FACULTAD DE MEDICINA
E.A.P. ENFERMERIA
CURSO: BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
GUIA DE PRÁCTICAS
PRACTICA 1: FOTOCOLORIMETRÍA
Elaborado por:
Profesora M. Guadalupe D’Arrigo Huapaya
Tabla de contenido
Práctica 1: Fotocolorimetría------------------------------------------------------------------------------------------ 1
1. Competencia:-------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
2. Introducción---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
3. Marco Teórico------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
3.1. Leyes de Absorción------------------------------------------------------------------------------------3
3.1.1. Ley de Lambert---------------------------------------------------------------------------------- 3
3.1.2. Ley de Beer--------------------------------------------------------------------------------------- 3
3.1.3. Ley de Lambert y Beer-------------------------------------------------------------------------4
3.3. Curva de Calibración-------------------------------------------------------------------------------------- 5
3.2.1. Función de la curva de calibración----------------------------------------------------------6
3.4. Factor de Calibración----------------------------------------------------------------------------------6
[Link] del factor de calibración-----------------------------------------------------------------------7
Datos para practicar---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
Referencias--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8
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Práctica 1: Fotocolorimetría
1. Competencia:
o Comprende los fundamentos y leyes de la fotometría
o Reconoce los usos del fotómetro en la bioquímica clínica
o Usa las fórmulas de la fotometría para hallar la concentración de los metabolitos
2. Introducción
La fotometría o fotocolorímetro es un método de análisis cuantitativo que tiene sus
fundamentos en la medición de la intensidad de luz que una sustancia coloreada puede
trasmitir y al mismo tiempo absorber.
Este método de análisis basa sus fundamentos en las leyes de óptica y de refracción de
luz. Su importancia en el campo de la bioquímica clínica reside en la determinación de la
concentración de los metabolitos.
El objetivo de esta práctica es el aprendizaje de la fotometría y su importancia dentro de
la práctica clínica.
3. Marco Teórico
Tiene sus fundamentos en la mayor o menor absorción de luz dependiendo del número
de moléculas presentes en la solución, Esta absorción de luz es la capacidad química de los
metabolitos que presentan en distintas longitudes de onda.
El método controla la luz que proviene de un foco luminoso de tal manera que incida
específicamente sobre el metabolito que estamos midiendo. (Chávez, 2007)
En esta práctica se estudiará la absorción de la luz visible que esta entre las longitudes
de onda (ƛ) 420 nm a 900 nm.
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Cuando una molécula absorbe un fotón el intervalo del espectro de luz pasa de un
estado fundamental no excitado a un estado excitado, es de esta forma como las moléculas
almacena la energía del fotón de luz.
La suma del estado fundamental (E0) más el estado excitado (E1) da como resultado a la
energía del fotón de luz que ha sido emitido (E total)
E total= E0 + E1
Toda luz absorbida por una sustancia, en función de la longitud de onda, permite obtener
una gráfica denominada espectro de absorción.
Todo espectro de absorción se mide por medio de un instrumento conocido como
Fotocolorímetro. Este consta de una luz blanca que tiene un intervalo de longitudes de
onda entre los 400 nm a 900 nm y de un monocromador o prisma que actúa como filtro
óptico que transmite un haz de luz en una longitud de onda fija. Este haz de luz penetra en
la cubeta de análisis que contiene la muestra a analizar. Un detector sensible mide la
intensidad (I1) del haz de luz de salida. (UPO, 2011)
(Spectrofotómetro, 2016)
3.1. Leyes de Absorción
Cuando la luz atraviesa una muestra sólo una fracción es transmitida. A esta porción
se le llama TRANSMITANCIA O TRAMITANCIA (T), y se calcula con la siguiente
fórmula
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T= I1/I0
I= Intensidad de luz trasmitida por la muestra
I0= Intensidad de luz incidente
La tramitancia toma valores de 0-100%
%T=(I1/I0)*100
La relación de T se puede expresar como la luz absorbida, en este caso se habla de
la ABSORBANCIA (A) de una muestra. La absorbancia no tiene unidades y varía desde
0 al infinito y se define como
A=log 1/T
3.1.1. Ley de Lambert
Dice: “La fracción de luz absorbida depende de cada capa que conforma el medio
que contiene la muestra”. Se expresa matemáticamente como sigue
A= K*b
Donde:
b= longitud de la cubeta por donde pasa el haz de luz.
K= es una constante del medio que fue descifrada por Beer
3.1.2. Ley de Beer
Dice: “La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de la
sustancia coloreada”. Matemáticamente Beer descifro la constante K que expuso
Lambert
K=a*c
Donde:
a= Coeficiente de absorción (depende la longitud de onda de la luz incidente y de la
identidad de la muestra analizada)
C= Concentración de la muestra
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3.1.3. Ley de Lambert y Beer
La ley explica la relación directa entre la absorbancia de una sustancia y la
concentración de la sustancia, así como también la relación con la longitud del espacio
que recorre el haz de luz, considerando el coeficiente de absorción.
