6.
MUESTRAS DE SEMEN
6.1. INTRODUCCIÓN:
El uso de estas muestras es:
1. Estudios de infertilidad
Una evaluación andrológica completa del varón infértil incluye:
-Historia clínica
-Exploración física y seminograma
-Pruebas complementarias: pruebas de función espermática, determinaciones
hormonales, ecografía escrotal, transrectal y análisis de orina postorgasmo.
2. Estudios ante sospecha de delito sexual, se emplea en laboratorios médico-
legales
3. Para peticiones judiciales en casos de demanda de paternidad.
6.2. CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN
Las principales son:
-Volumen del eyaculado: 3ml ( 1,5-6ml)
-pH: 7,2- 9
-Composición: . Celulas (10%)
. Plasma seminal ( 90%)
. Secreciones de: vesículas seminales, próstata, epidídimo, conducto
deferente, y glándulas anexas.
El volumen y propiedades del esperma varían según su procedencia:
-Secreciones o fracción prostática 30%: zinc, citrato, fosfatasa ácida, sustancias ácidas.
-Secreciones epididimarias 5%: carnitina
-Secreciones de vesículas seminales 65%: fructosa, secreción alcalina ( sustancias
alcalinas)
Durante la eyaculación se mezclan las diferentes fracciones:
Primera fracción: secreciones prostáticas y secreción epididimaria
Segunda fracción: secreciones de las vesículas seminales.
6.3. RECOGIDA Y TRASPORTE
-Hay que decirle a la persona que debe mantener una abstinencia mínima de 72horas y
una máxima de 7 días ( 3-4 días).
-Antes de la toma, hay que lavar el pene con jabón y agua abundante.
-Tiene que masturbarse y verter el eyaculado en un bote de vidrio o plástico color
topacio.
-Si ha usado preservativos, tienen que estar libre de espermicida.
-No vale que intente la extracción del líquido seminal con coitus interruptus ni si hay un
volumen incompleto.
-Se tiene que transportar protegido de la luz y con una temperatura que no sea ni fría ni
caliente (protegido de temperaturas extremas). Y debe estar bien rotulado.
-El estudio se tiene que realizar como mucho pasado una hora tras obtención.
6.4. RECEPCIÓN DE LA MUESTRA Y CUESTIONARIO
Al llegar la muestra hay que identificarla, hay que rellenar un cuestionario al paciente,
hay que apuntar los datos del paciente, los datos de solicitud y la hoja de trabajo del
laboratorio.
Cuestionario del paciente:
• Hora de recogida de la muestra
• Días de abstinencia sexual
• Si ha recogido por completo el volumen eyaculado( si se ha perdido volumen la
muestra no vale para estudio diagnóstico)
• Si los tres últimos meses ha tenido fiebre
• Motivo por el cual solicita el análisis del semen
• Si le han hecho otros análisis de semen con anterioridad.
6.5. SECUENCIA TEMPORAL EN EL ANÁLISIS BÁSICO DE SEMEN
Desde los primeros 5 minutos:
• Se registra la muestra
• Se pesa
• Se etiqueta el recipiente
Entre los 20 y 25 minutos:
• Se comprueba el aspecto que tiene
• Se comprueba la licuefacción
Hasta los 30 minutos:
• Se evalúa la viscosidad
• Se hace un análisis en fresco ( en la preparación se evalúa movilidad,
aglutinación, otras células y detritus)
• Realizar prueba de anticuerpos
• Se preparan extensiones y se tiñen para evaluar movilidad y vitalidad
• Se hacen diluciones que son necesarias para determinar la concentración
espermática
• Separación en alícuotas para evaluar si hay células inflamatorias
• Se hacen extensiones para examen citomorfológico
• Se separa y se centrifuga el semen para estudios bioquímicos
Y además se comprueban los siguientes parámetros de normalidad:
Volúmen ≥ 1.5 ml
pH ≥ 7.2
Recuento ≥ 15 M/ml
Motilidad ≥ 32 % motilidad progresiva
Vitalidad ≥ 58 % formas vivas
Morfología ≥ 4 % formas naturales (C. estricto Kruger)
Bioquímica: Ácido cítrico: ≥ 52 μmol/eyaculado
Fructuosa: ≥ 13 μmol/eyaculado
Más tarde de los 30 minutos:
• Se meten los espermatozoides en una cámara de Neubauer mejorada para
contarlos. Lo que se observa en la cámara son entre 6 y 400 especímenes.
