ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE (UV-VIS) Y LEY DE BEER-
LAMBERT.
La espectroscopia ultravioleta-visible (uv-vis) es una técnica analítica fundamental
en el estudio de la interacción entre la luz y la materia(Garcia,2012). abordando la
región del espectro electromagnético entre los 200 y 800 nanómetros, esta técnica
proporciona una ventana única para explorar la absorción y reflexión de la luz por
compuestos químicos(Harris,2010). Tal interacción revela información detallada
sobre la estructura molecular y concentración de las sustancias bajo estudio,
convirtiéndose en una herramienta indispensable en disciplinas como la química,
bioquímica y ciencias ambientales para la caracterización y el análisis cuantitativo
de diversos compuestos(Pavia,2014).
Los métodos analíticos se fundamentan en la interacción entre la energía radiante
y la materia, un fenómeno evidente en la radiación electromagnética, donde se
destacan las radiaciones visibles que ocupan una pequeña fracción del espectro
electromagnético(Skoog,2014). además, otras formas de ondas electromagnéticas
como las infrarrojas, rayos x y ondas de radio también se clasifican en esta
categoría. cada tipo de radiación posee una cantidad específica de energía, lo que
resulta crucial en la selección del equipo adecuado para el análisis.
El fenómeno de absorción de radiación electromagnética (rem) se presenta cuando
un haz de luz de una determinada longitud de onda atraviesa una disolución que
contiene una sustancia que absorbe a esa longitud de onda(Knowlton,2001). El
análisis de este proceso de absorción proporciona información muy valiosa, tanto
de la naturaleza como de la cantidad de la sustancia presente en la disolución. Este
fenómeno está regulado por la siguiente expresión que se conoce con el nombre de
la ley de beer:
A = εbc
Dónde: A = absorbancia
ε = coeficiente de extinción molar [(mol/L)-1cm-1]
b = longitud de la celda (cm)
c = concentración (mol/L)
Para aplicar la ley de Beer es necesario seleccionar la longitud de onda óptima y
por esta razón se determina el espectro de absorción (representación de la
absorbancia o porcentaje de transmitancia en función de la longitud de onda
manteniendo c y b constantes) (Harris,2010). Para el análisis cuantitativo se escoge
una longitud de onda a la cual el soluto a analizar absorbe fuertemente(Litter,2009).
En una mezcla, las longitudes de onda seleccionadas son aquellas a las que los dos
espectros difieren significativamente.
En el contexto de la espectroscopia UV-Vis, el equipo empleado se basa
principalmente en la generación y detección de radiación ultravioleta(Osorio,2010).
Este sistema utiliza una celda donde se coloca la muestra a analizar, permitiendo la
observación de la longitud de onda y absorción de la luz incidente(Meza,2007). Este
principio se sustenta en la capacidad de las moléculas para absorber energía
radiante, proporcionando una medida directa de la cantidad de luz absorbida, la cual
guarda una relación lineal con la concentración de la muestra(Camargo,2017). Por
otra parte, el monocromador se erige como un componente esencial en el sistema
UV-Vis. Este dispositivo óptico tiene la función de separar la luz incidente en sus
distintas longitudes de onda, permitiendo analizar la composición espectral de la luz
emitida por una fuente (Montalvo,2014). De esta manera, el monocromador
contribuye a la precisión y fiabilidad de las mediciones al proporcionar una
distribución precisa de las longitudes de onda.
En síntesis, la espectroscopia UV-Vis emerge como una herramienta poderosa en
la investigación científica y el análisis de compuestos químicos. Al aprovechar la
interacción entre la luz y la materia, esta técnica ofrece una ventana única para
explorar la estructura y concentración de sustancias, abriendo nuevas posibilidades
en campos tan diversos como la química, bioquímica y ciencias ambientales.
OBJETIVO
El objetivo de este estudio es investigar la relación entre la absorbancia de una
solución y la concentración de un soluto, utilizando la Ley de Beer-Lambert como
base teórica. Se pretende determinar si la absorbancia medida a una longitud de
onda específica puede ser utilizada como una medida precisa de la concentración
de un soluto en una solución, y evaluar la validez de la Ley de Beer-Lambert en
diferentes condiciones experimentales.
HIPÓTESIS
Basándonos en la Ley de Beer-Lambert, hipotetizamos que existe una relación lineal
entre la absorbancia de una solución y la concentración del soluto presente en esa
solución. Específicamente, esperamos que a medida que aumenta la concentración
del soluto, la absorbancia medida también aumentará de manera proporcional, de
acuerdo con la expresión matemática de la Ley de Beer-Lambert. Además,
anticipamos que esta relación será válida en una variedad de condiciones
experimentales, como diferentes longitudes de onda de luz, solventes y
concentraciones de soluto.
