Diplomado en Técnicas Bioquímicas Aplicadas a la Industria

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

CENTRO UNIVERSITARIO DE LOS LAGOS

Diplomado en Técnicas Bioquímicas Aplicadas a la Industria

Módulo: Fundamentos de western bolt e inmunohistoquímica

PRACTICA 1

Profesora: Maribel Huerta Cervantes

Alumno: Jáuregui Martínez Ana Isabel

Módulo: Fundamentos de western bolt e inmunohistoquímica

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INTRODUCCIÓN

El Western blot es una técnica utilizada para separar, detectar e identificar proteínas en
una muestra biológica. Fue nombrada así por el Dr. Burnette en 1981, como un juego de
palabras con las técnicas previamente desarrolladas: el Southern blot (para ADN) y el
Northern blot (para ARN). Esta metodología es ampliamente utilizada en biología
molecular y proteómica por su precisión y especificidad.
El proceso comienza con la extracción de proteínas utilizando tampones de lisis celular,
acompañados de inhibidores de proteasas y fosfatasas. Posteriormente, se mezclan con
el tampón Laemmli, que contiene SDS y agentes reductores. Esto permite que todas las
proteínas adquieran una carga negativa uniforme, lo que facilita su posterior separación
por tamaño.
La separación de proteínas se realiza mediante SDS-PAGE, una electroforesis en gel de
poliacrilamida que separa las proteínas según su peso molecular. En este sistema, las
proteínas más pequeñas migran más rápido que las más grandes. Se emplean dos tipos
de gel: uno concentrador, que agrupa las proteínas en una banda, y otro separador, que
permite diferenciarlas por tamaño.
Una vez separadas, las proteínas se transfieren del gel a una membrana (de
nitrocelulosa o PVDF) por medio de transferencia electroforética. Las membranas PVDF
son preferidas por su mayor capacidad de unión a proteínas y resistencia química.
Luego se realiza el sondeo con anticuerpos. Primero se bloquea la membrana con
proteínas como leche en polvo o BSA para evitar uniones inespecíficas. Después, se
aplica un anticuerpo primario, que reconoce específicamente la proteína de interés,
seguido de un anticuerpo secundario conjugado con una enzima o marcador. La
detección suele hacerse por quimioluminiscencia, visualizando las proteínas como
bandas en la membrana.
Dado que el Western blot implica varios pasos críticos, es fundamental mantener un
control de calidad riguroso en cada etapa para garantizar resultados fiables y
reproducibles.

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PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS:

Determinación de proteína por método lowry

Se coloco 6 tubos con distintas concentraciones de proteína estándar (BSA), cada

concentración se realizó por triplicado como se muestra en la siguiente tabla:

Aparte de los 18 tubos anteriores se colocaron 3 tubos más

con muestra problema y se aplicó el mismo procedimiento
que a los otros tubos:

• Se agrego las sustancias de izquierda a derecha hasta

la solución C.
• Se centrifugo cada tubo y se dejó incubar por 10 min.
• Posteriormente se agregó la solución D a todos los
tubos y se centrifugo nuevamente.
• Para finalizar se dejó incubar por 30 min en total
oscuridad.
• Una vez finalizado los 30 minutos se llevó al

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espectrómetro donde se comenzó analizando la

muestra “blanco” y se prosiguió a medir los demás.
• El fin de analizarlos en el espectrómetro es
encontrar la absorbancia.

Al finalizar de analizar los tubos nos dio los siguientes datos:

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Una vez obtenidos los resultados se sacó un promedio por muestra, como se observa en
la tabla anterior.

Con los resultados obtenidos se realizó un gráfico como el siguiente:

CONCENTRACION VS ABSORBANCIA
120

y = 206.64x - 4.9251
100 R² = 0.988

80

60

40

20

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-20

Como se puede observar en la grafica los resultados fueron óptimos ya que nuestra R²
esta muy cerca a 1, lo cual indica la variabilidad de los datos.

Gracias a estos datos podemos calcular nuestra pendiente de la gráfica, esto nos
arrojaría la cantidad de proteína en 10l de muestra.

El cálculo de nuestra tendencia en la curva graficada daría la cantidad total de proteínas

en 10l, en nuestro caso el resultado fue 139.3781209 g.

Usando la regla de 3 podemos determinar cuántos microlitros requerimos para que

nuestra muestra de proteína en cada pozo de gel sea de 60g.

139.37g 10l
60g x l

Dando como resultado 4.30 l de muestra para tener 60g de proteína en nuestros
pozos.

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Anexo de captura de pantalla.

ELECTROFORECIS

A continuación, se muestra una tabla para realizar los geles:

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• Antes de tener preparada la solución del gel se dejó preparada

la caja o barrera.

• La preparación se siguió como lo indica la tabla anterior.

