTADOS
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DISCUSIÓN
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CONCLUSIÓN
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BIBLIOGRAFÍA
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 PRÁCTICA # 11

DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS SÉRICAS

OBJETIVO

Cuantificar la transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y la transaminasa glutámico oxaloacética

(TGO) en el suero e interpretar fenómenos fisiológicos, metabólicos y patológicos relacionados con
estas enzimas.

PRERREQUISITOS

1. Función de las transferasas.

2. Fundamentos metabólicos de las transaminaciones.
3. Importancia Clínica de TGO y TGP.

INTRODUCCIÓN

Las transaminasas son enzimas que realizan la interconversión de aminoácidos alfa-cetoácidos por
transferencia de grupos amino. Existe una gran variedad de transaminasas con diferente significado
fisiológico, de ellas la TGO y TGP son las más importantes desde un punto de vista clínico.

La TGO cataliza la siguiente reacción:

L-aspartato + α cetoglutarato <--------> oxaloacetato + L-glutamato

La TGP cataliza la siguiente reacción:

L-alanina + α cetoglutarato <--------> piruvato + L-glutamato

(Reitman y Frankel, 1957)

Estas reacciones son reversibles y utilizan fosfato de piridoxal como coenzima. Estas transaminasas
están distribuidas ampliamente en tejidos animales en forma principal de tejido hepático y tejido
cardíaco y en forma secundaria en plasma, bilis y fluido cerebroespinal sus niveles extracelulares
deben ser bajos en condiciones normales y solo cuando hay lesión celular se podrán encontrar altos
títulos de estas enzimas.
En pacientes con infarto al miocardio o con lesión hepática aguda se encontrarán altos títulos de
dichas transaminasas los cuales se mantendrán elevados por un periodo de 24 a 36 horas en caso
de infarto y por mucho más tiempo en caso de lesión hepática. Pueden ser detectadas en orina
siempre y cuando haya una lesión a nivel renal (Ward and Cockayne, 1996).

MATERIAL POR EQUIPO

Siete tubos de ensaye
Una gradilla
Celdas de 2 mL para espectrofotómetro
Un vaso de precipitado de 200 mL
Una pizeta con agua destilada

MATERIAL POR MESA

Ocho pipetas de 2.0 mL
Dos pipetas de 10 mL
Seis propipetas de 1.0 mL
Dos propipetas de 10 mL

43
REACTIVOS POR MESA
Sustrato de TGO y TGP
Estándar de Piruvato, agua destilada,
Dinitrofenilhidracina o reactivo de color
NaOH al 0.4 N

PROCEDIMIENTO
Se utilizará la reacción de dinitrofenilhidracina para cuantificar a ambas transaminasas. Estas
reacciones tienen los siguientes fundamentos químicos:
Tanto el substrato de dl-alanina en solución amortiguadora de pH 7.4 reacciona con la STGP
produciendo piruvato, como el substrato de l-aspartato en solución amortiguadora de pH 7.4
reacciona con la STGO produciendo oxaloacetato, los cuáles en medio alcalino reaccionan con la
2,4-dinitrofenilhidracina formando en ambas fenilcarbazonas (dinitrofenilhidrazonas), que pueden ser
cuantificables a una longitud de onda de 505 nm
(Reitman and Frankel, 1957)

A). Elaborar una curva de calibración como se muestra en la tabla 1

Tubo ml de piruvato Sustrato de H2O Abs GPT (U/l) GOT (U/l)

GPT destilada
1 0 1.0 0.2 --- 0 0
2 0.05 0.95 0.2 --- 9 7
3 0.10 0.90 0.2 --- 18 12
4 0.15 0.85 0.2 --- 25 20
5 0.20 0.80 0.2 --- 37 28
6 0.25 0.75 0.2 --- 46 37
7 0.30 0.70 0.2 --- 56 48
8 0.40 0.60 0.2 --- 79 81
9 0.50 0.50 0.2 --- 113 -
Tabla 1. Preparación para la curva de calibración (Reitman y Frankel, 1957)

1. Agregar 1.0 ml de dinitrofenilhidracina. Reposar 20 minutos.

2. Agregar 10 ml de NaOH 0.4 N. Reposar 10 minutos
3. Leer a 505 nm ajustando el espectrofotometro con el tubo número 1
4. Elaborar una gráfica en funcionamiento a las unidades GOT y GPT correspondientes

44
Gráfica 1. Curva de calibración de unidades TGO/TGP

45
B). Preparación de los problemas

Para la cuantificación de las transaminasas, solo se prepara un tubo problema por cada
determinación (tabla 2) y se utiliza un blanco de agua destilada para ajustar el fotocolorímetro.

