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Materiales, Reactivos y Aparatos e instrumentos.............................................................1

Materiales............................................................................................................ 1
Reactivos............................................................................................................. 2
Aparatos e instrumentos.............................................................................................. 2
Metodología............................................................................................................... 2
Preparación de la dilución primaria................................................................................ 2
Preparación del medio de cultivo.........................................................................3
Preparación de las diluciones decimales adicionales.......................................................3
Inoculación........................................................................................................... 3
Procedimiento de siembra con imágenes.......................................................................5
Procedimiento de preparación del agar..........................................................................7
Resultados................................................................................................................ 8
Conclusión.............................................................................................................. 11

Materiales, Reactivos y Aparatos e instrumentos

Materiales
1. Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1
ml y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas
en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
2. Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
3. Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
4. Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos,
pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo
estudio deberán esterilizarse mediante:

 Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o

 Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que
cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de
vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente
inerte.
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la
neutralidad.
Medio de Cultivo.
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).
FORMULA

INGREDIENTES CANTIDADES
Extracto de levadura 2,5 g
Triptona 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Tabla 1:Ingredientes de Agar Triptona-Extracto de Levadura

Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con
termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ±
0,5°C.
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
Metodología
A partir de muestras líquidas: Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche,
refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o
fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
Preparación de la dilución primaria.
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de
trabajo).
Distribuir la solución de trabajo en 99 ml en un recipiente, 90 ml en un recipiente, 45 ml
en cinco recipientes y realizar el blanco de agua destilada.
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada
suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo, la fase acuosa de
grasas animales y vegetales).
Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30
cm efectuados en un tiempo de 7 segundos.
Preparación del medio de cultivo.
Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta
total disolución.
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml,
cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en
autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a
25ºC.
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de
agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de
fundirse más de una vez.
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en
particular se requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir
la técnica para ese alimento.
Preparación de las diluciones decimales adicionales.
Pesar 10 gr de la muestra y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a
una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
A partir de esta preparación se realizan las diluciones de los diluyentes anteriormente
esterilizados
Al diluyente de 99 ml se le agrega 1 ml de la preparación del 90 ml del diluyente
(llevado a 100 ml después de agregar la muestra), se agita hasta homogenizar.
Del diluyente de 99 ml después de homogenizar pasar 5 ml a una dilución de 45 ml
agitar hasta homogenizar, repetir este procedimiento con los 4 diluyentes restantes de
45 ml.

Inoculación
Tomar 1 ml de cada una de las diluciones ya con el medio a estudiar y se realiza
duplicado.
De la preparación de 99 ml, se toma 1 ml de la preparación, se introduce en una caja
Petri estéril, coloca 15 ml del agar liquido antes de solidificar a temperaturas
semejantes, y se replica. Mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6
en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante,
sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar
solidificar
De la preparación de 45 ml, se toma 1 ml de la preparación se introduce en una caja
Petri estéril, coloca 15 ml del agar liquido antes de solidificar a temperaturas
semejantes, y se replica. mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6
en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante,
sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del
inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar
solidificar.
Replicar este procedimiento con todas las muestras.
Preparar el blanco, se coloca 15 ml de agar solamente.
Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que
se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de
la capacidad total de la pipeta.
Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su
capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la
caja Petri sin líquido. Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe
apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo
cual este último debe inclinarse lo necesario. En estudios donde se busca la presencia
o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es
necesario preparar diluciones mayores.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20
minutos.
Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la
temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se
trate.

Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubación

Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC 48 ± 2 h
Mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC 48 ± 2 h
Psicrotróficos 20 ± 2ºC 3 - 5 días
Psicrofílicos 5 ± 2ºC 7 - 10 días
Tabla 2: Grupos Bacterianos
Procedimiento de siembra con imágenes

Agregar el agua de Chía a estudiar

al frasco estéril y a temperatura
ambiente

Ilustración 1: Toma de muestra

El pesado de 10 gr de agua de Chía al

frasco de 90 ml

Ilustración 2: Pesado de la muestra

De la preparación principal. Se toma 1

ml y se pasa a la dilución 99, se agita
hasta homogenizar y tomamos 5 ml
para pasarlos a uno de los frascos de
45 ml, se agita y se toman 5 ml que se
pasan al siguiente frasco de 45 y se
repite el procedimiento con el resto de
Ilustración 3: Diluciones los frascos restantes

Se toma 1 ml de cada una de las

diluciones en cajas Petri y se realiza
duplicado de cada una.
Ilustración 4: Siembra

Se toma 15 ml de agar para vaciar en

cada caja Petri.

