Universidad de

Guayaquil
Facultad de Ciencias
Químicas
Carrera: Bioquímica y
Farmacia
Análisis Instrumental I

Práctica # 6 LIMITACIONES DE LA LEY DE LAMBERT-BEER

Integrantes:
 Catherine Chancay Reyes
 Ginger Díaz Jiménez
 Arturo Zambrano Ibarra
 Vanessa Viteri Carangui
Objetivos de la práctica de laboratorio
 Elaborar la curva de calibrado para la identificación de posibles desviaciones o limitaciones de la
ley de Lambert-Beer

MARCO TEORICO:
La relación entre la absorbancia y la concentración de un analito se establece mediante la Ley de
Lambert-Beer, pues esta describe cómo la absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a
su concentración (c) y a la longitud del camino óptico (l):

Sin embargo, no siempre se cumple perfectamente, como cualquier ley teórica, tiene limitaciones
prácticas que pueden deberse a varios factores.

La linealidad en la Ley de Beer:

Una de sus ventajas más simples es la linealidad de la absorbancia con la concentración. Para un analito,
cuando la temperatura, la longitud de onda y la longitud de onda de la radiación se mantienen constantes,
la absorbancia es directamente proporcional a la concentración.

Y esto mantiene una proporcionalidad lineal entre la

absorbancia y la concentración, por lo que al trazar un gráfico
entre ellas se obtiene una línea recta que pasa por el origen:

Pero si no se comporta así, se observa una desviación en la

linealidad y por consiguiente una desviación en la Ley de
Lambert-Beer. Y esta no linealidad puede producirse por una
diversidad de situaciones que se categorizan principalmente en
tres tipos:
 Desviaciones reales o fundamentales
 Desviaciones espectrales o instrumentales
 Desviaciones químicas

 Desviaciones reales
Estas se deben a cambios en el comportamiento físico-químico de la sustancia a concentraciones
altas.

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  Interacciones moleculares: A altas concentraciones, las moléculas pueden interactuar
entre sí (agregación, disociación, asociación), cambiando su capacidad de absorber luz.

 Cambio en la constante de equilibrio: Algunas sustancias pueden ionizarse o asociarse

dependiendo de la concentración.

 Variación del índice de refracción del medio: Cambios en el índice afectan el paso de la
luz.

Ejemplo:
Supongamos que se ha colocado una solución concentrada y registrado la absorbancia como A1
Ahora se ha diluido la muestra a la mitad de su concentración y nuevamente registrado la
absorbancia como A2

Dado que se ha diluido la concentración a la mitad, la

absorbancia también debería reducirse a la mitad. En
otras palabras, A2 = A1/2. Pero en realidad, puede
que no suceda así, por eso se llama desviación real.

¿Qué causa la no linealidad aquí?

La velocidad de la luz que pasa en la concentración más alta puede no ser igual a la de la
concentración más baja. La velocidad de la luz puede variar con el medio a través del cual pasa.
Esto puede darse por el índice de refracción.

Entonces, en las concentraciones más bajas, el índice de refracción está más cerca de 1, pero a
concentraciones más altas es menor que 1 y afecta significativamente la velocidad de la luz,
provocando una desviación de la Ley de Beer-Lambert.

Entonces, ¿cómo se puede eliminar esta

desviación real? Puede eliminarse mediante
la dilución, de modo que el índice de
refracción sea el mismo e igual a 1 en todas
las muestras.

Por ejemplo, se prepara una serie de

concentraciones de la muestra a 0,5 μM, 10
μM, 20 μM, 40 μM, etc.

 Desviaciones instrumentales
Provienen de limitaciones técnicas del espectrofotómetro o de errores humanos.

 Luz policromática: La ley asume luz monocromática. Si se usa luz con múltiples longitudes
de onda, cada componente puede ser absorbido de manera diferente.

 Ancho de banda espectral del instrumento: Si es muy grande, puede causar errores en la
medición.

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  Dispersión de la luz: Por partículas en suspensión o burbujas en la muestra (efecto
Tyndall).

 Reflejo y refracción en cubetas: Pérdidas de luz debido a mala alineación o material de

baja calidad.