METODOLOGIA
Se pesará aproximadamente 0.5g de la muestra de suelo y vegetal en una balanza
digital para ser depositado en un recipiente de vidrio, completamente limpio, se
filtrará.No se requiere conservantes especiales para almacenar la muestra. El
tiempo de retención de la muestra será de 48h, Para realizar la determinación de
fosforo total por el método del ácido ascórbico se tendrá en cuenta los criterios de
análisis descritos por el método de la NOM-OZT-Recnat-2000 SEMARNAT. Las
soluciones de la curva de calibrado serán preparadas a partir de una solución madre
mediante dilución con agua ultrapura hasta 100mL de volumen final. Las curvas se
harán con 3 o más estándares hasta cubrir el rango de linealidad y deben ser
reevaluadas de acuerdo con la frecuencia del análisis. Cabe resaltar que los
estándares de trabajo y calibración se prepararán en un rango entre 0,200 y
1,200mg/L 𝑃 − 𝑃𝑂3 −4 . Además, se contará con un reactivo combinado, el reactivo
combinado se debe preparar utilizando 50 mL de ácido sulfúrico 5N, 5 mL de tartrato
de antimonio y potasio, 15 mL de molibdato de amonio y 30 mL de ácido ascórbico.
Se transferirán 100mL de muestra a un Erlenmeyer de 250mL para una digestión
con ácido sulfúrico concentrado y ácido nítrico concentrado hasta reducir el volumen
a 1mL aproximadamente, se dejará reposar y se suministrará 20 mL de aguas
destilada, seguida de una gota de fenolftaleína y NaOH 6N para lograr un ligero tinte
rosa. Filtrar si es necesario para eliminar las partículas o la turbidez y añadiendo los
lavados del filtro al matraz, así, se ajustará nuevamente el volumen de muestra a
50mL con agua destilada. Posteriormente, adicionar solución de ácido sulfúrico 5N
gota a gota hasta que desaparezca el tinte rosa, finalmente se añadirá reactivo
combinado. Se procederá a medir la absorbancia de cada muestra a 450nm, con
blanco reactivo como referencia.
El molibdato amónico y el tartrato antimonílico potásico reaccionan en medio ácido
con ortofosfato para formar un ácido heteropoliácido fosfomolíbdico que se reduce
a azul de molibdeno, de color intenso que es reducido por el ácido ascórbico (Baird,
R., & Bridgewater, 2017).
La presencia de turbidez y color en la muestra debe corregirse elaborando un
blanco. Si la turbidez es muy alta y es necesario filtrar la muestra, ésta debe hacerse
sólo después de la digestión. Las muestras con bajas concentraciones de fósforo
no se deben almacenar en botellas plásticas a menos que se congelen, debido a
que los fosfatos se pueden adsorber en las paredes plásticas.
MATERIALES
• Erlenmeyer de 250 mL • Matraz volumétrico, 500mL
• Probeta de 100mL. • Matraz volumétrico, 1000mL
• Probeta de 50mL. • Pipeta graduada de 5mL
• Matraz volumétrico. • Pipeta graduada 10mL
• Matraz volumétrico, 250mL.
REACTIVOS
• Antimonio (III) y potasio oxido tartrato hemihidrato (𝐾(𝑆𝑏𝑂)𝐶4𝐻4𝑂6 ∗ 0,5𝐻2𝑂) 38
• Molibdato amónico 4-hidratado[(𝑁𝐻4) 6𝑀𝑂7𝑂24. 4𝐻2𝑂]
• Ácido ascórbico (𝐶6𝐻8𝑂6)
• Fenolftaleína (𝐶20𝐻14𝑂6)
• Solución estándar de fosforo total de 75,0mg/L 𝑃 − 𝑃𝑂4(𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙)
• Hidróxido de sodio (𝑁𝑎𝑂𝐻)
• Ácido sulfúrico concentrado (𝐻2𝑆𝑂4)
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Linealidad e intervalo lineal Para la determinación del intervalo lineal se evaluaron
una serie de estándares de concentraciones desde
0.’00,2.00,4.00,8.00,12.00,16.00 mg P/L fósforo total (Anexo A, Tabla A1), las
lecturas de estos estándares se realizaron para la elaboración de la gráfica de
linealidad, que permitió determinar el intervalo de trabajo o curva de calibrado para
el método analítico.
CURVA DE CALIBRACION
Date: 13/02/2024 Time: [Link] a.m.
