Cátedra A -

Prof. Quinteros Jessica

 Nutriente :cualquier sustancia química consumida normalmente como componente
de un alimento, que:
 proporciona energía; o
 es necesaria para el crecimiento, el desarrollo y el mantenimiento de la vida; o
 cuya carencia hará que se produzcan cambios químicos o fisiológicos
característicos.
CODEX - DIRECTRICES SOBRE ETIQUETADO NUTRICIONAL
 Carbohidratos o hidratos de carbono o glúcidos: Son todos los mono, di y
polisacáridos, incluidos los polialcoholes presentes en el alimento, que son digeridos,
absorbidos y metabolizados por el ser humano.
 Azúcares: Son todos los monosacáridos y disacáridos presentes en un alimento, que
son digeridos, absorbidos y metabolizados por el ser humano. No se incluyen los
polialcoholes.
 Fibra alimentaria: Es cualquier material comestible que no sea hidrolizado por las
enzimas endógenas del tracto digestivo humano.
 .Proteínas: Son polímeros de aminoácidos o compuestos que contienen polímeros
de aminoácidos
 Grasas o lípidos: Son sustancias de origen vegetal o animal, insolubles
en agua, formadas de triglicéridos y pequeñas cantidades de no
glicéridos, principalmente fosfolípidos.
 Grasas saturadas: Son los triglicéridos que contienen ácidos grasos sin
dobles enlaces, expresados como ácidos grasos libres.
 Grasas monoinsaturadas: Son los triglicéridos que contienen ácidos
grasos con un doble enlace con configuración cis, expresados como
ácidos grasos libres.
 Grasas poliinsaturadas: Son los triglicéridos que contienen ácidos
grasos con doble enlaces cis-cis separados por un grupo metileno,
expresados como ácidos grasos libres.
 Grasas trans: Son los triglicéridos que contienen ácidos grasos
insaturados con uno o más dobles enlaces en configuración trans,
expresados como ácidos grasos libres.
Macronutrientes Micronutrientes

• Hidratos de • Vitaminas
carbono • Minerales
• Proteínas
• Grasas
• Fibra
Es obligatorio de acuerdo con el CAA declarar la siguiente información:
 Contenido cuantitativo del valor energético y de los siguientes
nutrientes:
• Carbohidratos
• Proteínas
• Grasas totales
• Grasas saturadas
• Grasas trans
• Fibra alimentaria
• Sodio

• La cantidad de cualquier otro nutriente que se considere importante

para mantener un buen estado nutricional.
• La cantidad de cualquier otro nutriente acerca del que se incluya
declaración de propiedades nutricionales u otra declaración que
haga referencia a nutrientes.
• Cuando se incluya una declaración de propiedades nutricionales
(información nutricional complementaria) con respecto al tipo y/o la
cantidad de carbohidratos, se deberá indicar la cantidad de
azúcares y el(los) carbohidrato(s) del(de los) que se hace una
declaración de propiedades. Se podrá indicar también la cantidad
de almidón y/u otro(s) carbohidrato(s)
• Cuando se incluya una declaración de propiedades nutricionales
(información nutricional complementaria) con respecto al tipo y/o la
cantidad de grasas y/o ácidos grasos y/o colesterol, se deberán
indicar las cantidades de grasas saturadas, trans, monoinsaturadas,
poliinsaturadas y colesterol,

 Optativamente se podrán declarar:

• Las vitaminas y los minerales que figuran en el Anexo A, siempre y
cuando se encuentren presentes en cantidad igual o mayor que 5%
de la Ingesta Diaria Recomendada (IDR) por porción indicada en el
rótulo.
• Otros nutrientes.
 Cálculo del Valor Energético y Nutrientes.
La cantidad de energía a declarar se deberá calcular utilizando
los siguientes factores de conversión:

