31/10/2023
Métodos y
técnicas
experimentales
asociadas al
estudio de la
replicación
Amplificación (PCR convencional, inversa, anidada y en tiempo real)
La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, por sus siglas en
inglés) es una técnica de laboratorio
que permite la producción
(amplificación) rápida de millones a
miles de millones de un segmento
específico de ADN
Implica el uso de fragmentos cortos de ADN sintético, denominados cebadores, para
seleccionar un segmento del genoma que se amplificará, y luego múltiples sesiones de
síntesis de ADN para amplificar ese segmento
1
31/10/2023
Aplicaciones de la PCR
✓ La PCR es extremadamente valiosa para
obtener ADN para la clonación de genes o con
fines de secuenciación
✓ Los genes de interés se pueden amplificar
fácilmente si se conocen las secuencias que
los flanquean
Aplicaciones de la PCR
✓ Se utiliza rutinariamente en estudios
comparativos o filogenéticos (Se producen
comercialmente los cebadores para
regiones del gen cuya secuencia esta
conservada)
✓ Técnica usada en ecología microbiana,
medicina forense, diagnóstico clínico,
epidemiología, fitopatología, investigación
científica, entre otros.
2
31/10/2023
En la década de 1980, el Dr. Kary Mullis desarrolló una metodología llamada Reacción en
Cadena de la Polimerasa
Síntesis in vitro de pequeños fragmentos de ADN que
se realiza en pocas horas y sin necesidad de usar
células vivas, empleando una enzima llamada ADN
polimerasa
Las características distintivas de la PCR es sin duda su
extraordinaria versatilidad. Esa versatilidad es más
por su "aplicabilidad" a diversas áreas
Nació el 28 de diciembre de 1944
Premio Nobel de Química en 1993
En 1966, el Dr. Thomas Brock y
sus colegas aislaron una nueva
bacteria, Thermus aquaticus, de
una fuente termal en la Cuenca
del Géiser Inferior (Yellowstone)
Kary Mullis identificó una
enzima en la bacteria a la que
denominó Taq polimerasa
(utilizando la T de Thermus y
la aq de aquaticus).
Thermophiles from Doublet Pool
3
31/10/2023
Extremófilos Taq ADN polimerasa
Termófilos, adaptados a altas temperaturas; psicrófilos, adaptados a bajas temperaturas; halófilos, adaptados
a ambientes salinos; acidófilos, adaptados a ambientes ácidos; y alcalófilos, adaptados a ambientes alcalinos;
entre otros
El agua de esta fuente termal alcalina y silícea que emanan a
una temperatura de 92 °C.
Células de Thermocrinis ruber, que crecen como
serpentinas filamentosas adheridas a conglomerados
silíceos en la corriente de salida (85 °C).
Micrografía electronica de barrido de células de T. ruber con
forma bacilar creciendo sobre un cubreobjetos
recubierto de silicio
4
31/10/2023
Clonan el gen de la Taq ADN
polimerasa
Construyen una quimera molecular
(ADN recombinante). El ADN
recombinante puede ser incorporado
en una bacteria como E. coli, con el
propósito de que ésta produzca
la Taq ADN polimerasaa partir del
ADN recombinante
La ingeniería genética ha permitido optimizar la Taq ADN polimerasa para aumentar su
fidelidad (capacidad de hacer copias fieles de ADN) y especificidad.
