IDENTIFICAICIÓN GEN 16S RNA RIBOSOMAL

Estudiantes:
Edinson Murcia Riaño
Carlos Andres Varon Garcia
Yury Astrid Acero Alvarez
Carlos Parra Gonzalez

Docente:

Viviana Ramos Rueda

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)

PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
BOGOTÁ D.C, 2024
 1. Objetivo Laboratorio N° 1

Esta práctica fue realizada con el objetivo principal de familiarizarse con metodologías
utilizadas para la extracción de ADN genómico, en este caso de bacterias. utilizando un
cultivo de bacterias de [Link] (Escherichia coli) y así afianzar los conocimeintos teóricos
vistos en clase.

1.1 Fundamento de la técnica

Durante la ejecución de esta prueba, se busca poderaplicar la extracción del ADN de la

cepa bacteriana Escherichia Coli por medio de la aplicación de diversos pasos que
permitirán comenzar a desintegrar el estado en el que se encuentra la célula, liberando
como producto final el genoma.

De este modo, la aplicabilidad de los diversos pasos está orientados a comenzar

desnaturalizar la integridad de la cepa bacteriana de estudio, con el fin de poder
obtener un genoma puro, no obstante, debido a que por baja disponibilidad de tiempos
y percances evidenciados en la práctica, la purificación del genoma extraído no es
posible realizarlo por lo que, es muy probable que el ADN no sea de una pureza
aceptable.

Nombre del Microorganismo: Escherichia coli

 2. Extracción de ADN
2.1 Extracción Cloroformo-alcohol isoamílico

Inicio

Prepare una suspensión bacteriana en 180 uL de

solución salina al 0,085%, en un tubo Eppendorf de
1,5, Mezcle en vortex.. Lleve el tubo a ebullición por 15 minutos.
Centrifugue durante 5

minutos a temperatura ambiente

Tome el sobrenadante y transfiéralo a un tubo

Eppendorf nuevo, adicione 800 l de la solución de
cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) , mezcle en el
vortex ocasionalmente durante 5 minutos.
Centrifugue por 10 minutos y Recupere el
sobrenadante y transfiéralo a otro Eppendorf
nuevo.
Mezcle ocasionalmente en el vortex por 5 minutos

Adicione 250 μl de isopropanol frío, Mezcle por

Al tubo de Eppendorf nuevo con el sobrenadante inversión durante 5 minutos, Deje en reposo
agregue 250 μl de acetato de sodio 3M frío, durante 5 minutos para precipitar el ADN
Mezcle por inversión durante 30 segundos

Centrifugue durante 3 minutos, descarte el sobrenadante con

Centrifugue durante 5 minutos y descarte el sobrenadante
pipeta y deje el tubo abierto al aire hasta que se evapore el etanol
y adicione 250 l de etanol absoluto desprenda el
al lado del mechero.
sedimento con el vortex (repita 2 veces más)

Mezcle continuamente por inversión durante 1

minuto. Realice una dilución 1/100 con el ADN suspendido para hacer
mediciones de absorbancia a 260, 280 y 320nm con el objetivo
de determinar pureza y concentración del ADN extraído
Adicione e 50 μl de agua destilada estéril para
suspender el ADN, mezcle y almacene a 4˚C durante
una hora

Fin
 2.2 Extracción QIAamp DNA Mini Kit

Inicio

Recolectar las cepas del cultivo de [Link] y

agregarlas en un tubo Eppendorf
Adicionar en el tubo 180 μL de buffer ATL, y 20 μL
de proteinasa y mezcle, Incubar a 56˚C durante 1
Hora

Adicionar 200 μL del buffer universal BD

mezclar en el vortex incubar a 70 °C durante
10 minutos Adicionar 200 μL de etanol mezclar en el
vortex durante 10 minutos

Trasferir la mezcla incluido cualquier precipitado a la

columna Spin Column-Pure, colocarla en un tubo de
recolección de 2 mL y centrifugar durante 1 minuto, Agregar 500 μL de la solucio PW univeral
desechar el líquido restante diluida y centrifugar durante 1 minuto,
desechar el líquido restante

Centrifugar la columna vacía durante 2 minutos para

eliminar etanol residual de la membrana de la columna
Agregar 50 μL del tapón CE directamente en el
desechar el líquido que se haya filtrado y trasferir la
centro de la membrana de la columna e incubar a
columna a un tubo de centrifugación limpio
temperatura ambiente durante 1 minuto,
centrifugar por 1 minuto para eluir el ADN

