Aspectos adicionales en el estudio de

disoluciones: cuantificación colorimétrica

de la concentración

1. INTRODUCCIÓN

La intensidad de color es una propiedad de las soluciones, proporcional a la cantidad de

soluto. Este hecho es el principio de los métodos colorimétricos donde es posible conocer
la cantidad de soluto en una solución por comparación de su color con el de una serie de
soluciones que contienen el mismo soluto en cantidades variables y conocidas.

Las soluciones coloreadas absorben luz en la región visible del espectro electromagnético
y de forma cuantitativa la intensidad de luz es medida en los espectrofotómetros. Esa
propiedad permite determinar la concentración de un soluto coloreado en solución, ya que
la luz absorbida es directamente proporcional a la intensidad de color, en un cierto rango
de concentraciones que debe ser determinado experimentalmente. Esta metodología es
utilizada a nivel industrial, en investigación y también diariamente en el laboratorio clínico.
EL objetivo principal de la práctica es aplicar los fundamentos de la espectrofotometría UV-
Vis para la determinación de la concentración de disoluciones. Adicionalmente es espera
que los estudiantes afiancen sus conocimientos en la preparación de disoluciones, así como
que aprendan a construir curvas de calibración y realicen regresiones linéales e
interpolaciones.

2. OBJETIVOS

• Afianzar los conocimientos en preparación de diluciones.

• Determinar la concentración de una solución empleando colorimetría.
• Construir curvas de calibración e interpretar la ecuación de la recta y el coeficiente de
correlación.

3. ACTIVIDADES PRELABORATORIO

Antes de realizar esta práctica, el estudiante debe:

• Consultar conceptos relacionados con radiación electromagnética, transmitancia de luz

y absorbancia. Partes y mecanismo del espectrofotómetro. ¿Qué es luz
monocromática?
• ¿Qué es la ley de Beer-Lambert y cuáles son los límites en su uso?, ¿Cómo se relaciona
la transmitancia con la absorbancia y cada una de ellas con la concentración? ¿Cuál
relación es logarítmica y cual es lineal?
• ¿Qué es una curva espectral y que información brinda en la colorimetría?
• Consultar que es una curva de calibración y ¿cuál es el objetivo de generarla cuando se
utiliza la técnica colorimétrica?
• ¿Qué es un blanco de reactivos y cuál es su utilidad en la técnica colorimétrica?
• Explique el concepto de dilución seriada y factor de dilución total
• ¿Cuáles son las aplicaciones que tiene el azul de metileno y el cloruro de cobalto (II)?
• ¿Investigue porque las soluciones de azul de metileno y CoCl2 producen una coloración
característica?
• Investigue sobre métodos generalmente utilizados para cuantificar las soluciones de
azul de metileno y CoCl2 en diferentes tipos de muestras. (No olvide realizar la ficha de
seguridad de azul de metileno y CoCl2).
• Consulte en la literatura la importancia en diferentes campos del azul de metileno y
cloruro de cobalto II, y los problemas de contaminación que generan sus residuos.

4. MATERIALES DEL ESTUDIANTE

Los estudiantes deben contar con los EPP y adicionalmente calculadora, toallas de papel,
cinta de enmascarar.

5. MATERIALES QUE SUMINISTRA EL LABORATORIO

Para cada grupo de trabajo:

1 vaso de precipitados 100 mL, 1 balón aforado de 10 mL, 1 bureta de 25 mL, 2 pipetas
graduadas de 10 mL, una pipeta Pasteur plástica, 1 frasco lavador, una taza plástica para
recoger los residuos, 1 gradilla, 6 tubos de ensayo.

PARA LA DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA: (según disponibilidad de cada

laboratorio).