ADN polimerasas
Termoestable, termoactivas y de alta fidelidad
(con actividad “correctora”) provenientes de
bacterias del dominio Archaea, como la ADN
polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus
10
5
31/10/2023
Reactivos, volúmenes y concentraciones finales usadas
para una reacción estándar de PCR
Reactivo Volumen (50µL) Concentración final
ddH2O 41.25 NA
BUFFER [10X] 5 1X
MgCl2 [50 mM] 1.5 1.5mM
dNTPs [10mM] 0.5 100µM
Cebadores [20 µM] 0.25 0.1µM
ADN 1 10ng
ADN Polimerasa [5 U/µL] 0.5 1 – 2.5 unidades
11
Las etapas de la amplificación del ADN por PCR estándar son:
1. El DNA molde se desnaturaliza por calor
2. Se unen los dos cebadores (oligonucleotides de ADN artificiales)
3. La ADN-polimerasa extiende los cebadores usando el ADN original como molde
4. Tras un periodo de incubación adecuado,
la mezcla se calienta de nuevo para separar
las cadenas, pero ahora la secuencia diana
está presente en el doble de la cantidad
original
12
6
31/10/2023
En un principio, para llevar a cabo
el ciclo de PCR, se calentaba la
Termociclador
mezcla en baño Maria
Poco eficiente
13
¿Cuáles tiempos
y temperaturas
se pueden variar?
Perfil térmico
14
7
31/10/2023
15
16
8
31/10/2023
17
18
9
31/10/2023
20
Cinética de amplificación de la PCR. En
los primeros ciclos de la PCR no hay un
incremento significativo en la cantidad
de ADN sintetizado.
21
10
31/10/2023
PCR Cuantitativa o tiempo real (qPCR)
Es una técnica en el cual la acumulación de
ADN amplificado es detectado y
cuantificado a medida que la reacción
avanza “En tiempo real”, ya que se
incorpora una molécula fluorescente que se
asocia al ADN amplificado, donde el
incremento de esta fluorescencia es
proporcional al incremento de la cantidad
de moléculas de ADN amplificadas en la
reacción
22
PCR digital (dPCR)
Funciona mediante la división de una muestra de ADN o ADNc en muchas reacciones de
PCR individuales en paralelo
Ofrece ventajas sobre la PCR en tiempo real, ya que tiene el potencial para realizar una
cuantificación absoluta con precisión, aumentando sensibilidad y exactitud.
23
11
31/10/2023
Ventajas de la PCR digital:
✓ No es necesario depender de referencias o estándares.
✓ Capacidad para aumentar la precisión mediante más repeticiones de PCR.
✓ Alta tolerancia a los inhibidores.
✓ Capacidad para analizar mezclas complejas.
24
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
Utiliza la enzima retroviral, transcriptasa
inversa, para convertir ARN en su ADN
complementario (ADNc)
Puede emplearse para sintetizar ADN a partir
de un ARNm molde. Este procedimiento se
puede utilizar para detectar si un gen se
expresa o para producir genes eucarióticos
libres de intrones para su expresión en
bacterias
25
12
31/10/2023
RT: transcriptasa reversa
q: cuantitativa o en tiempo real PCR de transcriptasa inversa cuantitativa
(RT-qPCR)
Se usa cuando el material de partida es
ARN. En este método, el ARN se transcribe
primero en ADN complementario (ADNc)
mediante transcriptasa inversa a partir de
ARN total o ARN mensajero (ARNm). Luego,
el ADNc se usa como molde para la reacción
de qPCR
26
PCR digital PCR en tiempo real PCR tradicional
Mide la fracción de réplicas Mide la amplificación de PCR Mide la cantidad de
negativas para determinar las conforme se produce. producto de PCR
Descripción copias absolutas. acumulado al final de
general los ciclos de PCR.
Sí, la fracción de reacciones de Sí, porque los datos se recopilan No, aunque la
PCR negativas se ajusta a un durante la fase (logarítmica) de comparación de la
algoritmo estadístico de crecimiento exponencial de PCR intensidad de la banda
Poisson cuando la cantidad de producto amplificada en un gel
¿Cuantitativa? de PCR es directamente según los patrones de
proporcional a la cantidad de una concentración
ácido nucleico de la plantilla. conocida puede ofrecer
resultados
«semicuantitativos».