Hay que realizar dilución.
• Hay que determinar si hay inflamación: células inflamatorias (cuando hay en
los recuentos celulares más de 5. 106 células redondas por ml de semen y
más de 106 leucocitos/ml).
• Realizar determinaciones bioquímicas relacionadas con la contribución
glandular secretora
• Teñir las extensiones para estudios morfológicos ( recuento diferencial)
• Identificar otras células( glóbulos rojos, células epiteliales, células redondas),
microorganismos, detritus.
• Es importante catalogar las muestras azoospérmicas.
Los valores normales de un seminograma son:
El volumen es mayor de 2 para ser normal, el mínimo que se acepta en el laboratorio es
1,5ml.
• Normozoospermia: significa que el semen cumple con los valores de normalidad
establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
• Hipospermia: volumen de semen por debajo de 2 ml.
• Hiperespermia: volumen por encima de 6 ml.
• Azoospermia: ausencia de espermatozoides en el semen.
• Oligozoospermia: cuando el semen presenta menos de 15 millones de
espermatozoides por mililitro de eyaculado.
• Astenozoospermia: disminución del número de espermatozoides móviles
progresivos (por debajo del 32 %).
• Necrozoospermia: disminución en el porcentaje de espermatozoides vivos (por
debajo del 58 %).
• Teratozoospermia: disminución en el porcentaje de espermatozoides con
morfología normal (por debajo del 4%).
6.6. ESTUDIOS:
6.6.1 Vitalidad espermática
Afecta a la calidad del semen y a su capacidad fecundante. No se hace en todos los casos,
solo cuando más del 40% de los espermatozoides de una muestra no se mueven.
Se tienen en cuenta los siguientes criterios para realizar el estudio de vitalidad:
• Cuando la movilidad espermática es menor del 50%: hay unos 200
espermatozoides inmóviles (40-50%).
• Se mira la membrana plasmática del espermatozoide y se mira cómo está, tras
teñirla con colorantes supravitales (eosina):
▪ Si están vivos, no se van a teñir la primera vez, y la segunda vez van a aparecer
negros. Si se añade negrosina, si están vivos aparecen blancos
▪ Si están muertos, con la primera tinción se tiñen de rojo, con la segunda de
amarillo, y si se añade negrosina se vuelve rojo otra vez.
• Hay que estudiar también la capacidad de responder a cambios osmóticos de la
membrana del espermatozoide, si responde a cambios osmóticos o no.
Se considera vitalidad normal si:
▪ <75% de los espermatozoides no están teñidos
▪ Si cuando se mira por los cambios osmóticos aparecen más del 60% de los
espermatozoides hinchados.
6.6.2. Morfología espermática
Se considera que el semen es normal cuando tiene menos del 30% de formas anormales.
Es importante la morfología al permitir atravesar las barreras vaginales.
Si hay formas anormales pueden ser por problemas en el desarrollo embrionario o por
una gran cantidad de radicales libres que provocan teratozoospermia.
La morfología anormal altera la capacidad del espermatozoide de atravesar la barrera
vaginal.
Se estudia con la tinción de Papanicolau y con la Diff-Quick.
Los criterios de normalidad y recomendaciones son los siguientes:
.La cabeza normal tiene que ser oval, de largo entre 4-5 micras, y de ancho entre 2,5-3,5
micras. Donde está el acrosoma, esa parte tiene que estar bien definida, se tiene que
poder ver bien entre el 40-70% de los casos.
.La pieza intermedia tiene que ser delgada, el ancho tiene que ser menor de 1 micra, el
largo tiene que tener una longitud de 1,5 veces la cabeza, y ha de haber gotas de restos
citoplasmáticos( 1/3)
.La cola normal, tiene que estar recta, ser uniforme, y medir de largo 45 micras.