• 1 interfase Lab-Pro Vernier con sensor colorimétrico y su correspondiente juego de

celdas (para cada dos grupos) – si se usa este equipo, cada cuarteto deberá tener cuatro
pilas AAA.
• 1 interfase Lab-Quest con sensor colorimétrico y su correspondiente juego de celdas
(para cada dos grupos).
• 1 espectrofotómetro (colorímetro) para uso de varios grupos.
• simulador de un espectrofotómetro desarrollado por la University of Colorado y de
acceso libre: https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-law-lab/latest/beers-law-
lab_es_ES.html

Para uso común:

Pipeteadores, un balón aforado de 250 mL.

Solución de azul de metileno
Solución problema de concentración desconocida de azul de metileno.

6. ASPECTOS CONCEPTUALES

6.1. LA LEY DE BEER-LAMBERT

La interacción de la radiación con la materia, permite obtener información sobre una

muestra. Cuando la radiación pasa por una solución coloreada, una determinada cantidad
es retenida por las especies presentes atenuando la intensidad de salida. La cantidad
retenida se denomina absorbancia (A) de la muestra, la cual depende de la concentración
de la especie que absorbe; y a la cantidad que sale se le llama transmitancia (T).
Usualmente se usa el porcentaje de transmitancia, tomando como 100% la intensidad de
la radiación incidente y comparándola con la radiación de salida.

La relación entre la potencia del haz de salida (P) y la de entrada (Po) corresponde a la
transmitancia, T o a porcentaje de T.

𝑷 𝑷
𝑻=𝑷 %𝑻 = 𝑷 𝟏𝟎𝟎
𝟎 𝟎

La Ley que describe el proceso de absorción se denomina Ley de Lambert-Beer, la cual

sirve para cuantificar la concentración de las especies que absorben. Esta ley establece que
la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente c
y a la longitud del trayecto recorrido b y a una constante a denominada absortividad que
depende de factores como la especie, la celda y otros. La Ley de Lambert-Beer se expresa
como:
𝐏𝐨
𝑨 = 𝐥𝐨𝐠 = 𝐚𝐛𝐜
𝐏

La Ley de Lambert-Beer se utiliza dentro de la colorimetría para determinar cantidades de

sustancias en muestras desconocidas. Al existir una relación directa entre la concentración
de las especies en una solución coloreada y la absorbancia de la misma, es posible
establecer una curva de calibración a partir de una serie de soluciones de diferente
concentración de la muestra. El único requisito que debe cumplir la muestra es que
absorba dentro del intervalo de longitud de onda seleccionado. Un ejemplo de curva de
calibración se presenta en la figura 1. Los equipos modernos generalmente cubren desde
el ultravioleta hasta el infrarrojo (200 nm-900 nm). El equipo más sencillo para colorimetría
es el Spectronic 20 diseñado en 1952 por Bausch & Lomb, y que con algunos cambios se
sigue utilizando en la actualidad.
 0,35 y = 1,2403x - 0,0062
R² = 0,9949
0,3

0,25
Absorbancia (U.A.) 0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Concentración (M)

Figura 1. Curva de calibración de un sistema colorimétrico.

6.2. EL AZUL DE METILENO

El azul de metileno es una molécula orgánica de tipo heterocíclico aromático con fórmula
molecular: C16H18ClN3S y masa 319,85 g/mol. En forma cristalina presenta un color verde
oscuro, con brillo bronceado. Es inodoro y estable al aire. Las disoluciones en agua o en
alcohol son de color azul profundo.

3,7-bis(Dimethylamino)-phenothiazin-5-ium chloride o azul de metileno

Tiene una alta variedad de usos a nivel biológico y químico. La Organización Mundial de la
Salud lo ha catalogado como una medicina esencial. Se utiliza para tratar la
metahemoglobinemia, en intoxicaciones por cianuro (HCN), monóxido de carbono (CO) y
otros gases; también en septicemias (alteraciones inmunológicas por infecciones
bacterianas); como antiséptico y cicatrizante interno; se usa en el tratamiento del
síndrome vasoplégico, una condición potencialmente fatal del post-operatorio de cirugías
especialmente cardiopulmonares. Recientemente se ha comprobado que retrasa el
deterioro de las funciones cognitivas de los enfermos de Alzheimer. Se usa en acuacultura
de peces tropicales para tratar las infecciones fúngicas. También puede ser efectivo para
tratar peces infectados con el parásito protozoa Ichthyophthirius multifiliis. Inhibe el
crecimiento de hongos de las uñas; se utiliza como colorante en las tinciones para la
observación en el microscopio y tisulares.
7. ACTIVIDADES EXPERIMENTALES