• Carbohidratos (excepto polialcoholes) 4 kcal/g - 17kJ/g

• Proteínas 4 kcal/g - 17kJ/g
• Grasas 9 kcal/g - 37kJ/g

Otros:
• Alcohol (Etanol) 7 kcal/g - 29kJ/g
• Ácidos orgánicos 3 kcal/g - 13kJ/g
• Polialcoholes 2,4 kcal/g - 10kJ/g
• Polidextrosas 1 kcal/g - 4kJ/g
 La cantidad de proteínas se deberá calcular utilizando la fórmula
siguiente:
Proteína = contenido total de nitrógeno (Kjeldahl) x factor

Se utilizarán los siguientes factores:

5,75 proteínas vegetales

6,38 proteínas lácteas
6,25 proteínas cárnicas o mezclas de proteínas
6,25 proteínas de soja y de maíz

 Se calculará como la diferencia entre 100 y la suma del

contenido de proteínas, grasas, fibra alimentaria,
humedad y cenizas.
ANÁLISIS PROXIMAL O DE WEENDE
ANÁLISIS PROXIMAL O DE WEENDE - ¿Qué se analiza?
 Las proteínas son macromoléculas
presentes en todos los organismos vivos y
constituyen un nutriente fundamental para
el ser humano.
 Son macromoléculas formadas por la unión
de varios aminoácidos que se adquieren a
través de la alimentación. Los aminoácidos
son moléculas orgánicas que en un
extremo de su estructura tienen un grupo
funcional amino (-NH2), mientras que en el
otro tienen un grupo funcional carboxilo (-
COOH).
 Las proteínas son esenciales para cumplir
diversas funciones del cuerpo, como la
formación o reparación de los músculos, los
huesos y otros tejidos.
 Su origen puede ser animal (carnes, aves,
pescado, huevo, lácteos) o vegetal
(legumbres, cereales completos, soya,
frutos secos).
L.G. Wade, Jr. - Quimica Organica. 2-Pearson (2012)
¿De qué depende la calidad proteica de un
alimento?

El contenido en proteínas

La calidad de la proteína

La biodisponibilidad de las proteínas

No extractivos: no se requiere una separación previa de la proteína del alimento
Determinación de N.

Extractivos: requieren de una solubilización previa de la proteína del alimento.

Pueden requerir diferentes grados de purificación
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
Fundamento: determinación del nitrógeno orgánico total. Es un método
INDIRECTO.
La convención general es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en
forma proteica, aún cuando la realidad es que, según la naturaleza del
producto, una fracción considerable del nitrógeno procede de otros
compuestos nitrogenados (bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina,
urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total”
a la obtenida por este método.

Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la
determinación del nitrógeno en una amplia gama de matrices (alimentos y
bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el cálculo del contenido en
proteína.
También se utiliza para la determinación de nitrógeno en aguas residuales y
suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA,
ISO, Farmacopeas.
IMPORTANTE CONSIDERACIÓN SOBRE LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
MEDIANTE MÉTODO DE KJELDAHL

El método KJELDAHL es considerado un método oficial de determinación

de proteína cruda, debido a su gran aplicación y menores costos
comparado con otros métodos, sin embargo la estimación del contenido
de proteínas a partir del contenido de nitrógeno total no siempre es
correcta, ya que determina nitrógeno de otros compuestos nitrogenados.
Determina nitrógeno de: ácidos nucleicos, úrea, aminoácidos libres,
compuestos amoniacales óxidos de trimetilamida, creatina, amino
azúcares, alcaloides, ácido úrico.
En general el contenido de compuestos nitrogenados NO proteicos es
pequeño comparado al de proteínas en la mayoría de los alimentos.

Método NO idóneo para alimentos ricos en nitrógeno no amínico y no

proteico, por ejemplo, los peces cartilaginosos, muchos moluscos
y crustáceos y sobre todo la leche materna humana, que contiene una
concentración sustancial de urea.

El método de Kjeldhal NO determina el nitrógeno nítrico, el cianhídrico, el

de la hidracina, el de grupos azo y el nitrógeno de un núcleo cíclico.
Objetivo: romper todos los enlaces de nitrógeno de la muestra y convertir todo el
nitrógeno unido orgánicamente en iones amonio (NH4+).
 En este proceso la materia orgánica se carboniza dando lugar a la formación de una
espuma negra.
 El cambio de color de la espuma de oscura a clara indica que la reacción química ha
terminado.