Ejemplo:
Una muestra presenta una absorción máxima a 560
nm y se envía una radiación de longitudes de onda de
550 a 570 nm. Como el ancho de banda de la radiación
es solo de 20 nm, puede obedecer la Ley de Beer-
Lambert.

Por otro lado, si se envía una radiación con un rango

de longitudes de onda de 520 nm a 600 nm, es posible
que no se logre la linealidad y se produzca una
desviación.

Entonces, cuando se usa radiación policromática, la Ley de Beer-Lambert no se cumple

estrictamente y no se observa la linealidad.

Entonces ¿cómo se puede eliminar esta desviación

espectral? Como esta desviación se produce con
radiación policromática, se debe seleccionar un
monocromador adecuado que permita pasar solo un
rango estrecho de longitudes de onda de radiación a
través de la muestra.

 Desviaciones químicas
Ocurren cuando se producen reacciones químicas, asociaciones, disociaciones o cambios
estructurales en el analito durante la medición, lo cual altera su capacidad de absorber luz.

Estas modificaciones pueden afectar el coeficiente de absorción molar (ε), provocando que la
absorbancia medida no sea directamente proporcional a la concentración.

 Cambios de pH: Algunas sustancias cambian de forma (y

por tanto de absorbancia) dependiendo del pH.

 Formación de complejos: Si se forman nuevos

compuestos en solución, tendrán diferentes coeficientes
de absorción.

 Fotodegradación: Algunas especies se descomponen con la luz durante la medición.

 Asociación o disociación molecular: Muchas sustancias existen en equilibrio químico en

solución. Dependiendo de la concentración, pH o temperatura, pueden disociarse (romperse
en iones) o asociarse (formar dímeros, trímeros, etc.).

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 Esto cambia el número de especies absorbentes o sus características espectrales.

Pero ¿cómo evitar esta desviación? Para evitar

esta desviación, es importante mantener
condiciones constantes de pH, temperatura y
composición del disolvente durante las
mediciones.

Limitaciones en la ley de Lambert-Beer:

La linealidad de la ley de Beer-Lambert está limitada por factores químicos e instrumentales. Las causas
de la no linealidad de la ley se producen en las siguientes condiciones:

 Desviaciones en los coeficientes de absortividad a altas concentraciones (>0,01 M) debido a

interacciones electrostáticas entre moléculas en estrecha proximidad.

 Dispersión de la luz debido a partículas en

la muestra.

 Fluorescencia o fosforescencia de la
muestra.

 Cambios en el índice de refracción a altas

concentraciones de analito.

 Cambios en los equilibrios químicos en

función de la concentración.

 Radiación no monocromática, las desviaciones se pueden minimizar utilizando una parte

relativamente plana del espectro de absorción, como el máximo de una banda de absorción.

 Luz parásita.

Reactivos de laboratorio:
 Cromato de potasio
 Hidróxido de potasio
 Agua destilada
Materiales:
 Matraces volumétricos
 Pipetas volumétricas
 Auxiliar de pipeteo
 Pipeta automática

Equipos de laboratorio
 Espectrofotómetro GENESYS 10
 Balanza analítica

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Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento
 Preparar 1000 ml de una solución 0.05 N de Hidróxido de potasio
 Preparar 500 ml de una solución estándar de Cromato de potasio que contenga 70 µg de ION
CROMATO /ml. Utilice como disolvente la solución 0.05 N de hidróxido de potasio.
 A partir de esta solución prepare 5 estándares de trabajo, tome las siguientes alícuotas de:

VOL. DILUCION CONCENTRACION

ALICUOTA
(Sol. 0.05 N KOH) µg/ml
0,5 ml 10 ml 3,5
1,0 ml 10 ml 7,0
1,5 ml 10 ml 10,5
2,0 ml 10 ml 14,0
2,5 ml 10 ml 17,5

PARTE INSTRUMENTAL:
1. Encienda el instrumento
2. Seleccione la longitud de onda, 370 nm.
3. Configure el instrumento utilizando la solución 0.05 N de Hidróxido de potasio como blanco.
4. Coloque en el recipiente de la muestra la cantidad necesaria de la dilución preparada, lleve a la
marcha de los rayos y realice las diferentes lecturas.

