Cultivos puros

Las poblaciones
• ANTES: estudio del metabolismo, nutrición y
genética de los microorganismos: INDIVIDUO
• Cuando estudiamos individuos describimos
CRECIMIENTO MICROBIANO
• AHORA: grandes grupos de microorganismos:
POBLACIONES
– Aumento: crecimiento
– Disminución: muerte.
• Cuando estudiamos poblaciones, Contamos. De
las poblaciones queremos saber
"¿cuánto?","¿cuánto más?"o"¿cuánto menos?".

Crecimiento microbiano
Incremento del número de células o de masa celular

• Célula: maquinaria sintética capaz de duplicarse

a si misma
• Procesos bioquímicos: 2000 reacciones de
distinto tipo
– Transformaciones de energía
– Biosíntesis de pequeñas moléculas, cofactores y
coenzimas Fisión binaria
– Reacciones de polimerización
Procariotas
– Ensamblaje de macromoléculas y formación de
Micrografía electrónica de barrido
estructuras celulares de la fisión binaria de la bacteria
Staphylococcus aureus.

Brotación o Gemación Crecimiento apical de los hongos

Eucariotas
Las células forman una yema que crece y se separa
de la célula parental. Ocurre en levaduras:

La levadura Saccharomyces cerevisiae

 Tiempo de duplicación o de generación
• No cambia hasta que se agota el nutriente limitante o
comienzan a acumularse los productos metabólicos
tóxicos. Cuando las condiciones para el crecimiento se
Período que requieren las células de una población hacen menos favorables, el tiempo de duplicación
microbiana (N) para crecer y dividirse para duplicar aumenta antes de que el crecimiento se detenga.
su cantidad (2N).
• Depende de la especie microbiana y de las condiciones
de crecimiento de la población. Ej., Escherichia coli td
es de unos 18 min en un medio de laboratorio rico y de
t
t g = td = unas 12 hs en el tracto intestinal de los vertebrados, en
el cual los nutrientes son menos abundantes.
n

El crecimiento exponencial El concepto de crecimiento exponencial se ilustra mediante

un paradigma matemático acerca de los lirios acuáticos.

• Velocidad de crecimiento: Cambio en el Un lirio de agua produce una hoja nueva cada día, por cada
número de células o en la masa celular hoja que tenía el día anterior. Comenzando con una única
hoja, el lirio cubre un estanque de media hectárea en unos
experimentado por unidad de tiempo. 30 días.

• Durante un período de tiempo de duplicación ¿Cuánto tardará en cubrir un estanque de una hectárea?
constante, una población microbiana se
encuentra en crecimiento exponencial. La respuesta correcta es 31 días, no 60, porque el tiempo de
duplicación es de un día. En condiciones de crecimiento
exponencial, los seres vivos se multiplican con una
asombrosa rapidez. Durante cada tiempo de duplicación se
producen tantas nuevas células como se habían producido
anteriormente de manera acumulada.

Ejemplo de crecimiento en un cultivo microbiano con

tiempo de generación de 20 minutos.

Tiempo Células / Mililitro

N = N 0 2n
Minutos Horas Número Not. Científica Logaritmo
0 0 1000 103 3,0
20 0,33 2000 2 X 103 3,301
40 0,66 4000 4 x 103 3,602
N: número final
60 1,00 8000 8x103 3,903
de células
80 1,33 16000 1,6X104 4,204
N0: número inicial
100 1,66 32000 3,2x104 4,505 de células
120 2,00 64000 6,4 x 104 4,806 n: número de
140 2,33 128000 1,28 x 105 5,107 generaciones
160 2,66 256000 2,56 x 105 5,408
180 3,00 512000 5,12 x 105 5,709
200 3,33 1024000 1,02 x 106 6,010
 Crecimiento en cultivos puros Cinética de crecimiento normal

ln X
o
ln N
dX
=X
dt

Hay muchos modelos de crecimiento

Parámetros cinéticos Empleando el tg = td, teniendo en cuenta la división

dX/dt, dN/dt, tg, , YX/S, YX/O, YATP, Productividad binaria

Durante el período logarítmico se define la N = N 0 2n

velocidad de crecimiento celular rc:  N   X 
ln   = n ln 2, también ln   = n ln 2 (2)
 dX   N0   X0 
rC =  =X
 dt 
Combinando (1) y (2):  t = n ln 2
Separando variables e integrando entre X0 y X:
Y como el tiempo de una generación es:
 X  tg = t/n, entonces
ln   =  t (1)
 X0  ln 2
=
 (h-1):
velocidad específica de crecimiento o tg
“constante” de crecimiento

