AZUCARES REDUCTORES TOTALES (ATR) POR MÉTODO DE DNS

Echavarría Flórez Faleidy1, Mausa Sánchez Leyder1, Meza Guzmán Juan Albrin1*, Ortiz
Fuentes Andrea Stefania1
Autor para la correspondencia, 1*: [email protected]
Microbiología Industrial - Ingeniería Agroindustrial1 - Universidad de Antioquia
Carepa – Colombia
25 de octubre del 2024

RESUMEN
El tema de la investigación se centra en la cuantificación de azúcares reductores,
específicamente glucosa, mediante el método de DNS en un laboratorio. Este procedimiento es
esencial para determinar de manera precisa la cantidad de azúcares reductores presentes en
distintas muestras, lo cual es relevante en aplicaciones agroindustriales y biotecnológicas. La
investigación pretende establecer la concentración de azúcares reductores en diferentes
soluciones utilizando el reactivo DNS, analizando la relación entre la concentración de glucosa y
su absorbancia medida espectrofotométricamente. Se utilizaron técnicas de preparación de
soluciones estándar y reactivas, así como el uso de un espectrofotómetro a 540 nm. Las muestras
fueron tratadas con el reactivo DNS y sometidas a un baño termostático para favorecer la
reacción. Posteriormente, se midió la absorbancia de cada muestra para construir una curva de
calibración de glucosa en función de su concentración. Los resultados mostraron que existe una
relación lineal entre la concentración de glucosa y la absorbancia hasta un límite de
aproximadamente 0.35 g/L, después del cual se observan desviaciones. La ecuación de la línea
de tendencia obtenida fue y=1.4132x−0.0926 con un R2=0.8764, lo cual sugiere una buena
correlación dentro de este rango.
Palabras clave: xxxx, xxxx, xxx
ABSTRACT
The research topic focuses on the quantification of reducing sugars, specifically glucose,
by the DNS method in a laboratory. This procedure is essential to accurately determine the
amount of reducing sugars present in different samples, which is relevant in agro-industrial and
biotechnological applications. The research aims to establish the concentration of reducing
sugars in different solutions using the DNS reagent by analyzing the relationship between the
glucose concentration and its absorbance measured spectrophotometrically. Standard and reagent
solution preparation techniques were used, as well as the use of a spectrophotometer at 540 nm.
The samples were treated with DNS reagent and subjected to a thermostatic bath to favor the
reaction. Subsequently, the absorbance of each sample was measured to construct a glucose
calibration curve as a function of its concentration. The results showed that there is a linear
relationship between glucose concentration and absorbance up to a limit of approximately 0.35
g/L, after which deviations are observed. The trend line equation obtained was y=1.4132x-
0.0926 with an R2=0.8764, suggesting a good correlation within this range.
PALABRAS CLAVES
Curva de calibración, DNS, espectrofotómetro, glucosa.
INTRODUCCION
Los azucares reductores son moléculas capaces de donar electrones y, por lo tanto,
reducir otras moléculas. Berg, J. M. et, al. (2015). La glucosa hace parte de estos denominados
azucares reductores, siendo la misma, un monosacárido y la principal fuente de energía de los
organismos vivos. Es un carbohidrato simple que juega un papel fundamental en el metabolismo
celular, especialmente en procesos como la glucólisis y el ciclo de Krebs, donde se descompone
para liberar energía en forma de ATP, esencial para el funcionamiento celular y, particularmente,
para el cerebro y el sistema nervioso. Ferrer et al., (2022).
Ahora bien, la importancia de conocer e identificar la metodología de DNS para
determinar los azucares reductores, se evidencia principalmente en la cuantificación precisa de
estos azúcares, ya que en diferentes investigaciones y estudios científicos se muestran resultados
con éxito, estudios como el realizado por Gonçalves et al., (2010) demuestran lo anterior,
siguiendo este razonamiento, la importancia de este método también se observa en la aplicación
de este en estudios de fermentación y producción de bioetanol como el realizado por Domínguez
et al., (2011), además, cabe resaltar la importancia en la educación y aprendizaje de técnicas
analíticas, donde se aprende el uso del espectrofotómetro, la importancia de replicar y validar los
experimentos para realizar comparaciones entre los datos obtenidos.
Por lo tanto, en el presente informe se busca determinar la concentración de azucares
reductores por el método espectrofotométrico del DNS haciendo uso de las diferentes
herramientas y prácticas de laboratorio para desarrollar una buena preparación de las diferentes
soluciones de trabajo y así mismo evitar la contaminación del espacio de trabajo, además, al
finalizar se realiza una pequeña discusión y conclusión sobre los resultados obtenidos y a su vez
se indican diferentes recomendaciones para que aquellos que deseen realizar este mismo
procedimiento puedan realizarlo con mayor eficacia.
OBJETIVOS
OBJETIVOS GENERALES
 Determinar la concentración de azucares reductores por el método espectrofotométrico
del DNS.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Preparar las soluciones de trabajo y los reactivos necesarios para la determinación de
azucares reductores.
  Estandarizar la curva de calibración espectrofotométrica a partir de soluciones patrón de
glucosa.
 Aplicar el reactivo DNS a diferentes muestras para evaluar su contenido de azucares
reductores.