Si se conoce el coeficiente de absorción, el espacio de recorrido y la absorbancia, se
puede obtener matemáticamente la concentración de la muestra con la siguiente fórmula
A=a*b*C
Donde:
A= Absorbancia
a= coeficiente de absorción
b= espacio de recorrido del haz de luz
C=Concentración de la muestra (Alvarez, 2008)
3.2. Espectro de Absorción
Cada sustancia tiene su espectro de absorción, que es una curva que muestra la cantidad
de luz absorbida por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético. Es
decir que cada sustancia tiene un espectro de absorción y que es diferente a de otra
sustancia. (Odontología, 2010)
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3.3. Curva de Calibración
El método de la curva de calibración es uno de los más utilizados para determinar la
concentración de una muestra problema. Esta curva es una gráfica que relaciona la
concentración de al menos cinco soluciones de estándares o patrones de concentración
conocida de una misma sustancia con la absorbancia de cada una de estos estándares
leídas en la longitud de onda de máxima absorbancia. (Odontología, 2010)
(Montalvan & Veitia, 2014)
Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática f (x), de la recta que
relaciona la absorbancia y la concentración de un metabolito o sustancia. La fórmula es la
siguiente:
A= mC+n
Donde:
A: absorbancia
m; Pendiente de la recta, es decir a*b (de la ley de Lambert y Beer)
n: Puntos intercepto de la recta.
3.2.1. Función de la curva de calibración
Luego de tener la curva de calibración se mide la absorbancia de la solución
problema y se interpola el valor de esta absorbancia en la gráfica PARA OBTENER EL
VALOR DE LA CONCENTRACIÓN DEL METABOLITO. La concentración de la
muestra problema debe estar comprendida en el rango de concentración de la curva de
calibración. (Odontología, 2010)
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3.4. Factor de Calibración
El factor de calibración (Fc) es absolutamente necesario para determinar la
concentración desconocida del metabolito de una muestra y es una técnica fotométrica de la
Ley de Lambert-Beer. Matemáticamente se obtiene
Fc= CE/ AE
Donde:
Fc: Factor de calibración
CE: Concentración de estándar (que es obtenido como el promedio de las concentraciones
de todos los estándares de la curva de calibración o es la mayor concentración de los
estándares de la curva de calibración)
AE: Absorbancia del estándar
3.4.1. Uso del factor de calibración
Para determinar el valor de la concentración de un metabolito específico de la
muestra problema se utiliza una variación de la ley de Lambert- Beer y que involucra al
Factor de calibración. Matemáticamente se una la siguiente fórmula:
CM=Fc*AM
Donde
CM: Concentración de la muestra problema
Fc: Factor de calibración
AM: Absorbancia de la muestra (UA, 2013)
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Datos para practicar
1. Grafique la curva de calibración con los siguientes datos
Numero de Concentración Absorbancia
tubo estándar del estándar del estándar
(mg/dl)
1 0.002 0.440
2 0.0035 0.490
3 0.004 0.637
4 0.005 0.830
5 0.0065 0.940
2. Usando la curva de calibración anterior, halle la concentración de una muestra
problema, si su Absorbancia es 0.567
3. Si tiene lo siguientes datos:
Am= 0.325
Ae= 0.367
Cm= 150 mg/dl
Halle:
a. El factor de calibración (Fc)
b. La concentración de la muestra usando el factor de calibración
Preguntas para repasar
1. ¿Qué es la fotocolorimetría?
2. Defina absorbancia y transmitancia.
3. ¿Cuáles son las partes principales de un fotocolorímetro?
4. Explique la ley de Lambert-Beer.
5. ¿Cómo se construye una curva de calibración?
6. ¿Qué es un espectro de absorción?
7. ¿Cuál es la importancia del factor de calibración?
8. ¿Qué son los estándares en la curva de calibración?
Referencias
Alvarez, C. (2008). Fotocolorimetría. Obtenido de [Link]:
[Link]
8
Chávez, J. (2007). Práctica 2: Fotocolorimetría. Obtenido de SCRIBD:
[Link]
Montalvan, A., & Veitia, E. (Enero de 2014). Validación de procedimientos espectrofotométricos
para el análisis terrestres y aguas residuales. Obtenido de Researchgate:
[Link]
Odontología, F. (03 de 09 de 2010). Fundamentos de espectrofotometría. Obtenido de U-cursos:
[Link]
Spectrofotometro. (2016). Espectrofotómetro. Obtenido de in Espectrofotómetro:
[Link]
UA, U. d. (8 de Setiembre de 2013). Material de autoaprendizaje guiado y semi abierto para la
docencia de Bioquímica. Obtenido de SlideShare:
[Link]
UPO. (2011). Práctica 4: Espectrofotometría. Obtenido de Fundamentos de Química- Práctica 4:
[Link]
