Laboratorio de Fundamentos de Biología Celular y Molecular
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Introducción
La amplificación (aumento del número de copias) de un fragmento determinado
de ADN puede llevarse a cabo mediante métodos como la inserción de la secuencia en
una célula bacteriana, que al multiplicarse repetidamente dará como resultado
millones de copias de ese fragmento. Kary Mullis desarrolló en 1983 una técnica
mucho más eficiente denominada PCR (Polymerase Chain Reaction), capaz de
generar en pocas horas billones de copias de una secuencia a partir de una
pequeña cantidad de ADN.
La PCR es una reacción bioquímica in vitro en la que un par de primers (también
conocidos como iniciadores o cebadores) flanquean a la región a amplificar, se unen a
las cadenas sencillas del ADN para elongar el resto de la secuencia objetivo con la
ayuda de la Taq polimerasa. Cada ciclo de la reacción involucra tres pasos
principales: desnaturalización de dobles cadenas de ADN, anillaje o hibridación de
primers y elongación. En el primer paso, la temperatura es elevada, a
aproximadamente 94°C, para permitir la separación completa de la doble hebra de
ADN. En el segundo paso denominado anillaje, se disminuye la temperatura
dependiendo de la temperatura melting de los primers, el rango varía entre 50-68°C,
donde las hebras de ADN se asocian con los primers específicos de la región de
interés. Cada primer anilla específica y separadamente en el extremo 3’ de la
secuencia deseada, un solo primer anilla por cadena sencilla de ADN. Durante el tercer
paso, la Taq polimerasa (extraída de la bacteria termofílica Thermus aquaticus), a
72°C, se vale del primer para sintetizar la cadena complementaria a la secuencia
deseada, dando como resultado dos moléculas que contienen una copia del fragmento
de interés y una secuencia flanqueante a esta región.
A medida que el número de ciclos aumenta, la cantidad de copias que contienen
únicamente el fragmento esperado se eleva exponencialmente permitiendo
obtener un alto número de copias de la secuencia deseada a partir de una mezcla de
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ADN.
Figura1. Esquema del mecanismo de la PCR. Ver video:
[Link]
Esta técnica se ha empleado en métodos que buscan identificar la presencia de una
secuencia específica, como una mutación determinada en el genoma de un
paciente o la presencia de un agente patógeno en una muestra de cualquier origen,
esto gracias a la capacidad de la PCR para aislar una secuencia de una mezcla
compleja de moléculas.
En esta práctica, trabajaremos con el ADN extraído previamente y realizaremos la
amplificación de la región del gen alpha-actin-3 humano. Este gen es de importancia
en el rendimiento deportivo ya que se han asociado diferentes polimorfismos con un
mejor desempeño en diferentes ejercicios. Por ejemplo, el gen wildtype, que tiene una
arginina (R) en la posición 557, se ha reportado como un gen indicador de mejor
desempeño en actividades que requieren de contracciones enérgicas como en la
carrera de velocidad y el levantamiento de pesas. Por otro lado, el polimorfismo
R557X, en el cual se cambia la arginina por un codón de parada, se ha reportado como
un posible indicador de mejor desempeño en actividades de resistencia.
Objetivos.
1. Comprender el fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
2. Amplificar un fragmento de ADN del gen alpha-actin-3 de humano y visualizar el
producto de amplificación en un gel de agarosa.
3. Entender y adquirir habilidad en la programación y uso del termociclador.
Materiales y Métodos.
1. Realizar la mezcla “Master Mix” de los reactivos en un tubo eppendorf (como lo
indica la
Tabla 1).
Reactivo Conc. Conc. Volumen MasterMix para 4
Inicial Final (sin ADN, reacciones
22µL)
Agua PCR - - 14.80 µL 59.2 µL
Buffer 10x 1x 2.5µL 10µL
MgCl2 50mM 1.25mM 0.75µL 3µL
dNTPs 10mM 0.2mM 0.5µL 2µL
Primer F 10µM 0.5µM 1.25µL 5µL
Primer R 10µM 0.5µM 1.25µL 5µL
Primer F 10µM 0.125µ 0.3125µL 1.25µL
interno M
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Primer R 10µM 0.25µM 0.625µL 2.5µL
interno
Taq 5U 2.5U - 0.4µL
ADN - - 3µL -
2. Mezclar la reacción de PCR por pipeteo, muy suavemente y sin generar burbujas
3. Agregar 22µl de la mezcla “Master Mix” a 3 tubos eppendorf. Agregar a 2 de los
tubos, 3µl del ADN extraído la clase pasada.
4. Realizar un control negativo de la reacción, agregando 3μl de agua ultrapura al
tubo restante (en lugar de ADN).
5. Llevar al termociclador para correr la reacción bajo el perfil térmico elegido.
Ciclo elegido:
N. Ciclos Temperatura Tiempo
1X 94°C 3 min
94°C 30 segundos
35X
68°C 30 segundos
72°C 90 segundos
1X 72°C 10 min
1X 4°C ∞
Bibliografía:
Varela Pineda, A y Cadavid Sánchez, I. (2018). Amplificación de fragmentos de ADN mediante
la reacción en cadena de la polimerasa clásica. Sello Editorial Tecnológico de Antioquia.