MATERIALES
Equipos  Gradillas
 Balones volumétricos 25 ml
 Micropipeta de 500µL
 Guantes
 Micropipeta de 100µL
 Puntas Reactivos
 Baño termostático
 Vórtex  Glucosa
 Espectrofotómetro  Ácido dinitro salicílico DNS
 Baño de hielo  NaOH
 Tubos de ensayo  Tartrato de sodio y potasio

 Agua destilada

MÉTODOS
Para la preparación de la solución y de la curva estándar se siguió el mismo
procedimiento planteado por Bello et al., (2006) y Burgos (2019), pero con leves modificaciones.
Preparación de la solución de DNS
Todo este procedimiento se muestra en la figura 1 que representa el flujo de este proceso.
En primer lugar, aquella persona que realizo esta la solución de DNS se preparó con
guantes, tapabocas y bata anti fluidos.
Después, se preparó una solución de NaOH al 2N en Erlenmeyer de 250 mL con
agitación; para esto se pesó 4 g de NaOH en perlas y se diluyo en 10 mL de agua destilada.
Luego, a esta solución se le adiciono 75 g de tartrato de sodio y potasio y se completó el
volumen hasta 250 mL usando agua destilada; posteriormente, se dejó en agitación hasta que la
solución quede completamente soluble, esta solución se envaso en un recipiente ámbar de 500
mL.
Por último, se adiciono 2.5 g de DNS pesado en un recipiente con tapa y así, se evitó la
contaminación del lugar de trabajo. Posteriormente, se completó el volumen con agua destilada
hasta 50 mL y se dejó la solución en digestión por 24 h, con agitación y se tapó el recipiente sin
cerrarlo completamente.
 Fig. 1. Procedimiento para la preparación de la solución de DNS.
Preparación de curva estándar
Todo este procedimiento se muestra en la figura 2 que representa el flujo de este proceso.
Se peso 0.1 g de glucosa y se llevó a un volumen final de 50 mL para tener una solución
de 2 g/L, luego, se tomó una alícuota de 5 mL y se llevó a 25 mL para tener una solución de 0.4
g/L. En consecuencia, con esta última solución se preparó las diluciones mostradas en la tabla 1,
donde se utilizaron las micropipetas de 1000 y 100 μL para la medición de estos volúmenes.
Tabla 1. Diluciones a las cuales se les adiciono el DNS.

Solución Glucosa (g/L) Vsln madre (mL) VH2O destilada

(mL)
Blanco 0 0 0.500
1 0.04 0.050 0.450
2 0.08 0.100 0.400
3 0.12 0.150 0.350
4 0.16 0.200 0.300
5 0.20 0.250 0.250
6 0.24 0.300 0.200
7 0.28 0.350 0.150
8 0.32 0.400 0.100
9 0.36 0.450 0.050
 10 0.40 0.500 0

Luego, se tomaron estas diluciones ya preparadas y se les adiciono a cada una 500 μL de
solución de DNS incluyendo el blanco, se tapó cada tubo con papel vinipel para evitar la pérdida
de la muestra por evaporación. Y para este caso, se guardaron los tubos en un lugar oscuro para
evitar que el DNS comience a reaccionar.
Posteriormente, se llevaron los tubos con las soluciones al baño temostátco a
Temperatura de ebullición durante 5 min. Luego, de que pasaron los 5 min exactos de
calentamiento se llevó la solución a un baño de hielo hasta que se dispuso del momento de hacer
la curva de calibración para DNS.
Por último, se leyó la absorbancia de todas las soluciones a 540 nm y se realizó una curva
de concentración de glucosa en g/L versus absorbancia a lo cual se le aplico un ajuste lineal de
los datos (figura 3).

Fig. 2. Procedimiento para la preparación de la solución de DNS.

DATOS, CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION
 Fig.3. Tonalidades de amarillo-rojo con respecto a la concentración de glucosa.

Tabla 2. Datos obtenidos del Espectrofotómetro.