Reactivos Problema Problema TGP

Blanco TGO
1. Solución amortiguadora de
substrato 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
2. Pre incubación a 37º C por 10
minutos.

3. Suero (no hemolizado) 0.2 ml 0.2 ml

4. Mezclar e incubar a 37ºC por 60 min por 30 mins

5. Reactivo de dinitrofenilhidracina
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

6. Mezclar y dejar reposar a

temperatura ambiente por 20
minutos

7. Hidróxido de sodio 0.4 N 5 ml 5 ml 5 ml

8. Mezclar y reposar 5 minutos a

temperatura ambiente
Tabla 2. Muestra problema

9.-Medir la absorbancia tanto de TGO como TGP a 505nm calibrando el espectrofotómetro con el
blanco. (Reitman and Frankel, 1957)

10.-Interpolar los valores de absorbancia obtenidos en la curva patrón para determinar las unidades
de transaminasas.

11.- Una vez obtenidas las absorbancias de todos los tubos se puede elaborar manualmente la
gráfica en papel milimétrico, tomando siempre en cuenta las equidistancias en la abscisa (eje x) y la
ordenada (eje y) correspondientemente y posteriormente interpolar con las absorbancias de los
problemas
Se puede elaborar la gráfica en Excel obteniendo el coeficiente de determinación (R2) (para estimar
la calidad del modelo, que deberá ser lo más cercano a 1) y la ecuación de la recta (en la cual se
deberá sustituir la absorbancia del problema para determinar la concentración del mismo) e incluirla
en la gráfica

VALORES DE REFERENCIA:

STGO: 4 a 36 Unidades/ ml.

STGP: 4 a 32 Unidades/ ml.

46
RESULTADOS

Utilizando la curva de calibración determinar la concentración de TGO y TGP séricas

Valores obtenidos:
TGO séricas: ____________________U/L.

TGP séricas: ____________________U/L.

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN

CUESTIONARIO

1.- Tipo de reacción que catalizan las aminotransferasas.

2.- Cual es la vida media de las principales aminotransferasas.

3.- En el humano donde se encuentran estas enzimas.

4.- Cuales son las pruebas de la función hepática, basándose en:

Pruebas basadas en sustancias producidas o sintetizadas por el hígado:

Pruebas basadas en sustancias metabolizadas por el hígado:

Pruebas basadas en sustancias liberadas a partir de tejidos dañados:

Pruebas basadas en sustancias depuradas del plasma por el hígado:

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Reitman, S. and Frankel, S. (1957). A Colorimetric Method for the Determination of Serum Glutamic
Oxalacetic and Glutamic Pyruvic Transaminases. OxfordJournals. Vol. 28 p.p. 56-63
Ward, K. M. and Cockayne, S. (1996) Enzimología, Química Clínica. Edit. Interamericana-Mc Graw-
Hill. México. P.p.251-253

47
 PRÁCTICA # 12

DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA DIRECTA Y TOTAL EN SUERO

OBJETIVO

Determinar la concentración de bilirrubina total y directa por la técnica de Van der Berg y
las analizar como una prueba de función hepática.

PREREQUISITOS

1.- Conocer y describir el metabolismo de las bilirrubinas.

INTRODUCCIÓN

La bilirrubina es un compuesto cromógeno de color amarillo o naranja formado en la

excreción del catabolismo de la Hemoglobina. El grupo porfirínico HEM es la fuente directa de
bilirrubina y se detecta en dos formas: bilirrubina libre y conjugada con ácido glucurónico, siendo
esta conjugación a nivel hepático.

El hígado tiene la capacidad para concentrar y eliminar la bilirrubina por mecanismos específicos y
es transportada por el torrente sanguíneo unida electrostáticamente a la albúmina. Se liberan por día
6 gr. de hemoglobina los cuales son catabolizadas en células del sistema retículo endotelial donde
es liberada la bilirrubina, esto se hace por medio de dos reacciones enzimáticas: primero el complejo
de oxigenasas microsómicas y la acción de la biliverdina reductasa.

La determinación clínica de bilirrubina sérica es utilizada como prueba de funcionamiento hepático,

las enfermedades ligadas con altas concentraciones de bilirrubinas se conocen como
hiperbilirrubinemias y son responsables de un síndrome llamado Ictericia que determina múltiples
etiologías.

FUNDAMENTO. Utilizando la técnica de Van der Berg basado en las siguientes reacciones: El ácido
sulfanílico diazoico en un medio alcalino reacciona con la bilirrubina formando un complejo
azobilirrubina el cual tiene una coloración café parda, la sensibilidad es mayor para la bilirrubina
conjugada que la libre. Si se detecta ésta última se aplica un acelerador del color (cafeína, benzoato
de sodio y acetato de sodio).