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE Co EN UNA MUESTRA DE AGUA

SUBTERRÁNEA MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE SIMULADORES (FUERA DEL LAB)

7.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ESTÁNDAR PARA CURVA DE CALIBRACIÓN DE

CoCl2

1. Para la preparación de las soluciones estándar se iniciará con 5,00 mL de una disolución
stock de CoCl2 de concentración 1.00 M (solución 1) y a partir de la cual se asumirá la
preparación de las soluciones descritas en la tabla 1. Debido a la baja cantidad que hay en
la solución de partida se plantea la realización de una dilución seriada para la preparación
de las soluciones estándar. Teniendo en cuenta lo anterior determine el volumen de la
alícuota que se debe medir en cada caso para la preparación de cada solución.

Tabla 1. Datos para la preparación de soluciones estándar por dilución seriada.

Solución No. Concentración Alícuota Volumen Final
CoCl2 (M) solución anterior (mL)
(mL)
1 1,00 -- 10,0
2 0,500 10,0
3 0,250 10,0
4 0,200 10,0
5 0,150 10,0
6 0,100 10,0
7 0,050 10,0
8 0,025 10,0
9 0,010 10,0
10 0,005 10,0
11 0,002 10,0

2. Realice un diagrama de procesos que ilustre el proceso de dilución seriada planteado

para la preparación de las disoluciones estándar. Coloque los factores de dilución en cada
etapa.

3. Realice un diagrama de flujo sobre el procedimiento experimental que se debería

realizar en el laboratorio para la preparación de las disoluciones estándar.

4. Discuta en el informe sobre las ventajas y desventajas que se obtendrían de la

preparación de las disoluciones por el método de dilución seriada.

7.2. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA ESPECTRAL Y DETERMINACIÓN DE max

Para la realización de la curva espectral de una solución de CoCl2 utilizaremos un simulador
de un espectrofotómetro desarrollado por la University of Colorado y de acceso libre. Para
realizar la simulación vaya al siguiente link: https://phet.colorado.edu/sims/html/beers-
law-lab/latest/beers-law-lab_es_ES.html

1. Al ingresar a la página seleccione el recuadro sobre Ley de Beer. Explore todos los
controles disponibles en el simulador. El simulador permite explorar cuatro variables:
analito a analizar, longitud de onda, longitud de trayectoria (celda) y concentración
milimolar (mM). Se trata de un espectrofotómetro demasiado simplificado, que permitirá
la obtención de los datos de manera virtual simulando el análisis en el laboratorio.

2. Seleccione la solución del analito a analizar utilizando los controles disponibles para
ello en el simulador. Posteriormente encienda la lampara oprimiendo el botón respectivo
y coloque la longitud de onda en modo variable. Para una solución de CoCl2 100 mM y
utilizando el simulador determine la absorbancia de acuerdo con las longitudes de onda
sugeridas en la tabla 2.

Tabla 2. Datos para construcción de curva espectral de CoCl2

Longitud de Absorbancia Longitud de Absorbancia

onda () (u.a) onda () (u.a)
380 620
420 640
440 660
460 680
480 700
500 720
520 740
540 760
560 780
580 800
600

3. Con los datos obtenidos realice en Excel la construcción de la curva espectral para
el CoCl2. Explore el software para que pueda mejorar la gráfica: colocar títulos,
nombres de las escalas, mejorar división de escalas y ubicar el valor de max. En el
informe compare y discuta el valor determinado con el reportado en la literatura.
Discuta sobre la importancia en la determinación de max.