FIN
3. Determinación de la concentración y pureza
3.1 Preparación de la muestra
• Diluir una alícuota de 10 μL de con 990 μL de agua destilada estéril (dilución 1/100).
Mezclar el ADN gentilmente subiendo y bajando con una pipeta. Esperar a que las
burbujas se aclaren.
• Utilizar agua destilada estéril en la celda de referencia (en blanco).
• Medir la absorbancia a 320 nm, 280 nm y 260 nm.
• Calcularlos valores de A280 y A260 corregidos sustrayéndola absorbancia a 320 nm
(A320) de los valores de A280 y A260.
• Concentración de ADN en ng/μL = A260 corregido × 10 (factor de dilución) × 50
(factor de conversión).
• Cociente A260/A280: Dividir el A260 corregido por el A280 corregido.

Los valores de lectura se relacionan en la siguiente tabla.

Metodología Abs 260 nm Abs 280 nm Abs 320 nm
Cloroformo-alcohol 0.022 0.017 0.009
KIT 0.060 0.042 0.019

CALCULOS DE LECTURA DE ADN

(ADN) (0,022-0,009) x 100 x 50 = 65 ug/ml
Cociente: 260/280 Corregido
(0,022 – 0,009 ) / (0,017- 0,009) = 1,6
EVALUACION DE PUREZA
Cociente: 260/280 = 0,022 / 0,017 = 1.3
 Los resultados que se esperaban obtener eran los siguientes:

Tabla 1. Criterios de validez para verificación de laextracción de ADN

Con la metodología aplicada no se encontró obteneruna cantidad de concentración de ADN

en la muestraestudiada.

El anterior resultado se puede deber a errores durante las etapas del laboratorio, centrifugado,
pipeteadola fase de extracción, contaminacióndel ADN, o degradación del ADN

4. Conclusión
El Método de Cloroformo-alcohol resultó en una concentración de ADN de (1,3 ) pero con una
pureza suficiente para obtener resultados positivos en PCR. A pesar de la posible contaminación
con compuestos aromáticos, la eficacia del ADN en aplicaciones posteriores fue satisfactoria.
No se pudo establecer la extracción de ADN debidoa que no hubo resultados de absorbancias al
analizar por espectrofotometría, debido a los factores anteriormente mencionados.

El Método QIAamp DNA Mini Kit produjo una concentración de ADN mayor (1,6 ) pero con
una pureza no tan buena, sugiriendo contaminación con ARN. La menor pureza podría deberse
a un manejo inadecuado de las micropipetas automáticas durante la preparación, afectando
negativamente su efectividad en PCR y otras aplicaciones.
[Link] Laboratorio N° 2

Amplificar y crear copias de fragmentos de ADN basándose en el tamaño con procesos de

clonación y mutación por técnicas determinadas como la PCR y electroforesis basadas en
biología molecular.

Fundamento de la técnica

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain
Reaction) es, una técnica muy importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que
permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN)
a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias
proteínas para sintetizar dos nuevas hebrasde ADN a partir de otra que funciona como molde.
En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. Lasíntesis de nuevas
cadenas de ADN se llevaa cabo mezclando: el ADN que contiene el olos fragmentos que se van
a amplificar; la polimerasa; los iniciadores (fragmento de ADN de 15-30 nucleótidos que
flanquean la región a amplificar y que aportan el extremo 3’ libre para que inicie la
transcripción); desoxinucleótidos (dNTPs); cloruro de magnesio (MgCl2) u otro co-factor
necesario para que trabaje la polimerasa y una solución amortiguadora que mantenga el pH
apropiado para que se lleve a cabo la síntesis.[1].
Para lograr una adecuada amplificación por PCR, se debe asegurar una extracción y
purificación correcta del ADN que proporcione resultados confiables y rápidos para su
utilización en el diagnóstico y la caracterización. [2].

La PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN mediante el

calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94 y 96 °C para romper los puentes de
hidrógeno que las unían, de esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de
una nueva cadena complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se
alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios de las cadenas sencillas de la
región que se va a amplificar, para queesto suceda se baja la temperatura entre 40y 60 °C lo
que permite la unión(alineamiento) de los iniciadores. Finalmente, se sintetiza una nueva
cadena en sentido 5’ a 3’ para lo cual se incrementala temperatura, por lo general a 72 °C,
porque es la temperatura óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los iniciadores y
comienza la replicación. Estas tres etapas:

1) Desnaturalización
2) Alineamiento
3) Extensión del ADN

La electroforesis en geles es utilizada para separar fragmentos de ADN yARN en función de

su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el
 contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración
y grado de entereza. La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar
y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución. Losgeles
de agarosa tienen un poder de resolución bajo, porque no permiten separarmoléculas de
ADN que difieren en tamaño

6. Reacción en cadena de la polimerasa PCR

6.1 Metodología

INICIO

REALIZAR LA LIMPIEZA DEL MESON CON ALCOLHOL

Realizar los cálculos según la muestra procesar,

incluyendo las reacciones del control positivo y negativo
de PCR, teniendo en cuenta los volúmenes y las
concentraciones de la tabla 1
Programar el termociclador con un ciclo de
desnaturalización a 95°C por 40 segundos, 58°C por 40
segundos y un ciclo final de extensión de 72°C por 1
minuto

FIN

6.2 Tabla 1
6.3 Cálculos

7. Tamaño del producto de PCR (Deben buscar el gen 16S RNA Ribosomal de la cepa
ATCC 25922 en formato FASTA y realizar una PCR insilico como en el taller)
7.1 Gen
Gen: Gen de E. coli (ATCC 25922) para el ARNr 16S
7.2 Tamaño
1452 pb

7.3 Iniciadores

16S rDNA – F= TCCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rDNA – R= GGACTACCAGGGTATCTAATCC
7.4 Tamaño del producto
467 pb
 8. Digestión y electroforesis
Metodología
INICIO

En un tubo eppendorf Adicionar

ADN: 1 µL del producto de PCR – del ADN de E. Coli extraído con Cloroformo

Buffer: 2 µL NEBuffer 10X

Enzima de restricción: 1 µL HindIII –HF R3104S

Agua destilada estéril: 16 µL

En otro tubo eppendorf, realice el mismo procedimiento,

pero modificando ADN: 1 1 µL del producto de PCR – del ADN
de E. Coli extraído con Kit Lleve los tubos a Vortex y centrifuge

Incubación: Termociclador:
En el Termociclador realice la incubación a 37°C por Para detener la reacción, proceda a
15 min inactivar a 80°C por 20 min

FIN
 9. Electroforesis
Metodología

Inicio

Preparar gel de agarosa al 1,5%.

Se toma con 0,75 g de agarosa y se lleva a un
Erlenmeyer se adicione agua fría y se mezcla

Lleve la solución a una plancha de calentamiento

estar pendiente que la solución de agarosa hierva
Agitar constantemente hasta que la solución este
transparente y sin grumos, se adiciona colorante
para controlar la migración de ADN

Vertir la solución de agarosa ya fria en la placa y Dejar enfriar por unos minutos
permita que se solidifique por 30 minutos

Colocar el gel en la cámara y verter la solución

Buffer que conducirá la carga eléctrica

Preparar cada tubo adicionando intercalante,

llevar a Vortex y centrifugar
Sembrar en el gel 2 µL, iniciando con el marcador
de 100 pb, el control positivo, las muestras de PCR
Cloroformo, los dos productos de la digestión (PCR
–Cloroformo y PCR – Kit) y control negativo

Permitir que corra hacia el polo positivo, por 45

min y 80 V, luego prender la luz UV y tomar
registro de los resultados

FIN
Imagen: Resultado de la ELECTROFORESIS.

La PCR es una técnica aparentemente sencilla y fácilde hacer. El problema es que no siempre es así. La
reacción de PCR es muy sensible a cambios de iones,temperaturas, contaminantes que pueden estar en el
ADN o en el agua, por lo cual es difícil establecerpor qué no se amplifican los fragmentos de ADN.
 Análisis de resultados y discusión de losresultados obtenidos

El carril correspondiente a la muestra de este grupo , en donde no se dio presenciade la banda

de amplificación, estopudo haberse dado desde la extracción del ADNal no realizarse de una
manera adecuada o en lamezcla y preparación de las muestras, si nuestro PCR no generó
bandas en ninguna de las muestras, puede suponerse que el error radica en que se presento
algún fallo durante los procesos ejecutados agregar algún ingrediente o bien quelos ciclos de
temperatura no se llevaron a cabo adecuadamente, ya sea por problemas del equipo o por un
error al elegir el programa de amplificación, ya que una PCR sin control positivo no funciona,
muchas veces cuando no sale una PCR el problema está en el ADN, que puede estar
contaminado con proteínas o alguna sustancia que inhibe la reacción de PCR.