Procedimiento:
1- La muestra se mezcla con ácido sulfúrico a temperaturas entre 350 y 380 ºC.
Nota: Cuánto más alta sea la temperatura, más rápido será el proceso de digestión. La
digestión también se puede acelerar con la adición de sales y catalizadores.
Se añade sulfato de potasio para aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico y se
añaden catalizadores para aumentar la velocidad y la eficiencia del procedimiento de
digestión. También se pueden añadir agentes oxidantes para mejorar aún más la
velocidad.

 Una vez la digestión ha

finalizado, se deja enfriar
la muestra a temperatura
ambiente, se diluye con
agua y se trasvasa a la
unidad de destilación.
1- Durante el proceso de destilación los iones amonio (NH4+) se convierten en
amoniaco (NH3) mediante la adición de un álcali (NaOH). El amoniaco (NH3) es
arrastrado al vaso receptor por medio de una corriente de vapor de agua.

2-El vaso receptor para el destilado se llena con una solución absorbente (por lo
general, ácido bórico en solución acuosa al 2-4%) para capturar el gas amoniaco
disuelto. El amoniaco es capturado cuantitativamente por la solución de ácido
bórico formando iones amonio solvatados.

 También pueden utilizarse otros ácidos, dosificados con precisión, como el ácido
sulfúrico o clorhídrico para capturar el amoniaco en forma de iones amonio
solvatados.
La concentración de los iones amonio capturados puede determinarse por medio
de dos tipos de valoración:
• VALORACIÓN DIRECTA: Cuando se utiliza el ácido bórico como solución
absorbente, posteriormente se lleva a cabo una valoración ácido-base utilizando
una solución estandarizada de ácido sulfúrico o clorhídrico y una mezcla de
indicadores.
El rango de concentración de la solución utilizada varía entre 0,01N a 0,5N
dependiendo de la cantidad de iones amonio presentes. El punto final de la
valoración también se puede determinar potenciométricamente con un electrodo
de pH.

• VALORACIÓN INDIRECTA O POR RETROCESO: Cuando se utiliza una solución

valorada de ácido sulfúrico como solución absorbente, el ácido sulfúrico residual
(es decir, el exceso que no reacciona con NH3) se valora con una solución
estandarizada de hidróxido sódico y la cantidad de amoniaco se calcula por
diferencia.
Método de KJELDAHL - EQUIPOS
 Los cálculos para el % de nitrógeno o de proteína deben tener en cuenta qué tipo de
solución receptora se utilizó y qué factores de dilución se usaron durante el proceso de
destilación.
 En las fórmulas siguientes, “N” representa la normalidad. “ml blanco” se refiere a los
mililitros de álcali consumidos en la valoración por retroceso de un blanco, si la solución
receptora es ácido clorhídrico o ácido sulfúrico estandarizados, o se refiere a mililitros de
solución valorada de ácido para titular un blanco si la solución receptora es ácido bórico.

• Cuando se utiliza ácido bórico como solución receptora, la fórmula es:

• Cuando se utiliza solución valorada de ácido como solución receptora, la fórmula es:
 Si se desea determinar el
% de proteína en lugar de
nitrógeno, el % de N
calculado se multiplica
por un factor que
depende de la matriz de
la muestra. Se han
desarrollado muchos
factores de proteínas
para usar con varios tipos
de muestras.
 A continuación se
encuentra el factor a
utilizar según el tipo de
alimento:

El contenido medio de nitrógeno de

las proteínas es aproximadamente
16%, lo que lleva al uso del factor
“genérico”=6,25

16 g nitrógeno ----------100 g proteína

1 g nitrógeno ----------- 6,25 g proteína
 Otra forma es por estequiometria, determinando los Equivalentes de N.
Para ello:
Por reacción los equivalentes de N son iguales a los equivalentes gastados de la solución
que se utilizó en la titulación. Conociendo la concentración “normalidad” y el volumen
gastado podemos calcular los mismos.

