Tinción de Gram
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Tinción de gramo Debido a que las bacterias y otros microorganismos tienen un tamaño
pequeño, se requiere de tinciones biológicas para visualizarlos, demostrar detalles de su
estructura interna o de algunas funciones fisiológicas. En este video se presenta la tinción de
gramo, la cual permite identificar la morfología celular bacteriana y es útil para diferenciar
bacterias gram-positivas de las bacterias gram-negativas. Esta diferenciación se fundamenta
principalmente en la composición de la pared que se muestra a continuación.
Las principales características en la pared para que las bacterias gram-negativas no se tiñan
con el cristal violeta son como se observa en la imagen. Tienen una pequeña proporción de
péptido glicano comparado con las gram-positivas y adicionalmente presentan una capa de
lipopolisacáridos en su membrana externa. Todo esto impide que las bacterias gram-
negativas adquieran la coloración.
Paso 1 Verificación de materiales y reactivos Verificar que todos los materiales reactivos y
equipos estén disponibles en el laboratorio Esto incluye, entre otros, el cultivo bacteriano
para ser analizado, portaobjetos, pinzas, asa bacteriológica, temporizador, puente de
coloración, solución salina, cristal violeta, Lugol, alcohol acetona, safranina, agua destilada,
mechero y marcador. Paso 2 Montaje del cultivo bacteriológico Encender el mechero, tener
precaución con la manipulación para evitar quemaduras, en una lámina portaobjetos
debidamente identificada, colocar una pequeña gota de solución salina, luego tomar el asa
bacteriológica y flamear la asa incandescencia, dejar enfriar y tomar una pequeña porción
de una colonia bacteriana, mezclarla bien con la gota de solución salina del portaobjetos
hasta obtener una solución homogénea, flamear el asa hasta incandescencia para eliminar
el contenido bacteriano, con una pinza metálica flamear el portaobjetos cuidadosamente
hasta que la solución salina se evapore y se fijen las bacterias al vidrio. Paso 3 Aplicación de
los colorantes Colocar el portaobjetos al puente de coloración, cubrir generosamente con
cristal violeta la superficie del portaobjetos correspondiente a las bacterias, incubar por un
minuto.
El cristal violeta ingresa en la pared bacteriana de todas las células bacterianas, tanto en
gram positivas como gram negativas, lavar con abundante agua destilada y eliminar el
exceso de agua, luego agregar generosamente Lugol, incubar por un minuto. El Lugol actúa
como mordiente, facilitando que el cristal violeta se fije a la pared bacteriana, lavar con
abundante agua destilada y eliminar el exceso de agua, decolorar con alcohol acetona.
Incubar por 30 segundos, lavar con abundante agua destilada y eliminar el exceso de agua.
Sólo las bacterias gram negativas se decoloran, mientras que las bacterias gram positivas no
lo hacen debido a la composición de su pared. Agregar generosamente la safranina, incubar
por un minuto, lavar con abundante agua destilada y eliminar el exceso de agua. La
safranina se usa como colorante de contraste para poder visualizar de color rojo o rosado
las bacterias gram negativas, las cuales fueron decoloradas en el paso anterior con alcohol
acetona.
Lavar con abundante agua destilada y eliminar el exceso de agua. Dejar secar al ambiente o
secar cuidadosamente con un papel absorbente. En la siguiente imagen se resume el
proceso.
Paso 4. Lectura e interpretación en el microscopio. La lectura se hace en un microscopio de
luz clara. El portaobjetos se ubica correctamente en la platina del microscopio y se enfoca la
muestra en el objetivo de menor aumento, haciendo uso del macro y el micrométrico.
Finalmente se hace la lectura con el objetivo de 100x, aplicando una pequeña gota de aceite
de inmersión. Se debe recorrer toda la muestra identificando y anotando la morfología, el
tipo de agrupación bacteriana y describiendo tipo de tensión, es decir, si el cultivo
corresponde a células bacterianas gram positivas o gram negativas. Una vez se finaliza la
lectura, el portaobjetos se debe eliminar en el guardián.
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