48
MATERIAL POR EQUIPO
Cuatro tubos de ensaye
Una gradilla
Un vaso de precipitado de 200mL

MATERIAL POR MESA

Ocho pipetas de 1.0mL
Cuatro propipetas de 1.0mL
Una pizeta con agua destilada

REACTIVOS POR MESA

Ácido sulfanílico 29 Mm, Acelerador (cafeína + Benzoato de sodio + Acetato de sodio),
Fehling II (Tartrato de sodio y potasio con Hidróxido de sodio)
Solución Salina 0.89%

POR GRUPO
Caja de celdas de 2 mL para espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO

a) Técnica para Cuantificación de Bilirrubina Total

Distribución de reactivos para la Cuantificación de la Bilirrubina Total

TUBO BLANCO PROBLEMA

Ácido sulfanílico 0.2 ml 0.2 ml

Nitrito de sodio ----- 0.1 ml

Acelerador 1.0 ml 1.0 ml

Suero problema 0.2 ml 0.2 ml

Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente por 30 minutos

Fehling II 1.0 ml 1.0 ml

Mezclar y leer la absorbancia del problema a 580 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con el
blanco.

49
 b) Técnica: para Bilirrubina Directa (Conjugada)

Distribución de los reactivos para la Cuantificación de la Bilirrubina Directa (Conjugada)

TUBO BLANCO PROBLEMA

Ácido sulfanílico 0.2mL 0.2mL

Nitrito de sodio ----- 0.1mL

Solución salina 2.0mL 2.0mL

Suero problema 0.2mL 0.2mL

Mezclar y reposar 5 minutos y leer a 510 nm ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco.

RESULTADOS
Para calcular las concentraciones aplique las siguientes fórmulas para cada analito
trabajado:

Bilirrubina total (mg/dL) = Absorbancia del problema X 10.5

Bilirrubina Directa (mg/dL) = Absorbancia del problema X 14

Bilirrubina indirecta (mg/dL) = Total - Directa

Valores de referencias:

Hasta 1.0 mg/dL. Para bilirrubinas totales

Hasta 0.3 mg/dL. Para bilirrubinas directas

DISCUSIÓN

Con base en los resultados obtenidos y el objetivo planteado analice la importancia de esta
determinación, como parte de un perfil hepático. Discuta la técnica utilizada.

CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA

50
 PRÁCTICA # 13

INDUCCIÓN Y REPRESIÓN HORMONAL EN EL METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

OBJETIVO

Conocer y describir detalladamente cada uno de los eventos del equilibrio homeostático de la
glucosa tomando en cuenta el papel que juegan las hormonas insulina y adrenalina en el control de
este equilibrio

PRERREQUISITOS

1. Explicar la diferencia entre inducción y activación enzimática

2. Explicar la diferencia entre represión e inhibición enzimática

3. Definir alosterismo y regulación enzimática

4. Definir hipoglucemia e hiperglucemia

INTRODUCCIÓN

El apropiado almacenamiento y liberación de energía durante los estados de alimentación

y ayuno son esenciales para la sobrevivencia y son controlados principalmente por la acción
de la insulina. La insulina es una hormona peptídica secretada por las células β en los
islotes pancreáticos de Langerhans en respuesta a niveles elevados de nutrientes en la
sangre. Su principal función es la de mantener la concentración de glucosa en sangre en
un rango normal, favoreciendo la entrada y almacenamiento de este nutriente en músculo
y tejido adiposo y en hígado se favorece su almacenamiento y se inhibe su producción.
Además, regula el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas y promueve la
división y el crecimiento celular a través de sus efectos mitogénicos. La adrenalina tiene un
efecto primario inductor de la movilización de la glucosa a través de las membranas
celulares por su efecto activador de glucogenólisis. Si se aumenta la concentración de esta
hormona se propiciará una respuesta hiperglicemiante y disminuirá notablemente la
concentración de glucógeno hepático en un modelo biológico.

Con este experimento se pretende comprobar la respuesta que diferentes hormonas del
organismo tienen sobre las vías metabólicas que mantienen el control homeostático de la
glucosa extracelular.