Soluciones Glucosa g/L Absorbancia

0 0 0
1 0,04 0,005
2 0,08 0,021
3 0,12 0,048
4 0,16 0,086
5 0,2 0,129
6 0,24 0,157
7 0,28 0,252
8 0,32 0,308
9 0,36 0,522
10 0,4 0,562
 Absorbancia VS concentración
0.6

0.5
f(x)==0.876411492320651
R² 1.41318181818182 x − 0.0926363636363637
0.4
Absorbancia

0.3

0.2

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
Concentración (g/L)

Fig.4. Curva de absorbancia VS concentración de glucosa en g/L.

Formula de línea de tendencia
y=mx+b

 Donde Y: es la absorbancia medida en el espectrofotómetro.

 m: Es la pendiente de la línea. Indica cuánto cambia el valor de Y por cada incremento
unitario en x (es decir, la relación entre cambios en absorbancia y cambios en
concentración). La pendiente está relacionada directamente con la sensibilidad de la
curva de calibración.
 x: Es el valor de la variable independiente (en este caso, la concentración de glucosa o del
azúcar reductor en la muestra).
 b: Es el intercepto en el eje Y. Representa el valor de Y cuando x= 0 y permite ajustar la
curva al eje Y, tomando en cuenta factores que puedan afectar la absorbancia cuando no
hay azúcar en la muestra.
 De la figura 4. La curva se realizó en Excel y nos arroja la ecuación:
y=1,4132 x−0,0926 , donde y es la abs y si despejamos x, se obtendría la concentración
de la muestra.
 Se obtuvo un R2= 0,8764, por lo que, no está del todo bien, porque si se obtiene un
coeficiente cercano a 1, hay relación entre las variables (Segovia Ortega, J. A. 2016).
 De la figura 3. Se puede evidenciar las diferentes tonalidades de color, que están
relacionadas con la concentración de glucosa en cada muestra, a medida que aumenta su
color rojo, indica que hay gran presencia de glucosa
CONCLUSIONES
El estudio sobre la cuantificación de azucares reductores por método se (DNS) mostró
relación entre la absorbancia y la concentración de glucosa en el conjunto de muestras tomadas.
La línea de tendencia de la gráfica sigue la ecuación y=1.4132x−0.0926 con un coeficiente de
determinación R2=0.8764. Esta ecuación lineal sugiere que la relación entre la concentración de
glucosa y la absorbancia es casi lineal, aunque no completamente perfecta, ya que el R 2 está
ligeramente por debajo de 1. Esto indica que hay una correlación considerable, pero no exacta,
entre las variables. La gráfica mostró que el método de determinación de glucosa es efectivo en
un rango de concentración hasta aproximadamente 0.35 g/L, donde la relación es lineal y
predecible. Sin embargo, en concentraciones más altas, el método presenta desviaciones, lo que
sugiere que el rango lineal de este método es limitado.
Para futuras investigaciones, sería útil explorar maneras de mejorar esta metodología,
como diluir las muestras más concentradas para mantener la linealidad y precisión en los
resultados. Además, sería interesante probar la eficacia del método DNS en la cuantificación de
otros azúcares reductores y en diferentes tipos de muestras, como alimentos y soluciones de
fermentación, ampliando así el alcance y la utilidad del método en distintos contextos de
laboratorio y aplicaciones industriales.
Estos estudios podrían ayudar a optimizar el uso de este método en prácticas analíticas
comunes, beneficiando tanto a la industria agroalimentaria como a proyectos de investigación
biotecnológica, donde la cuantificación precisa de azúcares reductores es un paso esencial.
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar un buen uso de las herramientas de laboratorio como las
micropipetas, ya que por medio de las extracciones de los reactivos para realizar las diferentes
soluciones como en el caso de la Tabla 1, se pueden presentar muchos errores debido a la mala
practicidad de estos implementos.
Otra recomendación se presenta en la ejecución del proceso, sobre todo en la
concentración que se debe tener para realizar una buena medida y control de las variables como
la cantidad de reactivos, tiempo de espera y demás, ya que por medio de esto también se puede
presentar diferentes errores que contribuyen a malos resultados.

PREGUNTAS
1. ¿Qué son los azúcares reductores?

R: Los azúcares reductores son aquellos que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional)
intacto entre estos tenemos glucosa, lactosa, fructosa, maltosa, galactosa, y que a través
de este pueden reaccionar con otras moléculas. Se llaman azúcares reductores
 porque poseen la capacidad de reducir otros compuestos gracias a la alta
reactividad del doble enlace del oxígeno (Moreano Pilatasig, 2015).

2. Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa

(Elabore un cuadro). ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología?