[Link]
27
13
31/10/2023
PCR digital PCR en tiempo real PCR tradicional
Cuantificación absoluta de Cuantificación de la
Amplificación de ADN para:
la carga vírica expresión génica
Cuantificación absoluta de
Verificación de la
patrones de ácidos Secuenciación
micromatriz
nucleicos
Cuantificación absoluta de
bibliotecas de Control de calidad y
Elaboración de genotipos
secuenciación de última validación de ensayos
generación
Aplicaciones Detección de alelos raros Detección de patógenos Clonación
Cuantificación absoluta de Elaboración de genotipos
la expresión génica SNP
Enriquecimiento y Variación del número de
separación de mezclas copias
Análisis de microARN
Cuantificación vírica
Experimentos de
ARNip/ARNi
28
[Link]
29
14
31/10/2023
PCR en tiempo real (qPCR) [Link]
30
[Link]
31
15
31/10/2023
SECUENCIACIÓN
El término secuenciación en
biología se refiere a determinar
el orden preciso de las
subunidades en una
macromolécula.
En el caso del ADN (o del ARN),
la secuencia es el orden en el
que están alineados los
nucleótidos
32
Métodos de secuenciación del ADN
33
16
31/10/2023
Historia de la
tecnología de
secuenciación
La palabra «generación» en la secuenciación del ADN indica los cambios tecnológicos
principales que han brindado un aumento significativo de la velocidad de análisis, combinado
con un descenso en el precio de secuenciar
Yang, A. et al (2020). Review on the application of machine learning algorithms in the sequence data mining of DNA. Frontiers in Bioengineering
and Biotechnology, 1032
34
Primera generación
Método didesoxi de Sanger
En el método de Sanger la secuencia se determina
haciendo copias del ADN original de cadena sencilla
mediante la enzima ADN polimerasa
Sus componentes son similares a los necesarios para
PCR
Didesoxi o terminadores de la cadena, de los cuatro
nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno
marcado con pigmentos de color diferente
35
17
31/10/2023
Durante el proceso:
Se obtienen cadenas de ADN de diferentes longitudes
debido a que los didesoxirribonucleotidos se insertan
aleatoriamente, y estos fragmentos son separados mediante
electroforesis en gel según su tamaño
36
La ADN polimerasa añade nucleótidos
a la cadena hasta que aleatoriamente
agregue un nucleótido didesoxi en
lugar de uno normal y la cadena
termina con el nucleótido didesoxi
Cuando los ciclos terminan, está
garantizado que se ha incorporado un
nucleótido didesoxi en cada una de las
posiciones del ADN blanco en al menos
una reacción
37
18
31/10/2023
38
Usos y limitaciones
Se obtienen secuencias de alta calidad para segmentos relativamente largos de ADN (~900 pb)
Se usa ampliamente en aplicaciones y verificación de secuenciación convencional
La secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente para proyectos a gran escala
39
19
31/10/2023
Segunda generación
La característica que define a la secuenciación
de segunda generación es el uso de métodos
masivos en paralelo (un gran número de
muestras son secuenciadas juntas en la misma
máquina)
Los tres métodos de segunda generación más
usados son:
✓ Pirosecuenciación 454 de Life Sciences
✓ Secuenciación de Illumina/Solexa
✓ Método SOLiD de Applied Biosystems
40
Todas las técnicas NGS para lograr secuenciar una
gran cantidad de fragmentos de ADN de forma
paralela en un corto lapso tienen una
metodología semejante:
1) Segmentación del ADN en varios fragmentos
(preparación de librerías). Selección por tamaño
2) Marcaje del ADN por medio
de primers (adaptadores) que indican el punto de
partida para la replicación
Rubio, S., et al (2020). Secuenciación de nueva generación (NGS) de ADN: presente y futuro en la práctica
clínica. Universitas Medica, 61(2), 49-63.
41
20
31/10/2023
3) Amplificación de los fragmentos de ADN
marcados con adaptadores por métodos
basados en PCR
4) Secuenciación o lectura de los fragmentos
de ADN
5) Reconstrucción de la secuencia completa
Rubio, S., et al (2020). Secuenciación de nueva generación (NGS) de ADN: presente y futuro en la práctica clínica. Universitas Medica, 61(2), 49-63.