Resultados obtenidos

Cálculos:

Hidróxido de potasio (KOH):

𝑚 ∗ 𝑒𝑞
𝑁=
𝑃𝑀 ∗ 𝑉

𝑚∗1
0,05 𝑁 = 𝑔
56,11 ∗ 1𝐿
𝑚𝑜𝑙
𝑔
0,05𝑁 ∗ 56,11 ∗ 1𝐿
𝑚𝑜𝑙 =𝑚
1

2,81 𝑔 𝐾𝑂𝐻 = 𝑚

Cromato de potasio (K2CrO4):

70 µg ión CrO4 ------ 1 ml sol. Estándar

x ------- 500 ml

x = 35,000 µg ión CrO4

1 𝑔 𝐶𝑟𝑂4
35,000 µg CrO4 ∗ = 0,035 𝑔 𝐶𝑟𝑂4
1,000.000 µg CrO4
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 194,19 g/mol K2CrO4 – 78,18 g K2 = 116,01 g CrO4

194,19 g K2CrO4 -------- 116,01 g CrO4

x ------- 0,035 g CrO4

x = 0,058 g K2CrO4

Alícuotas:

C1*V1 = C2*V2

𝐶1 ∗ 𝑉1
= 𝐶2
𝑉2
70 µ𝑔 ∗ 0,05 𝑚𝑙
= 3,5 µ𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙
70 µ𝑔 ∗ 1,0 𝑚𝑙
= 7,0 µ𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙
70 µ𝑔 ∗ 1,5 𝑚𝑙
= 10,5 µ𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙

70 µ𝑔 ∗ 2,0 𝑚𝑙
= 14,0 µ𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙
70 µ𝑔 ∗ 2,5 𝑚𝑙
= 17,5 µ𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙

Tabla 2. Registro de los valores de concentración y absorbancia dados por el Espectrofotómetro

GENESYS 10

CONCENTRACION
Nivel No. ABSORBANCIA
µg/ml
0 0 0
1 3,5 0,160
2 7,0 0,331
3 10,5 0,395
4 14,0 0,597
5 17,5 0,753

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Gráfico 1. Curva de calibración de los datos representados en la tabla 2.

CURVA DE CALIBRACIÓN
0,8
0,7
0,6
ABSORBANCIA

0,5
y = 0,042x + 0,0055
0,4
R² = 0,9898
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20
CONCENTRACIÓN

Conclusiones

A partir de los resultados obtenidos se obtuvo una curva de calibrado con no linealidad en todos sus
puntos, específicamente en las concentraciones de 7,0 y de 10,5 µg/ml, lo cual significa que sí hubo
desviaciones en la ley de Lambert-Beer empleada. Además, el coeficiente de correlación lineal
obtenido fue menor a 0,99 lo cual tampoco indica una buena linealidad.

En conclusión, estas desviaciones se pudieron deber principalmente a errores en el pipeteo durante la

preparación de las diluciones de cromato de potasio o en el manejo del Espectrofotómetro GENESYS
10.

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Recomendaciones

 Preparar cuidadosamente las soluciones patrón utilizando material volumétrico calibrado para
garantizar concentraciones exactas y evitar errores sistemáticos que puedan afectar la
linealidad de la curva de calibración.

 Limpiar cuidadosamente las celdas de cuarzo o vidrio con agua destilada y luego con el solvente
de la muestra antes de cada medición. Secar con papel libre de pelusas para evitar
interferencias por gotas o residuos.

 Manipular las celdas por la parte rugosa o esmerilada, evitando tocar las caras ópticas con los
dedos, ya que las huellas dactilares pueden causar errores en la absorbancia.

 No abrir la tapa del compartimiento del espectrofotómetro durante la medición, ya que la

entrada de luz externa puede alterar los resultados.

 Colocar siempre la celda en la orientación correcta dentro del portaceldas, alineando la

dirección del paso de luz con el camino óptico designado por el fabricante.

Bibliografía

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de-beer-lambert/

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