Coeficiente o “constante” de rendimiento

Valores de  y de tg para distintos
Durante el período exponencial se cumple:
microorganismos
 X  dX
Microorganismo  (h-1) tg (h) YX / S =  =−
 − S  dS
S es generalmente un sustrato limitante (fuente de C o de
Bacterias 0.7 - 1.3 0.5 – 1.0 N, puede ser un factor de crecimiento, un mineral, etc.)
• Procesos aerobios sin limitación de O2, si el sustrato
Levaduras 0.35 – 0.40 1.7 – 2.0 limitante es un hidrato de carbono Y  0.5 para la
mayoría de los microorganismos
• Procesos anaerobios Y = 0.15 – 0.20.
Hongos 0.17 – 0.25 2.5 – 4.0

YX / O = YATP = 
Otras g células g células
formas g de O 2 mol de ATP
Productividad Ecuación de Monod

X  g células 
PX =  
t  lh   S 
 = max 
 S
k + S 

• Conjuntamente con Y hacen a la economía del proceso

S: concentración de sustrato limitante (podría haber más de
• Conceptualmente diferente de rC: se pueden incluir todos un sustrato limitante)
los tiempos del proceso: fase de retardo, preparación,
esterilización, cosecha de células, etc. kS (g sustrato limitante/l): constante de saturación

• La expresión completa de rC es:

Diauxia: Hay más de una fuente de C, una de ellas es
 dX  SX glucosa; ésta siempre es “fuente preferida” y reprime la
rC =   =  max síntesis de enzimas para asimilar otras fuentes de C. En E.
 dt  (k S + S ) coli sucede con los pares glucosa - lactosa y glucosa -
sorbitol.
• kS del orden de 0.02 g/l para cultivos puros. En efluentes es
mucho mayor, del orden de 0.1 g/l
• En procesos discontinuos (batch o lote) =max para la
mayoría de los casos prácticos en
microbiología industrial
• Importancia de la ecuación de
Monod: en el cálculo de los
sistemas continuos (son los más
importantes en el saneamiento),
donde S toma valores muy bajos
y limita la velocidad de
crecimiento.

Métodos para la detección y medida del Turbidez - Absorbancia

crecimiento • Medida de la masa de células: el sistema se basa en
• Métodos indirectos: medición de alguna propiedad que las células en suspensión dispersan la luz causando
– Turbidez la turbidez del cultivo.
– Actividad metabólica (Biosensores)
• La mayoría de las bacterias y levaduras
– ADN: PCR y modificaciones
– PROTEÍNAS
• Recuento total
• Métodos directos: conteo del número de individuos
o determinación de la biomasa
– Peso seco • Determinación de turbidez con espectrofotómetro
– Recuento microscópico
– Recuento electrónico • Rápido y reproducible
– Recuento en placa
– Número Más Probable (NMP) • La suspensión debe contener más de 107 células/ml; se
– Filtración requiere una curva patrón
 Actividad metabólica

• Varios procedimientos: tasa de formación de productos

metabólicos, tales como gases o ácidos; tasa de
utilización de un sustrato, como el oxígeno o la glucosa;
tasa de reducción de determinados colorantes

• Cualquier microorganismo viable

• Recuento de viables

Absorbancia = K x Peso Seco • Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso

K: constante que varía con la
longitud de onda utilizada
Peso seco: Concentración celular • Puede utilizarse con materiales complejos
bacteriana expresada en unidades
http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biol
de peso seco (µg/ml o mg/ml). ogia/docencia/FMBvirtual/CultbBact/Reque.htm

Peso seco Recuento microscópico o directo

• Observación al microscopio de volúmenes muy pequeños
• Determinación de la biomasa total seca de suspensiones de bacterias (densidad aprox. 105 cél/ml)
• Cualquier microorganismo unicelular
• Cualquier microorganismo • Se usa una cámara de recuento, ej. cámara de Petroff-
Hausser. A partir de la profundidad del pocillo y de la rejilla,
se puede determinar el número de células de un volumen
• Método sencillo (105 ºC, hasta peso constante) determinado de muestra.
• Recuento total
• Tedioso y requiere un cierto tiempo • Muy útil para el recuento de un tipo de células de una
mezcla
• Preciso y reproducible • Requiere un cierto tiempo
• No es adecuado para cultivos diluidos

http://aulavirtual.usal.es/aulavirt
ual/demos/microbiologia/unidad Area Volumen Factor
es/documen/uni_02/58/texthtml Tipo de cuadro
(cm2) (ml) [1/Volumen]
/cap804.htm
Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104
Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.

