UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE
FAUSTINO SANCHEZ CARRION
Escuela profesional: Biologia con mencion en
biotecnologia
Extraccion de acidos nucleicos
Anthony Cortez Lázaro
2025
Recomendaciones para trabajar con las técnicas de biología molecular
Usar guantes, mascarillas, guardapolvo (estéril)
Contaminación cruzada y y RNasas/DNAsas
Preparación del espacio de trabajo
Controles y validaciones ( positivo- negativo y
reproducibilidad)
Ética y bioseguridad
Muestras biológicas
Colecta de muestra
1. Toma de muestra de suelo asociado a la rizosfera
de cultivos de caña de azucar.
EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS
La extraccion de acidos nucleicos es, en la mayoria de casos la primera
etapa de los ensayos en biologia molecular
Los métodos de extracción de ácidos nucleicos permiten obtener material
purificado y de alta calidad para análisis posteriores
El método de extracción de ácidos nucleicos que se elije depende de :
El acido nucleico diana : ADN o ARN
Organismos fuente: bacterias, plantas, hongos, etc
Material inicial: tejido, sangre, suelo, agua, etc
Uso posterior: PCR, clonaje, Secuenciamiento, etc
LISIS CELULAR Metodos fisicos, quimicos y/o enzimatico
Objetivo: romper la pared celular y
menbrana celulares
METODOS
Fisicos Quimicos Enzimatico
Sonificacion Detergentes (SDS, CTAB) Lizozima
Homogenizacion Nitrogeno liquido Proteinasa K y otras
proteasas
Shock termico
Shock osmotico
PURIFICACION Eliminacion de los lipidos de membrana,
proteinas y ARN
METODOS
Quimicos Cromatografia, Enzimatico
matrices, perlas
Solventes orgánicos Cromatografia de ARNasas
(fenol, cloroformo-alcohol intercambio ionico
isoamílico 24-24:1) (aniionico)
Matrices de silica
CTAB
Matrices de celulosa
Perlas magneticas
Obtención final del acido nucleico: precipitación,
RECUPERACION elución desde la membrana, etc.
CTAB
EXTRACCION DE DNA
CUANTIFICACION DE DNA
PCR
ELECTROFORESIS
PCR Reacción en cadena de
The history of PCR
la polimerasa
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Es la amplificación de fragmentos deseados
de ADN, con el propósito de amplificar
este fragmento a niveles que puedan ser
detectables.
Componentes:
• Polimerasa
• Primers
• dNTPs
• MgCl+2
• Buffer
• ADN molde
¿Es importante el diseño de
primers?
Es uno de los más pasos más importantes que me aseguran una buena PCR.
Primers inespecíficos que anclen en otra zona no deseada.
Diseño de primers en PCR
Largo del amplicón 80 a 250 bp para PCR en Tiempo real. En
la PCR convencional el amplicón usualmente es de mayor tamaño.
Concentración de primer entre 50 a 500nM. Una
concentración final de 200nM es efectiva para la mayoría
de reacciones.
Si es posible el extremo 3’ debe ser rico en GC (GC clamp)
Largo del primers de 18 a 24 dnt
50% de GC en tiempo real y se recomienda de 40% a 60%
en PCR convencional.
Evitar tener más de 3 nucleótidos iguales seguidos por ejemplo GGGG
Diseño de primers en PCR
Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión
“Tm” cercanos, dentro de los 5 °C.
La secuencia de los primers debe iniciarse y terminarse con 1
o 2 bases púricas (A, G).
Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras
secundarias internas.
Usar la energía libre de Gibs como parámetro.
El par de primers debe diferir en largo en menos de 3bp
Código IUPAC
Coadyuvantes e inhibidores de PCR
Concentración de Mg+2: ayuda a la polimerasa. Muchos de los componentes de
la reacción se unen a este, como EDTA o Citrato,
dNTP’s y proteínas. Como resultado, se puede ver afectada la cantidad de Mg++
libre presente en la reacción. El exceso de Mg++ disminuye la fidelidad de la
enzima y puede incrementar el nivel de amplificación no
específica.
DMSO: Altas cantidades incrementan la eficiencia de la amplificación y la
especificidad de la reacción (5-10 % v/v). Pero dependerá del fragmento a
amplificar. Se usa para fragmentos con gran contenido de GC ya que se une a los
residuos de citosina y baja la Tm.
BSA: Arriba de 0.8μg/μl incrementa la eficiencia de la
PCR, mejor que el DMSO o glicerol.
EJERCICIO
En el laboratorio, se requiere amplificar mediante PCR una
proteina de la bacteria Proteus mirabilis (GenBank PMI2722)
Diseñar los primers usando el programa SnapGene