Recomendaciones según la OMS para ver la morfología:
• Usar un ocular con micrómetro
• Si aparecen cabezas solas no se tienen en cuenta
• SI hay menos de un 15% de formas normales, la tasa de fertilización in vitro va
a disminuir mucho
6.6.3. Examen macroscópico
El semen que acaba de ser eyaculado aparece como un coágulo muy viscoso, opaco,
blanco grisáceo, con un olor característico a mohos (moho-acre)
De 10 a 20 minutos el coágulo se licua, se separa y aparece un líquido translúcido, turbio,
viscoso y ligeramente alcalino (7,7), si hay mucha secreción prostática, los pH pueden
ser más bajos (7).
Hay que fijarse en varios parámetros en este examen:
• Tiempo de licuefacción: A 37ºC está entre 20-25 minutos. Pueden aparecer
partículas de gel y filamentos mucosos.
• Aspecto: nacarado o gris opalescente
• pH: se pone una gota en una tira reactiva, de 6,1-10
• Viscosidad: observando con la rapidez que sale de la pipeta, lo normal, gota a
gota
• Volumen: entre 2-9ml
• Filancia: el filamento debe de ser igual o menor a 1cm
6.6.4. Movilidad espermática
Se valora observando varios campos seleccionados al azar, con el objetivo seco más
potente hasta contar un total de 200 espermatozoides.
Pasos:
-Dividiendo el espécimen y señalando campos
-Se mira con el objetivo de más aumentos
-La suma total de todos los campos tiene que dar al menos 200 espermatozoides
Se mide bien, ya que puede decirnos si es de calidad y si tiene capacidad fecundante:
. La cola tiene que hacer batidos, al menos 10 batidos, en sentido anteroposterior y
progresivo.
Se clasifica esta motilidad (en función de los batidos y la progresión):
• Tipo A: progresión rápida
• Tipo B: progresan de forma lenta
• Tipo C: se mueven y no progresan
• Tipo D: cuando están inmóviles
Un semen es normal cuando el 50% de los espermatozoides tienen una movilidad tipo
A + B. o si más del 25% de los espermatozoides tiene una movilidad tipo A.
6.6.5. Aglutinación y agregación espermática
Aglutinación: adherencia de los espermatozoides entre sí, sin que exista otras células
(detritus) a su alrededor, cuando hay aglutinación, son espermatozoides móviles.
A veces, se produce agregación, los espermatozoides se unen pero no se mueven, y
aparecen otras células en los cúmulos (células epiteliales y detritus).
6.6.6. Concentración espermática
Después de la licuefacción del semen pueden contarse los espermatozoides, según las
siguientes especificaciones:
.Suele estar entre los 15-200 millones por mililitro (normal)
.La OMS dice que pueden estar entre los 20 millones por ml o 40 millones por
eyaculado como normal
.Se realizan dos extensiones y se tiñen con una técnica llamada panóptica rápida
6.6.7. Marcadores bioquímicos
Se usan para localizar trastornos del tracto genital en función de su disminución,
dependiendo de la localización se valoran unos parámetros u otros:
• Para ver el funcionamiento del epidídimo, se valora la α-1,4-glucosidasa neutra
y la ele carnitina( L- carnitina)
• Para el funcionamiento de las vesículas seminales: fructosa
• Para la próstata: fosfatasa ácida, citrato y zinc
6.6.8 Cultivo de semen
Hay que hacer una comparación de los resultados del cultivo del semen y valorarlo en
conjunto con los resultados de cultivos de orina , la secreción prostática y con el frotis
uretral.
Se considera positivo el cultivo si aparece de una sola bacteria de más de 1000
(UCF)unidades formadoras de colonias.
Está indicado cultivo en:
• En caso de hipospermia,
• En caso de hemospermia
• Cuando hay alteraciones de la licuación
• Cuando hay leucocitospermia
• Cuando se producen aglutinaciones espontáneas
• En las alteraciones de movilidad de los espermatozoides
(oligo/asteno/teratozoospermia)
• Cuando descienden los marcadores prostáticos, de las vesículas seminales y
del epidídimo.
• Cuando hay antecedentes de infecciones urogenitales.