42
43
21
31/10/2023
PCR en emulsión (ePCR)
44
PCR en puente
45
22
31/10/2023
Pirosecuenciación 454 de Life Sciences
✓ Se corta el ADN en segmentos (400 - 600pb)
✓ Cada reacción de amplificación se produce en el interior de una micela que contiene una
molécula de ADN, una molécula de polimerasa y el resto de los componentes necesarios
para que se produzca la reacción (PCR en emulsión)
✓ Cada perla tiene oligonucleótidos (sondas) adheridas a su superficie, la secuencia de estas
sondas es complementaria a la de los fragmentos adaptadores
✓ Después de la construcción de la biblioteca, la emulsión resultante, que contiene las perlas
se deposita en una placa
46
✓ Se añaden otro tipo de microesferas (luciferasa +
sulfurilasa)
✓ Una vez que la polimerasa agrega un nucleótido, se
produce una reacción de sulfurilasa-luciferasa que
emite luz
✓ La placa sirve como una celda de flujo en la que se
agrega una solución de un solo nucleótido a la vez. La
adición de nucleótidos da como resultado emisión de
luz
✓ La placa está acoplada con una cámara de alta
resolución (CCD) que toma fotografías de cada ronda de
nucleótidos
47
23
31/10/2023
Secuenciación de Illumina/Solexa
✓ El procedimiento para la construcción de
bibliotecas también se basa en la síntesis
de cadenas complementarias de ADN
mediante PCR
✓ Una vez que se seleccionan los
fragmentos del tamaño deseado, se
agregan adaptadores específicos de la
plataforma que permiten la conexión a la
matriz de secuenciación
que admitirá la amplificación y la secuenciación del puente
48
✓ La adición de un nucleótido bloquea
la incorporación posterior de
nucleótidos, interrumpe la síntesis y
libera una señal fluorescente que es
única para cada tipo de nucleótido
✓ Después de la toma de imágenes, el grupo de bloqueo se elimina y deja las hebras de ADN
listas para la próxima incorporación de nucleótidos por parte de la ADN polimerasa
✓ Esta serie de pasos continúa durante un número específico de rondas, lo que permite
longitudes de lectura de 60 a 150 bases
49
24
31/10/2023
50
51
25
31/10/2023
52
Método SOLiD de Applied Biosystems
✓ Secuenciación por detección de ligadura de oligo
✓ La construcción de la librería se produce a través
de PCR en emulsión
✓ Las perlas resultantes se unen covalentemente a
un portaobjetos de vidrio de celda de flujo
✓ Usa ADN ligasa para secuenciar
✓ Implica la ligadura de la sonda a un cebador universal. El evento de ligadura libera
fluorescencia
✓ El portaobjetos con perlas adheridas se expone a reacciones enzimáticas cíclicas
53
26
31/10/2023
✓ Cada sonda de interrogación es un octámero,
2 bases específicas de sonda seguidas de 6
bases degeneradas (nnnzzz)
✓ Las 2 bases específicas de sonda constan de
una de las 16 posibles combinaciones de 2
bases
✓ Después del reconocimiento y ligadura de la
sonda, se registra la fluorescencia antes de la
escisión de las últimas 3 bases de sonda
degeneradas
54
Secuenciación de ADN de tercera generación:
Secuenciación SMRT, Pacific Biosciences
Secuenciación molecular única
en tiempo real (SMRT)
Funciona mediante el uso de una polimerasa de ADN para
restringir la replicación del ADN a micropocillos y se agrega
marcadores trazadores fluorescentes a varias bases, que
emiten destellos de diferentes colores cuando los nucleótidos
marcados con fluorescencia sintetizan la cadena de ADN
55
27
31/10/2023
Secuenciación de ADN de cuarta generación: Ion-Torrent
✓ Fragmentación del ADN y la ligadura del adaptador.