7.3. Determinación de la concentración de una solución de CoCl2 por el método

espectrofotométrico
1. Utilizando el simulador coloque la longitud de onda en modo fijo y anote el valor de
max obtenido previamente. Determine la absorbancia para cada una de las
concentraciones descritas en la tabla 3.

Tabla 3. Datos para construcción de curva de calibración colorimétrica.

Solución No. Concentración Absorbancia
CoCl2 (M)
1 1,00 3.00
2 0,500 3.00
3 0,250
4 0,200
5 0,150
6 0,100
7 0,050
8 0,025
9 0,010
10 0.005
11 0.002

2. Con los datos de la tabla 3 construya en Excel la curva de calibración (A vs C (M).

Explorando las funciones de Excel ajuste los datos a una línea recta, obtenga la ecuación
de la recta y su respectivo coeficiente de correlación de la gráfica (r2). Si este coeficiente
es muy cercano a 1 (mayor a 0,95) podemos decir que los datos se ajustan a una línea
recta. Adicionalmente, explore su calculadora y determine con ella la ecuación de la recta
y el coeficiente de correlación (En Moodle encuentra algunos videos de apoyo).

3. Para obtener el rango dinámico lineal donde se cumple la ley de Lambert-Beer y un

coeficiente más cercano a 1, elimine los datos de concentración y absorbancia altos que
es donde no se suele cumplir la ley (discuta cual es el criterio utilizado para poder realizar
este rechazo de datos). Determine nuevamente la ecuación de la recta y su respectivo
coeficiente de correlación de la gráfica (r2), y si el coeficiente se acerca más a 1 está
indicando esta ecuación será la que describe mejor el rango lineal dinámico de la curva de
calibración y en ese rango de absorbancias es que debe utilizarse para la determinación
de concentraciones. Discuta en el informe porque es importante la determinación del
rango dinámico lineal en las curvas de calibración.

4. A partir de la ecuación de la recta determinada anteriormente y por interpolación

calcule la concentración de una solución desconocida de CoCl2. La muestra en solución a
analizar corresponde a agua subterránea extraída por una asociación de agricultores y
que se quiere emplear para riegos de cultivos en épocas de sequía. Por lo que los
agricultores los agricultores solicitaron un análisis fisicoquímico de una muestra de agua
para determinar si esta es apta para el riego de cultivos y que cumpla con la normatividad
para ello. Dentro de este análisis se requiere la determinación de Co+2 en la muestra de
 agua y para lo cual a esta se le determinó la absorbancia utilizando un espectrofotómetro
similar al del simulador, obteniéndose un valor de 0,120. Mediante la interpolación en la
ecuación de la recta que describe la curva de calibración elaborada anteriormente,
determine la concentración en molaridad para el CoCl2 y el ion Co+2.

5. Si la FAO establece una concentración máxima permitida de 0,05 mg/L de Co en aguas

destinadas al riego, determine si esta muestra de agua es apta para ser utilizada en el
riego de cultivos. En el informe investigue y discuta sobre los inconvenientes de
concentraciones altas de Co en aguas a utilizar para riego. Adicionalmente, si la muestra
tiene altas concentración de este ion investigue y proponga potenciales soluciones que
se podrían emplear para que esta agua subterránea si se pueda utilizar en el riego de
cultivos. Finalmente, en el informe realicen una discusión del método aplicado
comparándolo con otros que se suelen utilizar para el análisis de aguas residuales.

DETERMINACIÓN DE CONCENTRACION DE UNA DISOLUCION DE AZUL DE

METILENO (ACTIVIDAD PARA REALIZAR EN EL LABORATORIO)

En esta práctica partiremos de una solución de azul de metileno, estas soluciones tienen
un característico color azul profundo. Se medirá la absorbancia para soluciones de
diferente concentración. La solución inicial se denominará “Solución stock” y tendrá una
concentración aproximada de 50 mg/L. A partir de esta solución y por diluciones se
prepararán disoluciones de concentración conocida (patrones) que servirán de base para la
construcción de una curva de calibración que relacione la absorbancia de estas disoluciones
y sus concentraciones (A vs. C).