Tabla 3. Métodos de determinación de azúcares reductores

Métodos Ventajas Desventajas

Polarimetría  Sin uso de reactivos  Menor precisión
 Rápido y sencillo  Necesita grandes
cantidades de
muestra
HPLC (Cromatografía  Brinda mayor  Requiere personal
líquida de alta resolución) exactitud y precisión muy capacitado
 Permite la  Muy costoso
separación de varios
azucares en una
muestra

Método de Fehling  Económico  No brinda exactitud

 Simple de realizar  Brinza una
 No necesita un aproximación
equipo avanzado  Interfiere con otros
 Cualitativo compuestos
 Cuantitativo reductores
Método de Somogyi-Nelson  Proporciona  Requiere muchos
resultados precisos pasos
 Alta sensibilidad  Requiere reactivos
tóxicos
 Puede interferir con
otros compuestos

3. ¿Cuál es el principio del método de DNS para la determinación de azúcares reductores?

R: El ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) en presencia de calor reduce el ácido 3-amino-5

nitrosalicílico por los azúcares reductores presentes, desarrollándose un color amarillo
café el cual es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 540nm. Este método
permite medir las unidades reductoras presentes en los azúcares. A través de la ley de
 Beer-Lambert, se puede correlacionar la absorbancia con la concentración de los azúcares
reductores, permitiendo una cuantificación precisa. (Chico León, H. G., & Sandoval
Rojas. 2015)

4. ¿Por qué se utiliza el reactivo de DNS para cuantificar los azúcares reductores?

R: Se utiliza el reactivo DNS porque cuando este se calienta junto con azúcares
reductores como la glucosa, fructuosa y galactosa, reduce el DNS al ácido 3-amino,5-
nitro-salicílico. El producto resultante tiene un color naranja-rojo, esta coloración es
proporcional a la cantidad de azúcares que contenga la solución (Suárez Rumiche,
Castillo Valdiviezo, & Souza Najar. 2021)

5. ¿Qué tipo de reacción ocurre entre el DNS y los azúcares reductores? ¿Qué sucede
químicamente en la reacción que permite medir la concentración de azúcares a través de
la absorbancia?

R: Es una técnica colorimétrica que emplea un procedimiento que se basa en una

reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra,
El método se basa principalmente en la reducción del DNS (de color amarillo) por la
glucosa u otro azúcar reductor, ya que estos contienen grupos aldehído o cetona libres
que tienen la capacidad de actuar como agentes reductores y la capacidad de donar
electrones gracias a su grupo carbonilo libre, por lo que, el DNS reacciona con los
electrones donados por los azúcares, transformándose en su forma reducida, el ácido 3-
amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). (Diaz.Y. 2020)

Fig.5. Conversión de los azucares reductores mediante DNS. (MILLER, G. (1959)).

6. ¿Qué otros azúcares pueden reaccionar con el DNS? ¿Sería posible usar otro azúcar como
estándar?
 R: De acuerdo con Saqib y Whitney, (2011) se pueden usar azucares como la fructosa,
galactosa, celobiosa, lactosa y maltosa para reaccionar con el DNS. Y sí, es posible usar
otro azúcar como estándar, ya que en ese mismo artículo se da la recomendación de
establecer una curva estándar de acuerdo con el tipo de azúcar que se utiliza para
reaccionar con el DNS.

7. ¿Por qué no realizaron réplicas en la medición de la absorbancia de los azúcares?

R: En primer lugar, debemos de tener en cuenta las diferentes variables como el tiempo y
las condiciones de laboratorio por aglomeración (densidad de personas en ese espacio),
las cuales fueron muy limitados durante la práctica, ahora bien, en un estudio más
profundo en el cual se tenga que realizar una lectura más cautelosa de estos datos, sí es
necesario hacer una réplica, la cual de acuerdo con Gonçalves et al., (2010) ayuda a
identificar variabilidad experimental y reducir el margen de error en los datos, por lo
tanto, es importante hacer réplicas, pero por diferentes circunstancias no se pudo realizar
correctamente esta parte de la metodología, además, no se presentaba en el documento
compartido por la docente, la necesidad de hacer esta parte.

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industrial y agrícola de Tucumán, 97(2), 1-4.
Orde Item Valor
n
3 Resumen (Español e Inglés) 0,25
5 Introducción 0,5
6 Objetivos (General / Específicos) 0,5
7 Materiales y Método(s). 0,45
8 Datos, Cálculos, resultados y discusión 1,4
9 Conclusiones 1,0
10 Recomendaciones 0,2
11 Respuesta a preguntas de la guía de 0,3
laboratorio
12 Referencias bibliográficas o 0,2
bibliografía