✓ La biblioteca de perlas de la emulsión PCR se deposita en
un "chip" con millones de pocillos, donde solo cabe 1 perla
en cada pocillo
✓ Cada pozo está integrado a la capa sensible a iones del chip
y un sensor de iones patentado para registrar los cambios
de voltaje muy pequeños (por pozo) que resultan de la
adición de nucleótidos durante la secuenciación de ADN
por síntesis
✓ En lugar de emisión de luz, la adición de cada base produce un cambio de voltaje
56
57
28
31/10/2023
Cobertura (coverage):
Se refiere al porcentaje de bases del genoma de referencia que están siendo secuenciadas una
cantidad determinada de veces
Profundidad (depth o depth of coverage):
Representa el número promedio de veces que
cada base en el genoma es secuenciada en los
fragmentos de ADN
Los valores apropiados de profundidad dependerán de la aplicación de la técnica de
secuenciación
58
¿Por qué es importante que la
secuenciación sea rápida y barata?
La capacidad de secuenciar genomas de
forma rutinaria abre nuevas posibilidades en
la investigación biológica y en aplicaciones
biomédicas.
59
29
31/10/2023
La mayoría de las técnicas comparte un conjunto común de
características que las distinguen de la secuenciación de
Sanger:
Altamente paralelas: ocurren muchas reacciones de
secuenciación al mismo tiempo.
Rápidas: las reacciones se realizan en paralelo, los
resultados están listos mucho más rápido.
Bajo costo: secuenciar un genoma es más barato que con la
secuenciación de Sanger.
Longitudes más cortas: típicamente, las lecturas se obtienen
con fragmentos de entre 50 700 nucleótidos de longitud.
60
HIBRIDACIÓN
Es el proceso en el que dos moléculas
complementarias de una sola hebra de ADN y/o
ARN se unen y forman una molécula de doble
cadena (un híbrido de doble cadena). La unión
depende del apareamiento apropiado de las bases
entre las dos moléculas de una sola hebra
No sólo se puede producir entre dos ADN distintos, sino
también entre ADN y ARN, siempre que sus secuencias de
nucleótido sean complementarias
61
30
31/10/2023
Sonda
Es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple
que se utiliza para encontrar su secuencia
complementaria en el genoma de una muestra
La sonda se coloca en contacto con la muestra
bajo condiciones que permitan que la secuencia
de la sonda hibriden con su secuencia
complementaria.
La sonda está marcada con un marcador
radiactivo o químico que permite visualizarla
62
Southern blot
Es una forma de analizar moléculas
de ADN
✓ El ADN purificado proveniente
de una muestra biológica se
digiere mediante una enzima de
restricción
✓ Los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante
electroforesis, que permite que los fragmentos más pequeños
se desplacen más rápido que los fragmentos más grandes
63
31
31/10/2023
Sondas de DNA (o RNA) marcadas radiactivamente (32P o con fluorescencia)
64
[Link]
65
32
31/10/2023
[Link]
66
Genes sintéticos
Venter, J. C., Glass, J. I., Hutchison, C. A., & Vashee, S. (2022). Synthetic chromosomes, genomes, viruses, and cells. Cell, 185(15), 2708-2724..