Equivalentes de N = Equivalentes de ácido= volumen (L) x N (normalidad eq./L del ácido)

g N = Equivalentes de N x 14 g/ eq.

g N/ 100g = (g N / g de muestra) x 100

g proteínas/ 100g = g N/ 100g x factor de conversión

Video demostrativo “Determinación de proteínas en leche por el

método Kjeldahl”. https://www.youtube.com/watch?v=3n2RAKK1xmQ
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
 El problema en el pasado era que no era fácil reproducir las condiciones
requeridas por el método Dumas y, por esta razón, la técnica de Kjeldahl se
aprovechó y fue considerada como el método clásico para la determinación
de nitrógeno/proteínas.
Hoy, gracias a los avances tecnológicos, la determinación de nitrógeno
mediante el método Dumas se está extendiendo cada vez más.

 Los resultados obtenidos con la determinación de nitrógeno de Dumas suelen

ser algo superiores a los obtenidos con Kjeldahl, ya que también se detectan
compuestos heterocíclicos y compuestos nitrogenados (por ejemplo, nitritos y
nitratos).

 Además del contenido de nitrógeno orgánico, el método de combustión

también puede utilizarse para analizar el contenido total de nitrógeno, incluidos
los componentes inorgánicos.

 El límite de detección es menor para Dumas que para Kjeldahl (0,001 mg N

absoluto frente a ≥ 0,1 mg N absoluto).
1- la muestra se mezcla con cobre y
luego se calienta a altas
temperaturas con la adición de
oxígeno (O2). La mezcla de gases
obtenida se oxida en los
subproductos agua (H2O), dióxido
de carbono, nitrógeno (N2) y óxidos
de nitrógeno (NOx) añadiendo de
nuevo cobre.
2- Por medio de un hilo de cobre, los
óxidos de nitrógeno se reducen a
nitrógeno elemental (N2), que a su
vez se hace pasar por una solución
de hidróxido de potasio y se recoge
en una probeta graduada.
3-4 Los subproductos dióxido de
carbono y agua se separan.
5-el contenido de nitrógeno puede
leerse cuantitativamente y se puede
calcular el contenido de nitrógeno
de la muestra por TCD
 La muestra homogeneizada se combustiona con la adición de
oxígeno puro (O2) en un horno de alta temperatura a unos 1000 °C
(paso 1). La mezcla gaseosa obtenida, compuesta por agua, dióxido
de carbono, óxidos de nitrógeno y nitrógeno, se hace pasar por el
sistema mediante un gas portador, normalmente helio.
 Durante el proceso, los óxidos de nitrógeno se reducen a nitrógeno
elemental en una superficie de cobre (paso 2) y
 el agua y el dióxido de carbono se separan mediante trampas
específicas (pasos 3 y 4).
 El gas portador fluye por todo el sistema de principio a fin durante el
análisis y se mide con un detector de conductividad térmica (TCD)
(paso 5). No obstante, al final del análisis, el TCD mide una mezcla de
gas portador y N2. Esta diferencia en la composición del gas crea una
divergencia de voltaje que puede ser medida por el TCD, y que luego
se utiliza para calcular el contenido de nitrógeno de la muestra.
 El método Dumas, no requiere el uso de sustancias químicas nocivas o tóxicas ni de
catalizadores. No se generan humos nocivos durante el análisis. Esto es beneficioso
para el usuario y el entorno del laboratorio, así como para el medio ambiente. Es
amigable con el medio ambiente
 Los sistemas analíticos que funcionan según el método Dumas –a diferencia de los
aparatos Kjeldahl– no requieren espacio en la campana de extracción de gases. Y
como el espacio en las vitrinas de gases de los laboratorios suele ser limitado y caro,
ésta es otra ventaja.
 El método Dumas automatizado tiene la enorme ventaja de ser rápido, el tiempo de
análisis es muchas veces menor que con el Kjeldahl.
 Los sistemas de análisis que utilizan el método Dumas son muy adecuados para los
laboratorios que analizan regularmente una matriz de muestra específica y tienen un
alto rendimiento de muestras (mucha cantidad de muestras). Es óptimo si el sistema
de análisis está en funcionamiento continuo, ya que el encendido y apagado
consume mucho tiempo y energía debido a las condiciones extremas de
temperatura.
A pesar de las ventajas mencionadas del método Dumas, el método Kjeldahl
sigue siendo el método de referencia dominante.