Cámara de recuento de Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se
Petroff-Hausser utilizaron para contar un el número de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del
tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado
pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3
= 5 x 10-8 ml)
 Recuento electrónico Recuento en placa
• Recuento de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
• Recuento de células con un contador • Cualquier microorganismo unicelular viable
Coulter. Las células microbianas no • Se diluye varias veces una muestra del cultivo, y
conducen la electricidad tan bien como posteriormente, se inocula o se mezcla en una caja de
su medio Petri y se incuba.
• Cualquier microorganismo unicelular • Para evitar el error debido al muestreo, se debe contar un
gran número de colonias. Se seleccionan las placas que
• Recuento total tienen entre 30 y 300 colonias y se cuentan.
• Muy útil para el recuento de células de • Muy sensible - puede detectar incluso una célula
un cultivo axénico
• Lento y tedioso
• Rápido y preciso
• No debe tener materiales extraños

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/texthtml/cap804.htm 17789/slides/slide_18.jpg

Numero más probable (NMP)

• Se basa en el principio de que una única célula viva puede
desarrollarse y producir un cultivo turbio. Después de varias
diluciones seriadas se incuban los tubos problema. Los tubos
que se ponen turbios recibieron una o más células.
Determinando la dilución media a la que los tubos no reciben
células, se puede calcular, utilizando una tabla del NMP, el
número de microorganismos que estaban presentes de manera
más probable en la muestra original.
• Recuento de viables Método del Número
• Cualquier microorganismo viable Más Probable (NMP)
• Utilizado para microorganismos que son difíciles de
cultivar en medio sólido y para determinar contaminación
por Escherichia coli en aguas
• Requiere un cierto tiempo
 Filtración por membrana
• Se concentra una muestra, de manera que se puede
contar un pequeño número de células a partir de
grandes volúmenes de un líquido o de un gas
• Cualquier microorganismo viable
• Recuento de viables

Interacciones en cultivos mixtos de dos especies

• Los cultivos de dos especies son los más estudiados,

se denominan cocultivos
• Permiten definir situaciones que se dan en la naturaleza
o que el hombre ha desarrollado en sistemas
productivos (ej. Productos fermentados en la industria
CULTIVOS MIXTOS alimenticia)
• En algunos casos (cuidado!!!) se puede extrapolar al
caso de más de dos especies
• Se presentan distintos tipos de interacciones entre
Especie 1 (E1) y Especie 2 (E2)

Neutralismo Simbiosis
(Del gr. sim: con, biosis: medios de subsistencia).

Las dos especies conviven en un mismo hábitat o Vida en común

sistema (frasco, reactor, alimentos, etc.) y no
existe interacción, ni perjudicial ni beneficiosa para • Simbiosis 1. f. Biol. Asociación de individuos animales o
ninguna de ellas vegetales de diferentes especies, sobre todo si los
simbiontes sacan provecho de la vida en común. (RAE)

• Caso poco frecuente: lo habitual es que • Es una clase de relación biológica interactiva que
haya interacción entre ambas especies mantienen seres disimilares y que suele producir un
resultado beneficioso para, por lo menos, uno de los
participantes.
(http://definicion.de/simbiosis/#ixzz393OIfzxv)
 Tipos de Simbiosis Interacciones microbiológicas

De acuerdo a la naturaleza de la interacción:

• Positiva
– Mutualismo (obligatoria, llamada antes simbiosis):
se benefician ambas especies y es obligatoria
– Cooperación
– Comensalismo (“comen en la misma mesa”)

• Negativa
– Predación
– Parasitismo
– Amensalismo
– Competición

+Mutualismo
Es una relación obligatoria entre dos
especies en la que ambas se benefician. • Si se cultivan los
Las especies separadas no sobrevivirían. organismos por
separado en medio
carente de AF y de
• E1: Streptococcus faecalis, produce normalmente FA no se observa
fenilalanina (FA), requiere la presencia en el medio de crecimiento
ácido fólico (AF), que no es capaz de sintetizar.
• Si se siembran juntos
crecen ambas
• E2: Lactobacillus arabinosus produce AF normalmente normalmente
pero no FA, que necesita para su crecimiento