67
33
31/10/2023
Mecanismos de reparación
Existen mecanismos para corregir errores durante la
replicación del ADN y para reparar daños en el ADN
durante la vida de la célula
Las células cuentan con mecanismos complejos que vigilan la integridad del ADN, activando
mecanismos de reparación cuando hay deficiencias o errores durante la replicación
Si el ADN se daña, se puede reparar por varios mecanismos, que incluyen reversión
química, reparación por escisión y reparación de ruptura de la doble cadena
68
Los daños en el ADN pueden generar cambios en la expresión de
genes:
Endógeno
• Mutaciones
• Muerte celular
• Crecimiento celular (tumores)
Agentes genotóxicos exógenos
• Luz ultravioleta y otros tipos de radiación (X, γ, rayos cósmicos) Una célula puede
experimentar hasta 105
• Aminas aromáticas, hidrocarburo de arilo, cloruro de vinilo y
lesiones espontáneas
ciertos metales que generan, directamente o indirectamente,
en un día
daños en la molécula de ADN
69
34
31/10/2023
Durante la replicación las ADN
polimerasas pueden “corregir" bases
mal añadidas. Si la polimerasa detecta
que ha agregado un nucleótido
equivocado (apareado
incorrectamente), lo quita y lo
reemplaza, antes de continuar con la
síntesis de ADN
70
La reparación por escisión de nucleótidos
detecta y corrige tipos de daño que
distorsionan la doble hélice del ADN
Detecta bases que han sido modificadas
con grupos químicos voluminosos, como
los que se unen al ADN cuando se expone
a sustancias químicas
71
35
31/10/2023
La radiación UV (longitud de onda
entre 250 y 320 nm), puede ocasionar
alteraciones químicas en las bases del
ADN.
Fotorreactivación: sistema de
reparación directa de los daños
producidos por la luz UV.
72
Cuando una polimerasa replicativa encuentra un dímero de
timina o una lesión voluminosa, no puede replicar a partir de
este lugar.
La doble hélice se distorsiona debido al dímero de timina, lo
que hace que la estructura sea reconocida como un mal
apareamiento y la actividad 3' exonucleolítica de la DNA
polimerasa III
La síntesis de un fragmento de Okazaki puede comenzar, por
dejando que sería letal si no se reparara, ya que generaría una
rotura de doble cadena en el ciclo de replicación siguiente
Pol ƞ humana
73
36
31/10/2023
La UV produce dímeros de pirimidinas, fundamentalmente dímeros de Timinas. El enzima
Fotoliasa codificada por el gen phr reconoce los dímeros de Timina y se une a ellos, y
cuando se expone a la luz (mediante un fotón) deshace el dímero de Timinas
74
La reparación por escisión de base es
un mecanismo que se usa para
detectar y eliminar ciertos tipos de
bases dañadas
Una reacción química llamada
desaminación puede convertir una
base citosina en uracilo, una base que
suele encontrarse solo en el ARN
75
37
31/10/2023
Reconocimiento de un nucleótido inusual en el ADN mediante cambio de base
Enzima: Glucosilasa
Enzimas que escinden el enlace
glicosídico que conecta una base
reconocida particular con el azúcar
principal, eliminándolo del ADN
76
Reparación de rotura de la
doble cadena
Algunos factores ambientales, como la
radiación de alta energía, pueden causar
roturas en la doble cadena del ADN
(rompen un cromosoma en dos)
En las roturas de la doble cadena pueden perderse grandes segmentos de cromosomas y los
cientos de genes que contienen si la fragmentación no se repara.
Tiene lugar de forma natural durante la recombinación meiótica
77
38
31/10/2023
El proceso de reparación inicial con la fosforilación de una forma variante de la histona
H2, H2AX, en los nucleosomas cerca de la rotura.
El lugar diana es Ser-139, en la cola C-terminal de la histona
78
Recombinación homóloga
Se utiliza la información del cromosoma homólogo que
coincide con la del dañado (o de una cromátida hermana
si el ADN se ha copiado) para reparar la fragmentación
Solo puede tener lugar durante las fases del ciclo celular S o G2
79
39
31/10/2023
Unión de extremos no homólogos
Los dos extremos rotos de un cromosoma simplemente
se vuelven a pegar. Por lo general resulta en la pérdida,
o a veces adición, de unos cuantos nucleótidos en el
sitio de corte
La proteína Ku, un heterodímero que capta los extremos
rotos de los cromosomas. Pero, proteínas adicionales son
necesarias para mantener unidos los extremos rotos
mientras se procesan
Finalmente se unen de forma covalente
80
40