Es muy frecuente que las PCRs se contaminen. Para monitorearlo, siempre hay que trabajar
conun control negativo: un tubo extra al que se le agreguen todos los reactivos utilizados en
el PCR, excepto ADN. Si en esta muestra hay amplificación significa que en algún reactivo
hayrestos de ADN o de producto de PCR que está contaminando. Sinembargo los controles
negativos montados indicaron que no hubo presencia de contaminación en la PCR, ya que
no se presentaron bandas en los carriles de los controles negativos, indicando que en los
reactivos no había presencia o restos de ADN.

10. Conclusiones
• Mediante esta práctica de laboratorio logramos comprender, que existen mecanismos que
permiten lograr la identificación de genes, en este caso el ARN 16s, existen regiones
especificas que sirven como huellas moleculares únicas para las especies bacterianas.
• Gracias a la técnica de PCR podemos obtener unfragmento de ADN de interés en grandes
cantidades y en poco tiempo, para que esta técnica sea viable es necesario el uso de
primers, estos tienen como fundamento copiar lassecuencias de ADN específicas.

• Se determinó que las muestras, controles positivos y controles negativos no se

encontraban contaminados, debido a que no se generaron bandas en los carriles
correspondientes a los controles negativos.

• Es posible concluir que no se dio la amplificaciónde los fragmentos de ADN para las
muestras y controles positivos de MecA por diversos factoresque influyen en que una
PCR se de bien, como lo son fallas en la adición de reactivos, la extracción del ADN, las
temperaturas y los ciclosdel termociclador.

• Es importante tener una adecuada relación en cuanto a las concentraciones de los

reactivos adicionados para la realización de la reacción encadena de la polimerasa, ya
que amentos o disminuciones en estas pueden influir en que nose dé la amplificación de
 los fragmentos de ADN.

• Se concluye que los reactivos usados en la PCR tienen funciones específicas durante el
desarrollo de la técnica. La Taq polimerasa lee el código de ADN y luego une los
nucleótidos paracrear las copias de ADN. La DNTPs ayuda a crearlos millones de copias
del fragmento específico
• de ADN. El buffer de PCR que nos ayuda a desnaturalizar la proteína y mantener
estable elADN. El MgCl2 el cual funciona como cofactor para la actividad enzimática
y por último el ADNque se quiere amplificar.

• Se logró establecer que hubo fallas en la realización de la técnica de PCR porque los
controles positivos del gen nuc si presentaron bandas de amplificación en el gel de
agarosa y por el contrario los controles positivos para el gen MecA no.

• Mediante la electroforesis en gel de agarosa se determina verídicamente el tamaño de

un fragmento de ADN o la separación de cromosomas enteros.

• Las dos técnicas PCR y electroforesis se complementan y van de la mano. A partir de

la PCR se puede realizar la amplificación de diversos fragmentos de ADN de interés
queposteriormente se van a llevar a la electroforesisen gel de agarosa para interpretar
los resultados obtenidos de la PCR identificando así los fragmentos mediante los
ultravioleta, la secuencia de esta técnica permite llegar a el análisis de diversas
muestras con múltiples objetivos de investigación.

11. BIBLIOGRAFIA

[1]. PCR: reacción en cadena de la polimerasa Alejandra Serrato Díaz1, Lluvia Flores Rentería2,
Jaime Aportela Cortez3 y Edgar Sierra Palacios4 [Link]
s/pdf/[Link] - Universidad Autónoma Nacional de México.
[2]. Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología:
aspectos teóricos y prácticos, 27.
[3]. Electroforesis de ADN Francisco Fierro Fierro1
[Link] - Universidad Autónoma
Metropolitana – Unidad Iztapalapa (México).
[4] Miguel Reyes, J. L. H. (210d. C.). Reacción en cadena de la Polimerasa. En Fundamentos
de la Biotecnología genómica (p. 278).