• Cuando aparece en el frotis uretral infección por Clamidia trachomatis.
Cuando hacemos un cultivo de semen podemos encontrar: Haemophilus ssp, Neisseria
gonorreae, Enterobacterias, Pseudomona aeruginosa, Estafilococos, Estreptococos;
protozoos como la Gardnerella vagilallis , Tricomona vaginalis; hongos como Cándid,;y
diferentes anaerobios.
Tinciones:
1. Tinción de Papanicolau
La tinción de Papanicolaou es un examen basado en la coloración de smears (frotis o
muestra) en general (vaginal, cervical, prostático,semen), o para fluídos corporales
(peritoneal, pleural, gástrico, urinario, espinal, etc.).
Colorantes empleados: existen varias soluciones de Papanicolaou, pero todas son
variantes de los siguientes colorantes:
Hematoxilina de Harris (EA50, EA65,EA36)
Naranja G
Eosina
Resultado de las tinciones celulares:
núcleos—————————————en azul
células acidófilas————————–rojo a naranja
células basófilas—————————verde o azul verdoso
células o fragmentos de tejido impregnados de sangre—-naranja o naranja verdoso
Uso principal:
Como prueba para la detección del cáncer cervico-uterino, se toma una muestra de
células del epitelio del cuello uterino y se extienden en una lámina de vidrio que es
la que se colorea con Papanicolaou.
Tinción negativa————————–resultados normales
Tinción positiva—————————resultados alterados
Una tinción positiva puede ser índice de:
Inflamación (por diferentes causas)
Signos tempranos de cáncer (displasia)
Signos de cáncer más avanzado que se extiende más allá del cuello uterino:
Cáncer avanzado
La tinción de Papanicolaou es una prueba fiable. Requiere de experiencia en la
interpretación de los resultados, pero en los smears cervicales, el porcentaje de
aciertos es muy elevado. Esta prueba ha ayudado a disminuir drásticamente el
número de mujeres que mueren por causa de cáncer cervical. En nuestro país
el Programa de detección de cáncer cervico-uterino con las pruebas citológicas
periódicas ha ayudado extraordinariamente a reducir esta enfermedad.
Con la tinción de Papanicolaou en los smears y también en los cortes histológicos con
HE aparecen células con determinadas caracteristicas (célula grande, con núcleo
rechazado a la periferia, de bordes irregulares, citoplasma claro, con una vacuola
central, que generalmente es de glucógeno), a las que se les denominó, desde hace
tiempo, coilocitos, cuyo significado se desconocía y que hoy se sabe, están infectadas
por papilomavirus de diferentes tipos. Algunos tipos de ese virus, se saben están
relacionados con las lesiones precancerosas de las mucosas cubiertas por epitelios
estratificados planos, como es el caso del cervix.
coilocitos
2. Tinción Diff-Quick
[Link]
Es una técnica de tinción rápida utilizada en la microscopía para teñir células y
tejidos en muestras histológicas. Se utiliza principalmente en la evaluación rápida de
muestras de citología y puede proporcionar resultados en unos pocos minutos.
El kit de tinción Diff-Quik consta de tres soluciones diferentes: la solución 1, la
solución 2 y la solución 3. Cada solución tiene una función específica en el proceso
de tinción. La solución 1 contiene una mezcla de etanol y éter, que se utiliza para
fijar la muestra al portaobjetos. La solución 2 contiene eosina y azul de metileno, que
se utilizan para teñir las estructuras celulares básicas, como los núcleos y los
citoplasmas. La solución 3 contiene alcohol isopropílico y acetona, que se utilizan
para eliminar el exceso de tinción y preparar la muestra para la observación.
Para utilizar el kit de tinción, siga los siguientes pasos:
1. Coloque la muestra en un portaobjetos limpio y seco.
2. Añada unas gotas de la solución 1 en la muestra y déjela reposar durante unos
segundos para fijar la muestra.
3. Lave la muestra suavemente con agua corriente y séquela con una toalla de papel.
4. Añada unas gotas de la solución 2 en la muestra y déjela reposar durante unos
segundos para teñir las células y los tejidos.