51
MATERIAL POR EQUIPO
Gradilla con 10 tubos de ensaye
Mortero y pistilo
MATERIAL POR MESA
Cinco pipetas de 1 mL
Cuatro pipetas de 5mL
Dos pipetas de 10mL
Tres propipetas verdes
Tres propipetas azules
Micropipeta de 10µL y puntas
Vaso para puntas sucias
Pizeta
Balanza de plato y canasta
REACTIVOS POR MESA
Pruebas de carbohidratos (Fehling A y B, Molish, ácido sulfúrico concentrado, lugol)
Glucosa oxidasa
Estándar de glucosa
TCA 10%
Etanol 96%
POR GRUPO
Caja de celdas de 2mL

PROCEDIMIENTO
Se requiere un lote de cuatro ratas adultas, sanas y con peso promedio de 400g divididas
en cuatro grupos:
Grupo I (AZUL). Administración subcutánea de una dosis de 1U/kg de insulina NPH (acción
intermedia) durante cinco días, una hora antes de la clase
Grupo AR (VERDE). Administración subcutánea de una dosis de 1U/kg de insulina rápida media
hora antes del experimento (solo una aplicación)
Grupo A (ROJO). Administración intramuscular de una dosis de 0.01 mg/mL/kg de adrenalina media
hora antes del experimento
Grupo T (NEGRO). Lote testigo (sin tratamiento hormonal)

NOTA: a los cuatro grupos de ratas se les administrará una dieta rica en carbohidratos, grasas y
lípidos en cantidad de 20g de purina por día y solución de glucosa 5.0%

A). Extracción de glucógeno

1. Sacrificar la rata con éter o cloroformo tratando de no alterarla demasiado
2. Diseccionar rápidamente el hígado y colocarlo en un recipiente frío
3. Pesarlo y cortarlo en trozos pequeños
4. Colocar los trozos en un mortero frío y agregar TCA 10% en una proporción de 2mL por gramo de
tejido. Macerar el tejido hasta formar una pasta homogénea. Se puede usar 0.5g de arena lavada
para la maceración
5. Centrifugar durante 5 minutos a 2000 rpm
6. Recuperar el sobrenadante y medir el volumen
7. Añadir dos volúmenes de etanol 95% por volumen de sobrenadante
8. Agitar lentamente hasta que el glucógeno flocule
9. Centrifugar durante 5 minutos a 2000 rpm
10. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5mL de agua destilada
11. Aplicar las pruebas de Molish, Fehling y Lugol a la muestra

52
 B). Cuantificación de glucosa sanguínea
1. Extraer al mayor volumen posible de sangre de la rata con una jeringa desechable de 5mL
2. Colocar la sangre en un tubo y dejarla reposar 5 minutos
3. Centrifugar la sangre por 10 minutos a 2000 rpm
4. Separar el suero y cuantificar la glucosa como lo indica la tabla 1

Tabla 1. Cuantificacion de glucosa sérica

REACTIVOS TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3

BLANCO ESTÁNDAR PROBLEMA

Reactivo de Glucosa 1.0mL 1.0mL 1.0mL

Agua destilada 0.010mL (10 µL) ---- ----

Solución estándar o Suero control ---- 0.010mL (10 µL) ----

Suero problema ---- ----- 0.010mL (10 µL)

5. Mezclar cada tubo y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente

6. Leer absorbancia 500nm de los tubos estándar y problema, ajustando a cero con el tubo blanco
7. Realizar los cálculos como lo indica la siguiente formula:

Absorbancia del problema

Glucosa mg/dL = X Concentración del estándar
Absorbancia del estándar

RESULTADOS

Tratamiento Detección de Concentración Prueba de Prueba de Prueba de

glucógeno de glucosa Fehling Molish Lugol
(mg/dL)
Grupo I
Grupo AR
Grupo A
Grupo T

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA

CUESTIONARIO
1. ¿Qué tejidos sintetizan glucosa? ¿Qué tejidos usan como fuente única la glucosa pero no la
sintetizan?
2. Las hormonas son determinantes en la regulación del metabolismo energético. Obtenga la
siguiente información para cada una de las siguientes hormonas
Hormona Composición Origen Acción Efecto en
química primaria glucemia
Adrenalina
Insulina
Glucagón
Somatotropina

53
3. ¿Qué es una cascada de regulación?
4. Defina glucólisis y su ruta en procesos anaerobios y aerobios
5. ¿Por qué la glucólisis es una ruta anabólica y catabólica?
6. ¿Qué otras hexosas pueden sintetizarse en la glucólisis?
7. ¿Cuáles son los destinos metabólicos del Piruvato?
8. Características físico-químicas del glucógeno y mencione en qué tejidos se almacena
9. Describa el proceso de la glucogenólisis y el efecto del segundo mensajero
10. Defina gluconeogénesis ¿dónde se lleva a cabo y cuáles son sus sustratos?
11. Mencione las enzimas fundamentales en la regulación de la glucólisis y gluconeogénesis
12. Mencione cuatro enfermedades debidas al almacenamiento de glucógeno, deficiencia
enzimática y órgano afectado
13. ¿Por qué el etanol inhibe la gluconeogénesis?
14. Rango de concentración de glucosa en sangre
15. ¿Cuál es la diferencia en la utilización de la glucosa en un estado de inanición y en diabetes?

54