Ejemplo: ciertas bacterias (E1) y algas Ejemplo: Methanobacillus omelianskii (M.o.), una
fotosintéticas (E2). supuesta “bacteria” metanogénica produce
E1: más pequeñas, desarrollan en gran número en el metano según:
interior de cada célula algal y necesitan H de C
(azúcares) y oxígeno para sus necesidades energéticas CH3CH2OH + CO2 → CH3COOH + CH4
(E) y plásticas, pero generan además productos, entre
ellos factores de crecimiento que son esenciales para El mecanismo era muy incierto, no habían fundamentos
las algas. metabólicos que lo justifiquen. M.o. resultó ser una
E2: cubren sus necesidades de energía con luz solar (h) mezcla de dos especies:
y de C con CO2, pero requieren los factores producidos E1: asimila etanol, se inhibe con H2
por las bacterias: E2: no asimila etanol, pero sí H2

E1: CH3CH2OH + H2O → CH3COOH + 2 H2

E1 azúcar + O2 → CO2 + E + factores
E2: 4 H2 + CO2 → CH4 + 2 H2O
E2 CO2 + h → azúcar + O2
2 CH3CH2OH + CO2 → 2 CH3COOH + CH4
 +Cooperación +Comensalismo
Asociación en la que el crecimiento de las dos Una especie disfruta de los beneficios que le provee
especies se ve favorecida por la presencia de la otra. la otra, que no pierde ni gana en la relación.

Ej.: algunas especies de aves que limpian de parásitos a

los rumiantes y les avisan de los posibles peligros, Dos casos:
mientras que ellas obtienen fácilmente su alimento.
Compuesto eliminado: E1 elimina un agente
tóxico para E2
Compuesto suministrado: E1 provee un
compuesto útil para E2 (vitamina, factor de
crecimiento)

- Amensalismo (Antagonismo)

Una especie sufre en la interacción con la

otra, que produce un tóxico para ella o toma Aplicación del
algún nutriente esencial. concepto de
amensalismo para el
aislamiento de cepas
productoras de
estreptomicina
Ejemplo:
E1: Penicillium chrysogenum, hongo productor del
antibiótico penicilina
E2: Staphylococcus aureus, u otra bacteria Gram +
 Ejemplo 1: Cultivo de dos bacterias en sistema
cerrado (tipo batch o en lote)
- Competencia
(supervivencia del más apto) E1: Escherichia coli
E2: Staphylococcus aureus

En cultivos puros ambas

Las dos especies dependen de una fuente común especies pueden llegar a
para ambos: alimento, luz, espacio, por lo que el niveles similares. En
mezclas E. coli alcanza
organismo de más rápido crecimiento gana la dicho nivel mientras que S.
competencia. aureus llega a un nivel muy
inferior. E. coli no produce
tóxicos para S. aureus pero
tiene mayor velocidad de
consumo de nutrientes

E1: Paramecium caudatum, de menor velocidad de

crecimiento
E2: Paramecium aurelia
Ejemplo 2: Cultivo de dos protozoarios en sistema
abierto, con suministro constante de nutrientes
(por ej. Cultivo en sistema continuo o quimiostato) Para el cultivo mixto
la E1, de menor
velocidad de
crecimiento es
Se cumple el principio de exclusión de Volterra: “cuando eliminada del
dos especies compiten en un medio limitado, una de sistema.
ellas llega a un nivel límite mientras que la otra
eventualmente desaparece” E2, algo más lenta
que en el cultivo
puro, llega al mismo
valor final de la
concentración

Depredador – presa, modelo de las oscilaciones de Lotka-

- Depredación y parasitismo Volterra (1920). Se supone que la presa se reproduce de
forma autónoma y es el único alimento del depredador.
Una especie se beneficia a expensas de la otra, Ejemplo:
que sufre daños o muerte por aquella E1: Aerobacter aerogenes, presa (bacteria)
Se reconocen dos casos (matemáticamente se tratan de E2: Tetrahymena pyriformes, depredador (protozoario)
forma similar):
• Depredación: ingestión de un organismo (presa) por el otro
(depredador). Es muy común entre microorganismos, por
ej., protozoarios-bacterias, y también en organismos
superiores (pluricelulares), por ej. grandes felinos-conejos,
lechuzas-roedores.
• Parasitismo: una especie (hospedante) generalmente de
mayor tamaño, es dañada por la otra (parásito), que se
beneficia con nutrientes del hospedante. Ej.: bacterias-
fagos
 Interacciones en cultivos mixtos de más
de dos especies
• Cadena alimenticia: orden jerárquico entre los
consumidores
• Situaciones difíciles de predecir
• Ecología: hay un orden jerárquico o preferencial en las • Nivel trófico: cada etapa de ese orden
relaciones entre consumidores de alimentos.
• Ejemplo: las bacterias son consumidoras del alimento • Red o trama alimenticia: la fusión e
glucosa, pero a su vez son consumidas por los interacción de varias cadenas alimenticias
protozoos, que se constituyen en el alimento de los (que no están aisladas unas de otras)
organismos mayores, pluricelulares (“el pez grande se
come al chico”)