5. Lave la muestra suavemente con agua corriente y séquela con una toalla de papel.
6. Añada unas gotas de la solución 3 en la muestra y déjela reposar durante unos
segundos para eliminar el exceso de tinción.
7. Lave la muestra suavemente con agua corriente y séquela con una toalla de papel.
8. Observe la muestra con un microscopio de luz.
Es importante tener en cuenta que la técnica de tinción Diff-Quik es una técnica de
tinción rápida que puede proporcionar resultados en unos pocos minutos, pero
también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, la técnica no es tan efectiva como
otras técnicas de tinción más complejas para la visualización de ciertas estructuras
celulares específicas. Sin embargo, es una técnica útil para la evaluación rápida de
muestras de citología y es ampliamente utilizada en la práctica clínica.
3. Panóptico rápido
La tinción de panóptico rápido es un método de tinción diferencial que permite la
observación de las células sanguíneas y esperma. Debido a la interacción entre los
colorantes se pueden diferenciar los núcleos y los gránulos de color violeta. Se trata
de una modificación de la tinción de Romanowsky, dando un procedimiento basado
en inmersiones mucho más rápido.
La tinción de panóptico rápido es un método de tinción diferencial que permite la
observación de las células sanguíneas. Debido a la interacción entre los colorantes
se pueden diferenciar los núcleos y los gránulos de color violeta. Se trata de una
modificación de la tinción de Romanowsky, dando un procedimiento basado en
inmersiones mucho más rápido.
Reactivos
• Solución 1: Alcohólica de triarilmetano
• Solución 2: Tamponada de xanteno
• Solución 3: Tamponada de tiazina
• Aceite de inmersión
Panóptico Reactivos Tamaño Envase
Panóptico Nº1 Fijador verde Envase de 1 Litro
Panóptico Nº2 Eosina Rápida Envase de 1 Litro
Panóptico Nº3 Azul Rápido
Los reactivos almacenados a temperatura ambiente (15-25ºC) y protegidos de la luz
son estables hasta la fecha de caducidad indicada. A temperaturas inferiores a 15ºC
puede precipitar el colorante en este caso será necesario filtrar.
Precauciones
La solución fijadora contiene metanol por lo que es inflamable y tóxico por inhalación
e ingestión.
Eliminar los residuos según la normativa legal vigente.
Técnica
– Preparar la extensión de sangre en el portaobjetos y dejar secar al aire.
– Preparar 3 cubetas con cada colorante.
– Sumergir 5 veces durante 1 segundo cada una el portaobjetos en la cubeta con el
reactivo 1. Escurrir el exceso de colorante.
– Sumergir 5 veces durante 1 segundo cada una el portaobjetos en la cubeta con la
solución de reactivo 2.
– Sumergir 5 veces durante 1 segundo cada una el portaobjetos en la cubeta con la
solución de reactivo 3.
– Lavar con agua destilada y dejar secar.
– Observar al microscopio.
Resultados
Eritrocitos: color rosa pálido.
Plaquetas: color violeta claro.
Neutrófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta claro con gránulos violeta
oscuro.
Basófilos: núcleo violeta oscuro, gránulos violeta oscuro.
Eosinófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta con gránulos rojizos- violeta.
Linfocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.
Monocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.
Notas sobre el uso
El número de inmersiones en las cubetas de los colorantes 2 y 3 puede ser modificado
si se pretende aumentar las coloraciones rosas o violetas.
Guardar las cubetas del reactivo 1 tapadas ya que se puede producir la evaporación
del reactivo y dar errores en la tinción.
VITROCONGELACIÓN
La vitrificación es una técnica de congelación ultrarrápida basada en la utilización de
unas sustancias llamadas crioprotectores, que protegen a las células, y una velocidad de
enfriamiento muy elevada. Con esto, se evita la formación de cristales en el interior de
las células, los cuales dañarían las estructuras internas y provocarían la muerte celular.
Gracias a ella, se pueden preservar los embriones para su uso posterior.
Los embriones permanecen congelados a -196 °C en tanques de nitrógeno líquido hasta
que la mujer o la pareja decida utilizarlos. Pueden conservarse durante un tiempo
indefinido sin perder las características que tenían en el momento de la vitrificación. Así,
los embriones se pueden utilizar meses o años después para buscar un embarazo.