Instrument: PerkinElmer Lambda 25 Serial No: 101N3101804
Method: vegetal
Ordinate mode: Single wavelength
Baseline: No correction ( 0.00 0.00 )
ANALISIS DE DATOS
____________________________________________________________________________
Wavelength(s) Sample ID Concentration Ord. value Comment
____________________________________________________________________________
470.0 0.0 0.A01 0.0000 mg/l 0.0001
470.0 0.0 STD1.A02 2.0000 mg/l 0.0366
470.0 0.0 STD2.A03 4.0000 mg/l 0.0738
470.0 0.0 STD3.A04 8.0000 mg/l 0.1522
470.0 0.0 STD4.A05 12.000 mg/l 0.2243
470.0 0.0 STD5.A06 16.000 mg/l 0.2971
____________________________________________________________________________
Ecuación: y = 1.480351e-04 + 1.864695e-02 * x
Residual error: 0.001718
Correlation coefficient: 0.999911
CURVA DE CALIBRACION
0.35
0.3 y = 1.480351ex + 1.864695e*x
R² = 0.9998
0.25
absorbancia
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Concentracion
Grafico [Link] de calibración.
La ecuación correspondiente a la recta de la forma 𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏 para la curva
resultante fue: 𝑌 = 1.480351𝑥 + 1.86469 a dicha ecuación se le calculó la desviación
estándar de la pendiente y de la ordenada en el origen.
LOS RESULTADOS OBTENIDOS FUERON:
Desviación estándar de la Pendiente: 0.0852±0.05
Ordenada en el origen: 1.86469.
Para garantizar que el intervalo lineal no presenta valores atípicos, se recalcularon
las concentraciones corregidas a partir de la ecuación de la recta para la curva de
calibrado resultante, se evaluaron las curvas de calibrado desarrolladas durante los
3 días para evaluar si se encuentra dentro de los criterios de aceptación. Los
resultados están dentro de los criterios de aceptación del laboratorio los cuales
indican que para el LC estándar bajo, medio y alto son (±50%, ±20%, ±10%)
respectivamente. A partir de la gráfica correspondiente a la curva de calibrado
resultante obtenida se pudo determinar que esta mantiene la linealidad en el
intervalo de concentración comprendido. Además, se obtuvo que el coeficiente de
correlación es r=0,999.
CONTRASTE DE GRUBBS PARA LA CURVA DE CALIBRADO.
Para la existencia de datos anómalos se plantea:
Hipótesis nula H0: no hay existencia de datos anómalos
Hipótesis alterna H1: hay existencia de datos anómalos
TEST-STUDENT
para linealidad de la curva de calibrado Se procedió a realizar una evaluación
estadística de prueba t-Student, como mejor indicador de modelo lineal, para ello,
se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con un valor crítico
de t para el nivel de confianza requerido (α=0.05), dos-colas, en este caso para un
‘’n’’ que depende de los niveles de calibración. Se desea probar si existe entonces
una correlación significativa y se plantea: Hipótesis nula H0 es que no existe
correlación entre X e Y: 𝜇0 = 0 Hipótesis alterna H1 es que existe correlación entre
X e Y: 𝜇1 ≠ 0 Los resultados obtenidos fueron:
Tabla [Link] 3. T-Student para linealidad de la curva de calibrado.
Tobservado Tcritico
t-Student (n-2) de 95% de confianza y
17.37 2.776
α=0,05
El cálculo del T-observado se halló y comparado con su T-crítico de tabla (Anexo A,
A0). Como el 𝑡𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 > 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜, se rechaza la hipótesis nula H0, concluyendo
que existe una correlación lineal entre X con respecto Y.
RESULTADOS OCTENIDOS DE MUESTRAS DE SUELO Y FOLIAR.
Determinacion de fosforo en suelo
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
ABS
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6 8 10
Concentracion
Tabla [Link] y absorbancias de muestras de suelo y vegetal.
Los datos mostraron linealidad debido a la calibración del equipo, al igual se
calcularon las concentraciones de fosforo en el análisis foliar.
CONCLUSION
Se validó la metodología analítica de la NOM-OZT-Recnat-2000 SEMARNAT
(Método del ácido ascórbico) y 4500-P B4 (Digestión ácido sulfúrico – ácido nítrico)
descrito en él Standard Métodos edición 23 para la determinación de Fósforo total
en muestras de suelos
El método analítico cumplió con los parámetros establecidos a evaluar y criterios
planteados en el control de calidad analítico del laboratorio, adicionalmente, se
verificó que estos cumplieran con los criterios establecidos para porcentajes de
precisión y desviación estándar relativa.
De acuerdo a los resultados obtenidos en el proceso de validación de los métodos
analíticos para la determinación fósforo total, se confirma que el método puede ser
aplicado a las matrices de suelos y vegetales, además se articula con el sistema de
calidad analítica del Laboratorio, criterios de aceptación de la norma garantizando
la efectividad de los resultados que se obtendrán para las diferentes muestras que
se analicen en el Laboratorio.
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