DEPREDADOR
Tercer nivel • En el primer y segundo nivel trófico hay competencia y se
Tetrahymena pyriformis trófico aplica el principio de exclusión competitiva: si ambas
especies dependen de un sustrato común, a la larga una de
ellas desaparece: la de menor velocidad de crecimiento. En
PRESA I PRESA II Segundo este caso gana E. coli a A. vinelandii.
Escherichia coli Azotobacter vinelandii nivel trófico
• En el sistema Glucosa → Presa II → Depredador, se
SUSTRATO LIMITANTE encuentra que es posible mantener una auto sustentación
Primer nivel bajo ciertas condiciones, aunque con marcadas
Glucosa trófico oscilaciones (tipo “presa-predador”).
Se observan dos cadenas alimenticias:
SUSTRATO → PRESA I → DEPREDADOR • Qué ocurre cuando ambas cadenas constituyen una trama
SUSTRATO → PRESA II → DEPREDADOR alimenticia:
que se “solapan” en el primer y tercer nivel trófico

Las poblaciones mixtas de microorganismos

abundan en la naturaleza: suelo, agua, intestino
de organismos superiores.
Los dos competidores bacterianos coexisten
Ejemplo: simbiosis en rumiantes entre microorganismos y
cuando “comparten” un depredador común. Es animal (vacunos, ovinos, caprinos). El rumen en los dos
decir, que la presencia del depredador tiene un primeros estómagos de los cuatro que posee el animal,
efecto estabilizante, evitando que se elimine del es un cultivo mixto denso (1010 células/ml) compuesto
sistema ninguna especie involucrada en la trama de bacterias y protozoos. En esta compleja y diversa
población se han observado interacciones mutualísticas,
alimenticia. competitivas, amensalistas y de presa-depredador. El
efecto neto de la actividad microbiana en el rumen es la
descomposición de la materia vegetal, incluso celulosa y
otros carbohidratos complejos, en sustancias más
simples que pueden ser absorbidas por el torrente
sanguíneo del animal.
 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/4a/Biofilm.jpg/300px-Biofilm.jpg

Etapas de formación de un biofilm

Biofilms

• Grupos de células normalmente en poblaciones mixtas

(comunidades) que se adhieren una superficie (viva o
inerte) y forman una estructura en 3 dimensiones, unida
por sustancias poliméricas extracelulares (matriz de
exopolisacáridos) producidas por ellas mismas.
• Representa la forma habitual de crecimiento de las
• 1° y 2° etapas: las células planctónicas presentan una
bacterias en la naturaleza.
asociación leve y débil al sólido seguida por una fuerte
• Ej: material mucoso en los jarros de flores, material adhesión.
mucoso que recubre piedras resbaladizas en los ríos, • 3° y 4° etapas: agregación celular en microcolonias seguido
placa dental, etc. por la maduración de la biopelícula.
• 5° etapa: las células se desprenden de la colonia y retornan
a la vida planctónica transitoriamente y se dispersan

Importancia de los biofilms Bibliografía

 Madigan M., Martinko J., Parker J. Brock. Biología de

• Causantes de múltiples enfermedades infecciosas, los Microorganismos. Pearson Prentice Hall, 2009.
difíciles de diagnosticar y tratar  Schlegel H.G. Microbiología General. Ediciones
Omega, Barcelona, 1997.
• Aumentan la resistencia a antibacterianos
 Willey J.M., Sherwood L.M., Woolverton C.J. Prescott,
• Presentes en el interior de cañerías Harley, and Klein´s Microbiology. Mc Graw Hill Higher
Education, 2008.
• Tienen aplicaciones en producción de compuestos
biológicos, tratamientos de efluentes, descomposición
de materia orgánica, etc.