 Es la solución más práctica, sobre todo en los laboratorios con menor

rendimiento de muestras y con matrices de muestras cambiantes que se
analizan según una amplia gama de aplicaciones.

 Además, la flexibilidad en el pesaje en Kjeldahl es una ventaja. El análisis

Kjeldahl puede realizarse con una amplia variedad de material de vidrio de
laboratorio y con cantidades de muestra de hasta unos 10 gramos. En
cambio, con el método Dumas se puede examinar un máximo de 1 gramo.
Este aspecto es especialmente importante para muestras poco
homogéneas como el suelo, en las que el tamaño de la muestra es
fundamental para obtener una prueba representativa

 Se pueden analizar muestras no homogéneas, como la tierra. Dumas

requiere que la muestra esté bien homogenizada
El análisis de nitrógeno por método de Dumas es algo especialmente
interesante para la industria alimentaria y de piensos, ya que los requisitos
de composición de los alimentos y los piensos crecen constantemente y el
análisis detallado es más importante que nunca para el control de calidad
y la etiqueta de información nutricional.

VIDEO – EXPLICATIVO CON APLICACIONES.

Análisis de proteínas por el método Dumas. Una solución simple, rápida y precisa
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
 Es la técnica más simple de determinación de proteínas solubles. Es un
método directo de determinación.
 Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1 Cu2+ se acompleja
con 4 NH.
 El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se
puede determinar espectroscópicamente a 540nm.
 La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la
cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo
en suero).

 Una condición
indispensable
para la positividad de la
reacción es que el
compuesto analizado
posea al menos
dos enlaces peptídicos
en su estructura.
 El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, es decir, que, a mayor
concentración de proteínas, más coloreada se torna la solución y, por lo tanto, la
absorbancia será mayor. Esto hace posible la cuantificación de las proteínas
presentes en una muestra desconocida, relacionando la absorbancia de la
muestra con la de estándares de proteínas (soluciones con concentraciones
conocidas, por ejemplo con solución de albumina de huevo o BSA Albúmina de
suero bobino ) graficados en una curva patrón de proteína.

 Este método detecta proteínas en un

rango de 0,5 a 10 mg/mL, lo que es
suficiente para medir los valores de
proteínas en algunos fluidos biológicos
como el suero y el plasma, ambos con
concentraciones mayores de 6 g%.

 Existen pocas interferencias en esta

determinación, por ejemplo el ión
amonio altera el desarrollo del color,
algunos pigmentos absorben a la
misma longitud de onda, algunos
lípidos y carbohidratos son capaces de
formar complejos con el ión Cu2+ NOTA: El reactivo incluye Cu2SO4, NaOH y
(coordinado) tartrato de sodio y potasio, que se utiliza para
estabilizar el ion cúprico en la solución alcalina.
Usos y aplicaciones
• Cereales
• Carne
• Proteínas de soja
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
 Método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la
muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas.
 La intensidad de la coloración obtenida depende del número y de la
naturaleza de los residuos que constituyen la proteína presente en la
muestra ya que a iguales concentraciones, dos proteínas diferentes no
desarrollan la misma intensidad de color.