• Una vez teniendo la solución lista llenamos la caja o barrera tres

cuartas partes y lo que resta de isopropanol para evitar la
entrada de aire y permitir la polimerización al igual que ponemos
el peine para que queden los pozos donde ira nuestra muestra.
• Se dejo reposar alrededor de 5 minutos.
• Una vez listo se retira el peine con mucho cuidado y se hace
un enjuague con agua destilada y una jeringa para quitar
exceso de agua y burbujas.
• Ya que se tiene el gel listo se prepara la electroforesis con hielo
y el buffer, asegurándose que el buffer sea el suficiente.
• Se colocará en el primer pozo buffer de Laemmli. Es
importante mantener un ángulo inclinado en la micropipeta, de
tal manera que la punta toque el vidrio de la placa, indicando
que es el punto para dispensar la muestra.
• Colocamos cada una de las muestras en los pozos
correspondientes, nuestra muestra fue de cerebro.
• Se dejo correr 2 horas la electroforesis, en los cuales primero
fueron 20 minutos a 50V y lo restante a 100V.

• Una vez terminado

los geles se lavaron con agua destilada.
• Se despegaron de los vidrios y se colocaron en colorante por 5 minutos en
constante agitación.

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Todo lo que se reporta a continuación fue buscado en bibliografía ya que por cuestiones
de tiempo no se alcanzo a realizar.

Tras finalizar la electroforesis, las proteínas separadas en el gel se transfieren a una

membrana de nitrocelulosa o PVDF mediante un sistema de electrotransferencia,
utilizando un tampón de transferencia y una corriente eléctrica constante. Este paso
permite que las proteínas se adhieran a un soporte sólido para su posterior detección.
Una vez realizada la transferencia, se bloquean los sitios libres de la membrana para
evitar uniones inespecíficas del anticuerpo. Esto se logra incubando la membrana con
una solución bloqueadora, como BSA al 5%, leche descremada al 5% o suero normal,
disueltos en PBS-T o TBS-T, durante 1 hora a temperatura ambiente o durante toda la
noche a 4 °C.

Después del bloqueo, se realiza la incubación con el anticuerpo primario, el cual

reconoce específicamente a la proteína diana. La membrana se incuba con este
anticuerpo diluido en solución bloqueadora, generalmente durante 1 a 2 horas a
temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C. Luego, se hacen lavados con PBS-T para
eliminar el exceso de anticuerpo no unido.

Posteriormente, se aplica el anticuerpo secundario, el cual está conjugado con una

enzima como HRP (peroxidasa de rábano picante) o fosfatasa alcalina. Este anticuerpo
se une al anticuerpo primario y permite la detección enzimática de la proteína.

Para la revelación, se utiliza un sustrato compatible con la enzima del anticuerpo

secundario. En el caso de HRP, se utiliza un sustrato quimioluminiscente (como ECL),
que emite luz cuando es catalizado por la enzima. La señal se detecta mediante
exposición a una película de rayos X o a un sistema digital de captura de imágenes.

DETERMINAR LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA CON AYUDA DEL SOFTWARE

IMAGEJ

Por cuestión de tiempo no se alcanzo a terminar todo el procedimiento, por lo que se nos
anexo fotografías del gel para analizar errores y algunas fotografías para usar el sotware
de Imagej.

El gel muestra bandas poco definidas y

un fondo muy teñido, lo que sugiere una
carga incorrecta de muestra, mala
preparación del gel o problemas con la
electroforesis, como corriente excesiva.
También pudo haber fallas en el lavado
tras la tinción o en la preparación del
tampón.

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Este gel muestra bandas tenues y

mal definidas, lo que sugiere una
baja concentración de proteína o
una carga deficiente. También se
nota irregularidad entre carriles,
posiblemente por mala
distribución de muestra o
problemas en la corrida.

MEMBRANA CON DBA

MEMBRANA 1

MEMBRANA 2

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MEMBRANA 2

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MEMBRANA 3

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MEMBRANA 4

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CONCLUSIÓN

Aunque no se pudo completar todo el procedimiento por falta de tiempo, esta práctica
ayudó a entender mejor cómo funciona la técnica de Western blot y todos los pasos que
implica, desde medir proteínas con el método Lowry hasta separarlas, transferirlas y
detectarlas. Al revisar las imágenes, fue posible identificar errores como mala carga de
muestra o problemas en la corrida del gel, lo cual nos enseñó la importancia de hacer
cada paso con cuidado. En general, fue una experiencia útil para familiarizarnos con una
técnica muy importante en el análisis de proteínas.

BIBLIOGRAFIA:
Abcam. (n.d.). Western blot protocol. Abcam. Recuperado el 22 de junio de 2025, de
[Link]

Bio-Rad Laboratories. (n.d.). Western Blotting Guide. Bio-Rad. Recuperado el 22 de junio

de 2025, de [Link]

Thermo Fisher Scientific. (n.d.). Western blotting handbook. Recuperado el 22 de junio

de 2025, de [Link]
reference-library/handbooks/handbooks-western-blotting/[Link]

Mahmood, T., & Yang, P.-C. (2012). Western blot: technique, theory, and trouble
shooting. North American Journal of Medical Sciences, 4(9), 429–434.
[Link]

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Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot. [Actualizado el 14 de abril de

2023]. En: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls
Publishing; enero de 2025.

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