Cromatografía líquida de alta
performance (HPLC)
Modos Cromatograficos
1. reparto líquido-líquido
2. adsorción líquido-sólido
3. intercambio iónico
4. exclusión molecular
5. afinidad
6. quiral
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Recipiente de la fase móvil y sistemas
de tratamiento de disolventes
Fase móvil
- Recipiente de vidrio 0,5-1 L
- Filtrado
- Accesorios para eliminar partículas en suspensión y gases
disueltos (producen burbujas en la columna, desestabilizan la
línea de base, ensanchan los picos e interfieren en el detector)
- Los desgasificadores pueden consistir en un sistema de
bomba de vacio, un dispositivo para agitación y un sistema de
burbujeo de un gas inerte que es insoluble en la fase móvi
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Modo de Elución
Elución isocrática
- Único solvente o una mezcla de disolventes de
composición constante
Elución en gradiente
- Se usan dos o más disolventes que difieren en la
polaridad. Las proporciones pueden ser continuas o
escalonadas, mejora la eficiencia de la separación
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Sistema de bombeo
Requisitos de la bomba
- Capacidad para generar presiones de hasta 6000 psi ( 400 atm, 1 atm
= 14,69 psi)
- Salida libre de pulsos
- Velocidad de flujo de 0,1-10 mL/min
- Reproducibilidad relativa de los flujos <0,5 %
- Resistencia a la corrosión por diversos solventes
Tipo de bombas utilizadas en HPLC
- Con pistón oscilantes: cámara cilíndrica que se llena y vacía con el movimiento
oscilante del pistón. Produce un flujo pulsado que debe atenuarse. Volumen interno
pequeño, presión de salida alta (hasta 10000 psi), fácil elución de
gradientes y velocidad de flujo constante
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Bomba de pistón oscilante
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Sistema de inyección de muestras
Bucle (loop) de muestra
- alta reproducibilidad (5-500 L)
- muestreadores automáticos
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Columnas para HPLC
- Tubos de acero inoxidable, 2-5 mm x 10-30 cm
- Empaquetamiento: partículas 3-10 m (40000-60000 platos/m)
- Partículas de sílice de diámetro uniforme, pueden recubrirse con películas
orgánicas finas, que se enlazan química o físicamente con la superficie. Otros
materiales de empaquetamiento: alúmina, polímeros porosos o resinas de
intercambio iónico
Precolumnas
- Extrae partículas y contaminantes de los disolventes
- Prolonga la vida útil de la columna
- Empaquetamiento similar al de la columna
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Sistemas de detección
- Volumen muerto chico (20% Vp) para minimizar el ensanchamiento de las
bandas
- Compatible con el flujo de líquido
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Detector de absorción UV-visible
- Espectrofotómetros de fijas
- Espectrofotómetros con detector de diodo espectro completo
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Detector de arreglo de diodos
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Detector de fluorescencia
- La fluorescencia se determina por medio de un detector fotoeléctrico colocado
perpendicularmente respecto al haz de excitación
- Fuente de xenón y filtros para aislar la radiación emitida
- Ventajas: alta sensibilidad
- Detecta únicamente especies fluorescentes
- Las especies no fluorescentes pueden tratarse con reactivos para formar derivados
fluorescentes
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Detector de índice de refracción
- El disolvente en su camino hacia la columna pasa a través de
una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la
otra. Los compartimentos están separados por una placa de
vidrio en ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en el
índice de refracción se produce una desviación del haz incidente.
El desplazamiento en la superficie fotosensible del detector
provoca una variación de la señal de salida
- Ventaja: responde a la mayoría de los solutos (detector
universal)
- Desventajas: no son muy sensibles y dependen de los cambios
en la temperatura
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