 Combina la REACCIÓN DEL

BIURET con la reducción
del reactivo de F O L I N -
C I O C A L T E U por los grupos
aromáticos de residuos de
tirosina, triptófano, cistina
cisteína e histidina.
1. Los iones C u 2 + , en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu 2+ -proteína tienen u n
color azul claro. Se provocan el desdoblamiento de l a estructura tridimensional de l a
proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina.
2. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los
grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador .
3. El color azulado desarrollado a 750 nm puede detectarse espectrofotométricamente
incluso a concentraciones de proteína muy bajas, mientras que la absorción visible a
500 nm se puede utilizar a altas concentraciones de proteínas para su determinación

El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfotungstico y/o el

ácido fosfomolibdico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da
lugar a un complejo de color azul intenso.
 10-20 veces más sensible que los métodos de absorbancia UV,
 hasta 100 veces más sensible que el método biuret.

 No todas las proteínas reaccionan igual.

 Sensible a altas concentraciones de sacarosa, interferencia por
presencia e lípidos.
 Interferencias: El reactivo de Folin-Ciocalteau reacciona con otros
compuestos tales como: aminoácidos, tioles, sacarosa y otros sacáridos,
ácidos grasos, aminas, agentes quelantes (EDTA).
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
 Reconoce los aa arginina,
fenilalanina, triptófano y
prolina.
 Origina color azul intenso
A=595nm
 Este método es sensible (1-15
µg), simple, rápido, barato y
pocas sustancias interfieren en
su determinación. Entre las
sustancias que interfieren están
los detergentes y las
soluciones básicas.
 El método de Bradford es una técnica colorimétrica utilizada para la
cuantificación de proteínas.
 El reactivo utilizado para este proceso habitualmente se lo denomina como
"Reactivo de Bradford" que se prepara utilizando como colorante el
Coomassie Brilliant Blue G-250. El método se basa en el cambio diferencial
del color de este colorante en respuesta a distintas concentraciones de
proteínas.
 El color azul desarrollado es proporcional al contenido de proteína y puede
medirse espectrofotométricamente a 595 nm, la longitud de onda donde la
diferencia de absorbancia entre las dos formas coloreadas del tinte es
mayor.
 Las disoluciones acuosas del colorante en presencia de ac. fosfórico tienen
un color pardo y, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una
proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente.
 Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica
entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente
sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y
líquidos orgánicos como el metanol.
 Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros
métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280
nm.
 El método BCA es un método de detección y cuantificación colorimétrica de
proteínas totales.
 Este método combina la reducción del Cu+2 a Cu+1 en medio alcalino
(reacción de Biuret) con la detección selectiva del catión Cu+1 utilizando el
acido bicinconínico. El producto de la reacción tiene un color púrpura
formado por el complejo de BCA con un ion Cu+1. El complejo hidrosoluble
absorbe a 562 nm de manera lineal con el incremento de proteína en un
rango de 20-2000 μg/ml.

 La concentración de proteínas se determina a partir de una curva de

calibración construida con una proteína de referencia de concentración
conocida (ej. albúmina de suero bovino). A partir de esta curva se
determina la concentración de la muestra de proteína incógnita.
 A diferencia de otros métodos, BCA presenta linealidad en un amplio
rango de concentraciones (0- 1,5 mg/ml) y es compatible con
detergentes y otros compuestos que comúnmente interfieren con
otros sistemas de cuantificación.
 Límite de detección menor que Bradford y Lowry.

 Linealidad en un amplio rango de concentraciones: 20 -2000 µg/ml.

 Menor susceptibilidad a detergentes

 Estabilidad del color del complejo.

Se trata de una curva de referencia construida con una solución
proteica testigo, de concentración de proteínas conocida.
Generalmente se utiliza albúmina sérica bovina.
Dicha curva se construye a fin de poder determinar la cantidad
de proteínas presente en una muestra incógnita.