7.4. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA ESPECTRAL

Construir la curva espectral de una muestra diluida de Azul de Metileno (AM). Indicar el
procedimiento experimental para generarla desde la labquest. Dependiendo de la
disponibilidad de equipos en el laboratorio el docente informará de otras opciones para la
obtención de datos y en el caso del uso del espectrofotómetro disponible del laboratorio
se sugiere diligenciar los datos de la tabla 1, en la que se presentan los valores de las
longitudes de onda a las que se debe medir cada punto de la curva espectral.

Tabla 1. Datos para la curva espectral (no incluir en el preinforme inicialmente)

Longitud de onda (nm) Absorbancia (±0,001)
350
400
450
500
550
600
620
 630
650
660
670
680
690
700

7.5. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ESTÁNDAR PARA CURVA DE CALIBRACIÓN

Prepare las diluciones de azul de metileno sugeridas en la tabla 2, a partir de la solución

stock. Para cada una de ellas calcule la concentración final. Puede usar la fórmula:

Vi · M i = V f · M f

Donde Vi es igual al volumen de la alícuota, Mi la concentración de la disolución de partida

para hacer la dilución, Vf es el volumen final al que se completa el volumen y Mf, la
concentración final. Disponga las disoluciones preparadas en frascos de vidrio o vasos
desechables, debidamente rotulados para su correcta identificación.

Tabla 2. Información sobre soluciones curva de calibración colorimétrica.

Concentración del Volumen de solución
Volumen de agua (mL) Absorbancia
patrón (mg/L) stock (mL)
50,0
40,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
1,0
0,0 (blanco)
Muestra problema

Brevemente,
1. Transfiera el volumen requerido de Solución stock a un balón aforado de 10 mL,
utilizando el material volumétrico apropiado. Antes de utilizar el material volumétrico
realice procedimiento de purga.
2. Complete a volumen con agua destilada hasta la línea de afore.
3. Tape el balón aforado y agite durante varios minutos.
4. Transfiera a la celda y realice la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro de las
soluciones patrón preparadas a la longitud de onda de máxima absorción obtenida en la
curva espectral.
5. Con los datos obtenidos, construya la curva de calibración graficando los valores de
absorbancia versus las concentraciones de azul de metileno (en mg/L). Utilice papel
milimetrado y/o algún software de hojas de cálculo, ajuste los datos a una línea recta y
obtenga la ecuación del gráfico.
6. Usted recibirá una muestra problema de parte de su profesor. Realice la medición de
absorbancia de la muestra problema tal como lo realizó para las soluciones de la curva
de calibración. Observe que la lectura este ubicada en el rango lineal de la curva de
calibración. Si no es así, prepare una solución diluida y lea nuevamente. Determine la
concentración de la disolución problema interpolando el dato de absorbancia sobre la
curva de calibración elaborada anteriormente. Reporte la concentración en mg/L.
7. Discuta la fórmula empleada para hallar la concentración de las diluciones preparadas.
Consulte el significado del término “factor de dilución”.
8. Discuta la recta obtenida al elaborar la curva de calibración. Discuta entre cuáles
concentraciones se puede emplear esta gráfica, según las limitaciones de la Ley de
Lambert- Beer.
9. Discuta la importancia de calibrar el equipo antes de realizar las medidas.
10. Investigue que sustancias pueden actuar como interferentes en la colorimetría.

7. DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

Todas las disoluciones que se van a preparar de azul de metileno se recogerán en un

recipiente de residuos disponible en el laboratorio.

8. BIBLIOGRAFIA

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Nacional de Colombia. Colombia.

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