Estos embriones no pueden sobrevivir más de 6 días en cultivo. Por tanto, será necesario
criopreservarlos hasta decidir cuál va a ser su destino.
En concreto, los motivos principales para vitrificar embriones son los siguientes:
• No ha sido posible realizar la transferencia embrionaria en el mismo ciclo de
estimulación. Por ejemplo, cuando la mujer tiene riesgo de sufrir el síndrome de la
hiperestimulación ovárica o cuando el endometrio no ha engrosado lo suficiente y no
está receptivo.
• Se ha realizado la transferencia embrionaria en fresco, pero quedan embriones
sobrantes que pueden transferirse en próximos Intentos, ya sea por haber obtenido un
negativo o para tener un segundo hijo en el futuro.
• Preservación de la fertilidad. Algunas parejas deciden congelar embriones en lugar de
óvulos y semen por separado.
• Se ha hecho una biopsia a los embriones para hacer un DGP, pero hay que esperar
varios días a los resultados.
• Durante una ovodonación si no se ha podido sincronizar a la donante con la receptora
de óvulos. En este caso, es posible congelar los óvulos donados o los embriones después
de su fecundación.
• Hay embriones sobrantes de un ciclo y la pareja o mujer decide donarlos a otras
personas con problemas de infertilidad.
La vitrificación de embriones ha permitido optimizar los tratamientos de FIV al máximo.
Gracias a esto, en lo últimos años ha aumentado la tasa deembarazo acumulada, es
decir, la tasa de embarazo por punción con un solo ciclo de estimulación ovárica.
TÉCNICA
Para llevar a cabo el proceso de vitrificación con éxito, es necesario que el personal del
laboratorio tenga mucha experiencia, ya que es una técnica complicada que debe
hacerse respetando unos tiempos muy cortos.
El método más habitual de vitrificación es el Cryotop de la marcaKitazato. A
continuación, vamos a enumerar los pasos generales de la técnica:
1. Deshidratar los embriones pasándolos de un medio a otro con una concentración
creciente de crioprotectores.
2. Colocar con mucho cuidado los embriones encima del sistema de soporte para su
congelación que, en el caso del Cryotop, es una pajuela.
3. Introducir la pajuela con los embriones en una cubeta pequeña con nitrógeno líquido.
4. Colocar la tapa o capuchón a la pajuela con la precaución de no alejarla de los vapores
del nitrógeno líquido.
5. Por último, guardar la pajuela cargada con los embriones dentro del tanque de
nitrógeno líquido para su conservación.
Durante todo este proceso, se consigue que los embriones pasen de la temperatura de
cultivo (37 °C) a la temperatura de congelación en nitrógeno líquido (-196 °C) en tan solo
unos segundos.
Por otra parte, es importante tener en cuenta que los embriones deben tener una
calidad mínima para poder resistir los procesos de congelación y descongelación. Por
tanto, aquellos embriones que no se desarrollen bien o que presenten signos de
degeneración no se vitrifican.
Los crioprotectores son unas moléculas que sustituyen el líquido acuoso del interior de
las células embrionarias y que protegen sus estructuras internas de las bajas
temperaturas
Desvitrificación de embriones
El proceso de desvitrificación es más rápido y sencillo que el anterior.
Simplemente, hay que sacar la pajuela con los embriones del nitrógeno líquido, sacar la
tapa e introducirla directamente en un medio a 37 °C.
Con la ayuda de la pipeta se despegan los embriones de la pajuela tirándoles medio de
cultivo encima. A continuación, se van pasando los embriones por varios medios con
concentraciones decrecientes de crioprotectores. Así se consigue la rehidratación
celular, de forma que se van reemplazando los crioprotectores por agua.
Es muy importante respetar los tiempos del protocolo de desvitrificación para hacerlo
correctamente, ya que de lo contrario podrían dañarse las estructuras celulares del
embrión y no sobrevivir.
Antes de hacer una transferencia de embriones congelados, es imprescindible
desvitrificarlos unas horas antes y observar si han logrado sobrevivir.
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