Diluciones seriadas de
albúmina sérica bovina
 En muchas
determinaciones se cumple
una relación proporcional
entre la magnitud o
intensidad de color que da
una reacción y la cantidad
del reactivo que la
provoca. Por ejemplo: si la
presencia de 10 µg de
proteínas en una solución
genera la aparición de un
color azul pálido cuando es
agregada a una mezcla
reactiva, la presencia de
20 µg de proteína dará
lugar a que la solución se
torne azul más oscuro y así
sucesivamente.
1- Se mide la absorbancia de las soluciones patrones, de menor a mayor
concentración, en un espectrofotómetro a 595nm.
2- Basándose en la LEY DE LAMBERT – BEER se construye la gráfica
CONCENTRACIÓN en el eje x vs ABSORCIÓN en el eje y, a fin de obtener
la curva de calibración de la proteína estándar.
3- Con la curva se puede extrapolar la concentración de proteínas
totales en una muestra.

CURVA DE CALIBRACIÓN
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
Fundamento: las proteínas absorben fuertemente a 280 nm (máximo), el que es
variable según la composición de aminoácidos que tengan. La absorción de
debe rincipalmente por la presencia de los aminoácidos (aa) “aromáticos” Los
anillos aromáticos de varios aminoácidos (principalmente triptófano y tirosina y
en menor medida a fenialanina) de las proteínas en solución absorben luz
ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm.

Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se

daña o destruye durante la determinación.
Procedimiento
1- Solubilización de las proteínas en buffer
2- Lectura de absorbancia a 280 nm de la muestra y blanco.
3- Cálculo de la concentración según la ecuación que representa la Ley
de Lambert y Beer
A= e.b.c
donde A es la absorbancia medida, b es el paso óptico, e es el
Coeficiente de absortividad molar y c es la concentración que se quiere
determinar.

Aplicaciones: determinación de proteínas en leche y productos cárnicos.

Ventajas:
 No destructivo; las muestras se pueden utilizar para otros análisis después de
la determinación de proteínas.
 No requiere reactivos.
 Rápido y sensible
 Sin interferencia del sulfato de amonio y otras sales tampón.

Desventajas
 Diferente absorción de los aminoácidos
 La solución debe ser transparente e incolora. Sino tener en cuenta la
absorción del solvente de la muestra.
 Interfieren compuestos con purinasy pirimidinas. Los ácidos nucleicos
también absorben a 280 nm.
 Es necesario hacer curva de calibración
 KJELDAHL

NO
EXTRACTIVOS
DUMAS

BIURET

MÉTODOS
LOWRY

QUÍMICOS

BRADFORD

BCA
EXTRACTIVOS

ABSORCIÓN
280nm

FÍSICOS TURBIDIMETRÍA

FLUORIMETRÍA
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz
se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.
La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría.
En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de
proteína concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de
aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares
proteicos conocidos.
La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una
suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector
en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para
soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz
transmitida) ej. determinación de proteínas totales en suero u orina
(haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
Se usa cuando la muestra contiene grandes concentraciones de partículas
dispersantes, sin especial interés en el tamaño de la misma.

Poco utilizado en alimentos.

La aplicación de esta técnica en el estudio de las proteínas se basa en que
hay tres residuos de aminoácidos, Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr) y Triptófano
(Trp), que contribuyen a la fluorescencia UV de las proteínas.
Sin embargo, Trp domina la emisión en las proteínas, ya que absorbe a la
longitud de onda más larga.
 La fluorescencia implica una fuente de luz
externa para excitar la muestra a una longitud
de onda en particular. Cuando se excita a la
longitud de onda adecuada, la molécula pasa
de un estado básico a otro excitado. A medida
que la molécula vuelve al estado fundamental,
se libera energía en forma de calor (pérdida de
energía) y luz a una longitud de onda diferente
de menor energía.

Figura 3.1. Esquema ilustrativo de los componentes básicos de un espectrofluorómetro.

• Espectrofotometría IR cercano (NIR) 780–2500 nm
• NIT (conocida como transmitancia difusa), que se transmite en la región
de 800 a 1100 nm y, a menudo, se aplica a muestras como queso, carne
o cereales integrales.
• NIR-refletancia difusa a 1100-250 nm se usa para leche en polvo o harina.
Rápido, requiere poca cantidad de muestra.