Ilustración 5: Toma de agar

Se vacía los 15 ml de agar a cada caja

Petri.

Ilustración 6: Vaciado del agar

 Se dejan solidificar los agares
preparados con la siembre para
posteriormente llevarlo a la incubadora

Ilustración 7: Cultivos

Procedimiento de preparación del agar

Se vacía los 5.85 gr de agar cuenta

estandar en 250 ml de agua destilada

Ilustración 8: Agar cuenta estandar

Se coloca el agar junto con el agua

destilada en la parrilla eléctrica y con el
calor de la parrilla se disuelva el agar.

Ilustración 9: Disolución
 Se meten los agares a esterilizar para su uso pleno
posteriormente.

Ilustración 10: Esterilización de agares

Resultados
Placas sin colonias. - Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,
reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja
usada (Secretaría de Salud, 1995).

Dilución 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000 1:10000000

Repetición 0 58 6 26 43 40
1

Repetición 0 77 17 15 76 10
2
Tabla 3: Repeticiones de siembra

Dilución Colonia Factor dilución UFC/ml

s

1:1000 58 1000 58 × 1000 = 58,000

1:10000 6 10,000 6 × 10,000 = 60,000

1:100000 26 100,000 26 × 100,000 = 2,600,000

1:1000000 43 1,000,000 43 × 1,000,000 = 43,000,000

1:10000000 40 10,000,000 40 × 10,000,000 = 400,000,000

Tabla 4: Repetición1

Dilución Coloni Factor UFC/ml

as dilución
 1:1000 77 1000 77 × 1000 = 77,000

1:10000 17 10,000 17 × 10,000 = 170,000

1:10000 15 100,000 15 × 100,000 =

0 1,500,000

1:10000 76 1,000,000 76 × 1,000,000 =

00 76,000,000

1:10000 10 10,000,000 10 × 10,000,000 =

000 100,000,000
Tabla 5:Repetición 2

Solo estas diluciones tienen conteos válidos según criterios estándar:

 1:1000 en ambas repeticiones (58 y 77 colonias)
 1:100000 repetición 1 (26 colonias) está justo fuera del rango inferior
Promedio de UFC/ml usando datos válidos (1:1000):
 Repetición 1: 58,000
 Repetición 2: 77,000
58000+77000 2135 000
Promedio= = =67,5000 UFC /ml
2 2

Tabla 11: cultivos -1

Tabla 12: cultivos -2

Tabla 13: cultivos -3

Tabla 14: cultivos -4

Tabla 16: cultivo -5

Tabla 16: cultivos -6

Tabla 17: Blanco

Conclusión
Pese de que si hubo colonias y en algunas dilusiones son colonias
considerables el resultado de la practica se descarta debido a que el blanco
se contamino con un hongo, este hongo lo presentan tres cajas petri incluido
el blanco.

Esto quiere decir que hubo un mal manejo de la siembra o los materiales en
el momento de sembrar

Lo que confirma esta teoría es que la dilución (-1) está completamente libre
de colonias u hongos esta es la primera dilución preparada de la muestra
principal ya preparada con los 90 ml. Lo cual nos indica que posiblemente
alguno de los frascos se contamino después de (-1) y la contaminación se
corrió al resto de los frascos por ende también a las cajas petri y a sus
duplicados.

Y que algunos cultivos como el (-2) o (-5) tienen mayor crecimiento de

colonias que el resto de los cultivos como lo son (-1), (-3), (-4) y (-6).

REFERENCIA

Secretaría de Salud. (1995). NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método

para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Diario Oficial de la Federación.
[Link]

SITA

(Secretaría de Salud, 1995) NOM92