Métodos para proteínas específicas

• Cromatografía HPLC
• Electroforesis
• Inmunológicos:
• Aglutinación
• Precipitación
• Antígeno-Anticuerpo
• Inmunoabsorción
 La ureasa es una proteína y a su vez una enzima que cataliza la
hidrólisis de urea a dióxido de carbono y amoníaco. La reacción
ocurre de la siguiente manera:

Específicamente, la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea para producir

amoniaco y carbamato, el carbamato producido es
subsecuentemente degradado por medio de una hidrólisis espontánea
para producir otra molécula de amoniaco y ácido carbónico.

 La actividad de la ureasa tiende a incrementar el pH del medio en el

que se encuentra debido a la producción de amoniaco.
 La evaluación de la actividad ureásica residual en algunos
productos alimenticios (como la soja) es habitualmente empleada
como indicador de la eficacia del tratamiento de inhibición térmica
que es sometido el producto, el cual es utilizado para inactivar
antinutrientes o factores antinutricionales, de naturaleza proteica y
diferente termoestabilidad (tales como inhibidores de tripsina y de la
quimotripsina, lectinas, taninos, fitatos y saponinas); esto ya que la
Ureasa es igualmente inactivada en este proceso, lo que ocasiona
que también disminuya notoriamente la actividad ureásica que está
presente en la soja después del tratamiento térmico.
 Resultados de análisis del producto final:
- Altos valores de actividad ureásica indicarían que el producto ha
sufrido un tratamiento térmico suave.
- Bajos valores, sugieren que pudo haber habido sobrecalentamiento.
Poder controlar la intensidad del tratamiento térmico aplicado es
importante ya que un calentamiento inadecuado, tanto por exceso
como por defecto, conduciría por ejemplo a la obtención de harinas
de soja con un menor valor nutritivo.
En el caso de sobrecalentamiento, habría pérdida de aminoácidos
esenciales (lisina y arginina1);
En el caso de un calentamiento insuficiente, la eliminación de factores
antinutricionales biológicamente activos no sería completa.
Test de la ureasa: Mide el grado de calentamiento recibido ya que la
ureasa contenida en la soja es progresivamente destruída por el calor.
¿Qué es la digestibilidad? es una forma de medir el aprovechamiento de una
alimento, es decir, la facilidad con que es convertido en el aparato digestivo en
sustancias útiles para la nutrición.
Comprende dos procesos, la digestión que corresponde a la hidrólisis de las
moléculas complejas de los alimentos, y la absorción de pequeñas moléculas
(aminoácidos, ácidos grasos) en el intestino.

¿Para que se mide?: para evaluar la calidad nutricional de las proteínas.

¿Cómo se mide? Hay dos vías

1. “in vivo” se hace son los seres vivos bajo estudio. Es muy complejo y costoso.
Resulta difícil evaluar el balance entre los nutrientes que ingresan vía dieta y
los que salen en las heces.
2. “in vitro” se somete a las proteínas a una digestión artificial mediante el
agregado de enzimas
La digestibilidad, por lo tanto, constituye una excelente medida de
calidad y ello ha suscitado la idea medirla de diferentes formas.
Existen varios métodos de simular la digestibilidad de proteínas in vitro
( sometiendo las proteínas a una digestión artificial por pepsina que es
una enzima que se encuentra en el estómago de los animales
superiores.

EJEMPLO 1:
1-Las proteínas de la muestra son digeridas por la pepsina diluída en HCl (pH=2).
2-Sigue la digestión con tripsina y quimiotripsina en un buffer neutro.
En 1 y 2 se simulan las condiciones fisiológicas del estómago e intestino.
3- Las proteínas no digeridas se remueven por precipitación con ácido
tricloroacético.
Los grupos amino de los aminoácidos disponibles luego de la digestión son
cuantificados por reacción con ninhidrina para formar el producto colorido llamado
púrpura de Ruhemann.
La cantidad del color formado es proporcional a la cantidad de alfa aminoácidos
reactivos presentes en la muestra y se mide por el aumento de absorbancia a 570
nm.
Test de digestibilidad – Test “in vitro”
EJEMPLO 2: